男性免疫性不育患者外周血T細(xì)胞亞型分布

張曉霞，魏任雄，周　俊，婁江濤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波市中醫(yī)院男性科實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315012)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：242- 246

免疫因素是WHO男性不育標(biāo)準(zhǔn)化病因分類診斷之一，男性免疫性不育作為器官特異性自身免疫性疾病，體內(nèi)可能存在免疫系統(tǒng)的功能紊亂。T輔助細(xì)胞(T helper cell，Th細(xì)胞)是免疫細(xì)胞分化的重要組成部分，Th1/Th2分化平衡，對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有重要意義[1]。體內(nèi)Th1或Th2細(xì)胞失衡與糖尿病、心血管疾病及支氣管哮喘等多種疾病有關(guān)[2- 4]。目前，Th細(xì)胞失衡與免疫性男性不育是否有關(guān)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，男性免疫性不育異常的免疫細(xì)胞分化和免疫應(yīng)答機(jī)制尚不明確。本研究主要通過(guò)觀察免疫性不育患者外周血T細(xì)胞分化情況及Th1和Th2細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素- 4(interleukin- 4，IL- 4)在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，探索男性免疫性不育患者機(jī)體的免疫狀態(tài)。

資料與方法

對(duì)象

收集2014年4月至2015年4月來(lái)寧波市中醫(yī)院男科就診的免疫性不育患者40例，入選標(biāo)準(zhǔn)參照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)[5]：性及射精功能正常，在至少一份精液標(biāo)本中，混合抗球蛋白反應(yīng)試驗(yàn)(mixed antiglobulin reaction，MAR)或免疫珠試驗(yàn)有不少于50%活動(dòng)精子表面被覆抗體。所有患者均排除泌尿系統(tǒng)感染，年齡22～47歲，平均(31.2±6.5)歲，夫妻性生活正常，未采取任何避孕措施1年以上未使女方懷孕，女方均經(jīng)婦科檢查排除不孕因素。所有患者均為初診，未經(jīng)治療。另外選擇妻子懷孕待產(chǎn)生育力正常的健康男性20例為對(duì)照組，年齡22～35歲，平均(27.1±13.9)歲。所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

主要試劑和儀器

熒光定量PCR儀Mx3000P型 (美國(guó)Stratagene公司)，普通PCR儀(德國(guó)Roche公司)，溶血儀(Beckman公司)，總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa公司)，TaqDNA聚合酶(上海Fermentas公司)，dNTP(上海Fermentas公司)，Universal Master Mix(Applied Biosystems)，熒光抗體CD3-PE-CY5、CD4-FITC、CD8-PE均購(gòu)自Beckman公司。

標(biāo)本采集

所有受試者均空腹采集外周血4 ml，用EDTA抗凝。0.5 ml全血用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，剩余全血采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，用于提取基因組RNA。

T淋巴細(xì)胞細(xì)胞亞群檢測(cè)

取EDTA抗凝外周血0.5 ml，加入5 μl三色熒光抗體CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE，室溫避光孵育15 min，置溶血儀中溶血，然后加入2 ml PBS洗滌后棄上清。用500 μl PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

RT-PCR檢測(cè)IFN-γ和IL4的基因表達(dá)

RNA提?。翰捎肨rizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因組RNA，具體按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。經(jīng)DU800紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值1.8～2.0，提示無(wú)DNA及蛋白質(zhì)污染。

逆轉(zhuǎn)錄：取11 μl RNA模板樣品，加入1 μl 0.5 μg/μl Oligo(dT)18，總反應(yīng)體系20 μl，具體操作嚴(yán)格按cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

IFN-γ mRNA擴(kuò)增：根據(jù)Genebank所收錄的IFN-γ mRNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-TTTTGGGTTCTC TTGGCTGTT-3′,下游引物5′-CTCCTTTTTCGCTTCCCT GT-3′。20 μl PCR反應(yīng)體系中含有上游引物900 nmol/L，下游引物300 nmol/L，cDNA 2 μl，Universal Master Mix 10 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，再用二步法進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

IL- 4 mRNA擴(kuò)增：根據(jù)Genebank所收錄的IL- 4 mRNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-AATTGCCTCAC ATTGTCACT-3′，下游引物5′-CTCTCATGATCGTCTT TAGCC-3′。PCR反應(yīng)體系和條件同IFN-γ mRNA。

管家基因β-actin：根據(jù)Genebank所收錄的β-actin mRNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-GGCAC CCAGCACAATGAAG-3′，下游引物5′-CGTCATACTC CTGCTTGCTG-3′。PCR反應(yīng)體系和條件同IFN-γ mRNA。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

免疫性不育患者T細(xì)胞亞群

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，免疫性不育患者CD3+T與CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)，免疫性不育者CD4/CD8比值下降并倒置(圖1～3)。

RT-PCR檢測(cè)免疫性不育患者IFN-γmRNA和IL-4mRNA表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，IFN-γ mRNA在免疫性不育組的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；相反，IL- 4 mRNA的表達(dá)量則在免疫性不育組顯著下調(diào)(P<0.05)(表1)。

討　　論

在不育夫婦中，男性因素所致不育約占50%，其中2%～10%的不育癥與免疫因素有關(guān)[6]。目前普遍認(rèn)為男性免疫性不育的主要機(jī)制是血睪屏障異常開(kāi)放或破壞，精母細(xì)胞及精子等與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗精子抗體產(chǎn)生[7]。但是，血清或精漿中的抗精子抗體產(chǎn)生時(shí)機(jī)體免疫細(xì)胞的分化狀態(tài)及免疫應(yīng)答的機(jī)制還不清楚。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了男性免疫性不育患者和正常對(duì)照者的外周血T細(xì)胞分化情況。結(jié)果顯示，免疫性不育患者外周血CD3+T細(xì)胞較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，表明免疫性不育的發(fā)病與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有密切關(guān)系。進(jìn)一步分析T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，免疫性不育者CD4+T/CD8+T比值下降并發(fā)生倒置，提示免疫性不育患者存在T淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)。

圖1免疫性不育組與正常對(duì)照組外周血T細(xì)胞亞群分布百分比散點(diǎn)圖

Fig1The distribution of T lymphocyte subsets in peripheral blood of immune infertility group and normal control group

A：兩組外周血CD3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比比較，P=0.003；B：兩組外周血CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比比較，P=0.000；C：兩組外周血CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比比較，P=0.000；D：兩組外周血CD4+T/CD8+T比值比較，P=0.000

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)男性免疫性不育患者機(jī)體外周血T細(xì)胞亞群分布

Fig2T cell subsets in peripheral blood of male immune infertility patients detected by flow cytometry

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照者機(jī)體外周血T細(xì)胞亞群分布

Fig3T cell subsets in peripheral blood of normal control subjects detected by flow cytometry

分組例數(shù)IFN?γmRNAIL?4mRNA對(duì)照組20462±173705±150免疫性不育組40345±123807±185t27012138P00090037

IFN-γ：γ干擾素；IL- 4：白細(xì)胞介素- 4

Th細(xì)胞在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用，其激活后可分泌細(xì)胞因子。根據(jù)細(xì)胞因子的分泌模式，Th 細(xì)胞主要分為兩類：Th1和Th2。Th1細(xì)胞主要分泌IL- 2、IL- 12、IL- 15、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和IFN-γ等，而Th2細(xì)胞主要分泌IL- 4、IL- 5、IL- 6、IL- 10和IL- 13等[8]。正常情況下，Th1/Th2細(xì)胞因子呈動(dòng)態(tài)平衡，以維護(hù)機(jī)體處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。一旦這種平衡遭到破壞，一方不能有效制約另一方，導(dǎo)致Th細(xì)胞極化，就會(huì)產(chǎn)生免疫紊亂，乃至發(fā)生疾病。多種自身免疫性疾病均涉及Th細(xì)胞極化，Th1/Th2處于失衡狀態(tài)。細(xì)胞因子在男性生殖系統(tǒng)調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮重要作用[9- 11]，與之相聯(lián)系的證據(jù)都表明男性免疫性不育可能同樣涉及Th 極化，使免疫應(yīng)答向Th1細(xì)胞方向偏離，具有促進(jìn)Th1細(xì)胞應(yīng)答、抑制Th2細(xì)胞活性的特點(diǎn)。本研究通過(guò)觀察Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和IL- 4在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況來(lái)分析Th1和Th2細(xì)胞在免疫性不育患者機(jī)體的狀態(tài)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)IFN-γ mRNA和IL- 4 mRNA的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-γ mRNA在免疫性不育組的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯上調(diào)(P<0.05)；相反，IL- 4 mRNA在免疫性不育組的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)，表明Th1細(xì)胞在免疫性不育患者機(jī)體的比例升高，Th2細(xì)胞則下降，說(shuō)明免疫性不育患者機(jī)體確實(shí)存在Th細(xì)胞向Th1方向分化偏移和極化的現(xiàn)象。Th1極化使得Th1細(xì)胞分泌更多的IFN-γ和IL- 2等細(xì)胞因子，IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞分泌更多的IL- 2，同時(shí)上調(diào)IL- 2R在新近激活的CD4+T細(xì)胞及Th1細(xì)胞上的表達(dá)，增加Th1細(xì)胞對(duì)IL- 2的敏感性，從而增加Th1表型細(xì)胞，使T細(xì)胞傾向于1型細(xì)胞因子反應(yīng)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫性不育的發(fā)病可能與T細(xì)胞功能紊亂及其分泌較多的Th1樣細(xì)胞因子有關(guān)。本研究初步研究發(fā)現(xiàn)男性免疫性不育患者的T淋巴細(xì)胞功能紊亂及Th細(xì)胞分化向Th1方向偏移，但免疫性不育的發(fā)病機(jī)制仍有很多尚未明確。隨著免疫性不育研究機(jī)制的不斷深入，勢(shì)必為其治療提供廣闊的前景。

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