Ro52表達(dá)水平下降與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B細(xì)胞異常激活的相關(guān)性

萬(wàn)姝岑，周　煒

(北京大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 北京 100034)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：219- 224

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，B細(xì)胞過(guò)度活化、增殖，產(chǎn)生多種自身抗體是疾病發(fā)生的重要機(jī)制之一[1]。

Ro52是可提取核抗原(extracted nuclear antigens，ENA)的一種，是抗干燥綜合征A針對(duì)的自身抗原之一，因在N端含有RING鋅指-B盒-卷曲螺旋三個(gè)結(jié)構(gòu)域(RING finger domain，B-box domain，coiled coil domain)組成的基序，是三基序(tripartite motif，TRIM)蛋白家族的一員，被稱(chēng)為T(mén)RIM21[2- 3]。抗Ro52與皮膚損害和新生兒心臟傳導(dǎo)阻滯相關(guān)[4- 5]。研究表明Ro52具有E3泛素連接酶活性，并參與細(xì)胞增殖的調(diào)控[6]。泛素是保守的含有76個(gè)氨基酸的小蛋白，真核細(xì)胞通過(guò)泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)以及泛素連接酶(E3)將泛素連接到特定蛋白質(zhì)上的過(guò)程被稱(chēng)為泛素化，是重要的蛋白翻譯后修飾。泛素化不但是細(xì)胞內(nèi)蛋白通過(guò)蛋白酶體降解的信號(hào)，也是調(diào)控蛋白定位與功能的重要機(jī)制之一，參與了淋巴細(xì)胞的激活、免疫耐受誘導(dǎo)等多種免疫反應(yīng)過(guò)程，泛素連接酶的功能異常可以造成自身免疫性疾病的異常免疫反應(yīng)[7- 8]。

作為泛素連接酶，Ro52有可能參與免疫反應(yīng)的調(diào)控。在小鼠B細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)Ro52可抑制淋巴細(xì)胞增殖，并在CD40激活時(shí)增加細(xì)胞的凋亡[6]。為進(jìn)一步探討Ro52是否參與了SLE患者B淋巴細(xì)胞的異常激活，我們通過(guò)CD40與B細(xì)胞受體信號(hào)通路激活SLE患者和健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞中的B淋巴細(xì)胞并檢測(cè)Ro52表達(dá)水平。

材料與方法

對(duì)象

選擇北京大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科隨訪的14例SLE患者，符合美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，男性1例，女性13例，平均年齡(53±27)歲；10名健康的醫(yī)務(wù)人員作為對(duì)照，包括男性1名，女性9名，平均年齡(45±17)歲，與患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究得到北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署了知情同意書(shū)。

使用淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锛夹g(shù)公司)通過(guò)密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。在平底96孔板培養(yǎng)新鮮分離的細(xì)胞，每孔150 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為含5%胎牛血清的RPMI- 1640，其中含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml，2 nmol/L L-谷氨酰胺。使用抗IgM(Jackson Immuno Research)2.5 μg/ml和0.5 μg/ml+抗CD40(abcam B-B20 ab47021)0.2 μg/ml，抗IgG(Jackson ImmunoResearch)2.5 μg/ml和0.5 μg/ml+抗CD40 0.2 μg/ml刺激B細(xì)胞受體誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖；另外還用美洲商陸有絲分裂原(pokeweed mitogen，PWM)1和0.2 μg/ml以及單獨(dú)的抗CD40 1和0.2 μg/ml刺激B細(xì)胞增殖，培養(yǎng)5 d。

細(xì)胞周期測(cè)定

細(xì)胞周期檢測(cè)使用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色流式細(xì)胞儀分析。每例患者每個(gè)刺激條件收集3個(gè)培養(yǎng)孔的細(xì)胞，合并后用1 ml PBS洗兩次，分出0.2 ml 細(xì)胞進(jìn)行定量PCR。在1 ml 80%預(yù)冷乙醇重懸細(xì)胞，加入0.5 ml PI/RNase染色液(BD Pharmingen 550825)，4 ℃避光孵育1 h，用PBS洗兩次后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。G1代表細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，S+G2/M期細(xì)胞代表細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。

Ro52的定量RT-PCR

培養(yǎng)細(xì)胞提取總RNA，通過(guò)隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green PCR Kit(Qiagen)試劑盒，ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystem)進(jìn)行定量PCR。Ro52擴(kuò)增引物，上游5′-GAACTGCTGCAGGAGGTGATAA-3′，下游5′-AGTTCT GGAGAGGTAATATCCAGGTC-3′；GAPDH擴(kuò)增引物，上游5′-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAA-3′，下游5′-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3′[6]。Ro52與內(nèi)參GAPDH的比值為Ro52的相對(duì)表達(dá)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

SLE患者B細(xì)胞受刺激后增殖水平與健康對(duì)照比較

1.6 療效標(biāo)準(zhǔn) 臨床癥候觀察項(xiàng)目為：氣促、發(fā)熱、咳嗽。參照衛(wèi)生部制定的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》和國(guó)家中醫(yī)藥管理局制定的《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索［5-6］，將主要癥狀按輕重程度分為4級(jí)，以3分制積分：正常為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分。

細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞未經(jīng)刺激培養(yǎng)5 d后，S期和G2/M期細(xì)胞為3.0%±1.0%，顯著高于健康對(duì)照的1.8%±0.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在抗CD40(1 μg/ml)，抗IgM(2.5 μg/ml)+抗CD40(0.2 μg/ml)以及小劑量抗IgG(0.5 μg/ml)+抗CD40(0.2 μg/ml)刺激誘導(dǎo)B細(xì)胞活化后，SLE患者細(xì)胞培養(yǎng)第5天檢測(cè)S期和G2/M期細(xì)胞分別為3.6%±0.7%，7.9%±2.5%及5.1%±1.3%，顯著高于健康對(duì)照(2.4%±0.6%，3.7%±1.3%及2.7%±0.5%，P<0.05)(圖1)。

SLE患者Ro52表達(dá)水平與健康對(duì)照比較

SLE患者B細(xì)胞激活后增殖水平顯著高于對(duì)照，相反在未經(jīng)刺激培養(yǎng)5 d的外周血單個(gè)核細(xì)胞以及PWM，抗CD40，抗IgM+抗CD40和抗IgG+抗CD40誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖的細(xì)胞中，SLE患者Ro52表達(dá)水平均顯著低于健康對(duì)照(圖2)。

Ro52表達(dá)水平與B細(xì)胞激活后增殖細(xì)胞的數(shù)量關(guān)系

SLE患者與健康對(duì)照在B細(xì)胞激活后檢測(cè)Ro52表達(dá)水平與增殖細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。將PWM、抗CD40、抗IgM+抗CD40以及抗IgG+抗CD40刺激細(xì)胞后S+G2/M細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與Ro52表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.42，-0.25，-0.49，-0.40，P均<0.05，顯示增殖細(xì)胞中Ro52表達(dá)水平下調(diào)(圖3)。

圖1SLE患者B細(xì)胞增殖水平高于對(duì)照

Fig1B cell proliferation level of SLE patients was higher than that of healthy controls

經(jīng)過(guò)抗CD40，抗IgM+抗CD40以及抗IgG+抗CD40刺激B細(xì)胞增殖后，SLE患者增殖細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組，*P<0.05

抗CD40激活SLE患者B細(xì)胞使Ro52表達(dá)下降與健康對(duì)照比較

SLE患者與健康對(duì)照在B細(xì)胞激活后Ro52 表達(dá)水平均下降，大劑量(1 μg/ml)抗CD40激活B細(xì)胞時(shí)，SLE患者較健康對(duì)照出現(xiàn)更加顯著的Ro52表達(dá)下降(0.62±0.1vs. 1.04±0.2，P=0.04)；其他刺激造成B細(xì)胞激活后Ro52下降的程度，SLE患者與健康對(duì)照差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖2SLE患者Ro52表達(dá)水平低于健康對(duì)照

Fig2Ro52 expression level of SLE patients was lower than that of healthy controls

SLE患者未經(jīng)刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞以及PWM，抗CD40，抗IgM+抗CD40或抗IgG+抗CD40刺激B細(xì)胞增殖后，Ro52表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照，均P<0.05

圖3Ro52表達(dá)水平與B細(xì)胞激活后增殖細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)性分析

Fig3Correlation analysis of Ro52 expression level and proliferating cell number after B cells were activated

當(dāng)PWM，抗CD40，抗IgM+抗CD40以及抗IgG+抗CD40刺激B細(xì)胞增殖后，增殖細(xì)胞百分比(%)與Ro52表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.42，-0.25，-0.49，-0.40，P<0.05

討　　論

實(shí)驗(yàn)選擇使用的抗CD40可以產(chǎn)生類(lèi)似CD40配體的作用，單獨(dú)或聯(lián)合抗IgG/抗IgM激活B細(xì)胞受體，可誘導(dǎo)B細(xì)胞活化。PWM的特異性稍差，但主要作用是誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者B細(xì)胞激活后增殖細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康對(duì)照，而在激活的細(xì)胞中Ro52表達(dá)水平顯著低于對(duì)照。Ro52表達(dá)水平與增殖細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，SLE患者的B細(xì)胞在CD40被激活后Ro52表達(dá)水平的下降程度顯著高于健康對(duì)照。研究結(jié)果提示CD40信號(hào)通路活化使Ro52表達(dá)下調(diào)可能參與了SLE患者B細(xì)胞的異?；罨?。

圖4抗CD40激活B細(xì)胞后，SLE患者Ro52表達(dá)水平的下降顯著高于對(duì)照

Fig4After B cells were activated by anti-CD40, the expression level of Ro52 in SLE patients decreased more significantly than that of healthy controls

Ro52基因敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重皮炎，伴高球蛋白血癥和抗核抗體的出現(xiàn)，提示Ro52有重要的免疫調(diào)控作用[10]。Ro52在B細(xì)胞系A(chǔ)20中過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)變慢并增加細(xì)胞凋亡，提示Ro52具有抑制B細(xì)胞活化的作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ro52依賴(lài)E3泛素連接酶活性，通過(guò)泛素化途徑調(diào)控p27與Bcl- 2的活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖[11]和凋亡[12]。提示本研究發(fā)現(xiàn)的增殖細(xì)胞中Ro52表達(dá)水平的下調(diào)可能是SLE患者B細(xì)胞增殖水平增高的調(diào)控機(jī)制之一。

CD40信號(hào)通路的激活在B細(xì)胞增殖、分化中發(fā)揮重要作用[13- 14]。而CD40信號(hào)通路的異常也參與了SLE的發(fā)病[15]，也有研究試圖抑制CD40信號(hào)傳導(dǎo)治療SLE[16]。本研究發(fā)現(xiàn)刺激CD40可以在SLE患者B細(xì)胞更加顯著地抑制Ro52表達(dá)，因此CD40激活-Ro52表達(dá)下調(diào)-B細(xì)胞增殖增加，這個(gè)調(diào)控機(jī)制在SLE發(fā)病中的作用值得進(jìn)一步研究。

SLE患者B細(xì)胞激活水平顯著高于健康對(duì)照，Ro52表達(dá)水平與B細(xì)胞的增殖水平呈負(fù)相關(guān)，抗CD40激活SLE患者B細(xì)胞后Ro52表達(dá)下調(diào)更加顯著，提示Ro52可能參與了SLE 患者B細(xì)胞異常激活的調(diào)控。Ro52調(diào)控SLE患者B細(xì)胞異常激活的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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