超聲波提取明日葉總黃酮的工藝研究

劉彬++楚冬海

摘要：研究了超聲波提取明日葉總黃酮的最佳工藝。采用正交試驗，以提取物中總黃酮得率為考察指標，優(yōu)化提取工藝。試驗設(shè)計的4因素中，提取時間對結(jié)果有極顯著的影響，乙醇濃度對結(jié)果有顯著的影響，提取功率和料液比對結(jié)果影響不顯著。明日葉總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取時間25 min，乙醇濃度80%，提取功率 60 W，料液比1 g ∶20 mL。按照最佳提取工藝條件提取明日葉中的總黃酮，得率可達1.56%。

關(guān)鍵詞：明日葉；總黃酮；正交試驗；超聲波提取

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0338-02

收稿日期：2015-03-26

基金項目：遼寧省教育廳科研項目（編號：L2014502）。

作者簡介：劉彬（1978—），女，研究方向為制藥工程。

通信作者：楚冬海，研究方向為天然藥物化學(xué)。E-mail：86092904@qq.com。明日葉（Angelica keiskei Koidzumi），屬傘形科（Umbelliferae）多年生草本植物，別稱明日草、長壽草、還陽草，外形酷似芹菜，葉株高50～150 cm，莖圓形，切開有黃色液體，葉互生，三出復(fù)葉，小葉掌狀深裂或淺裂，細鋸齒緣，種植3年后，夏季抽薹開花，花頂生，傘形花序，白色。明日葉性喜涼至溫暖氣候，忌高溫高濕，生長室溫為12～22 ℃[1-2]。明日葉的主要成分有黃酮、香豆素、蛋白質(zhì)、多種維生素及多種礦物元素[3-4]。原產(chǎn)于日本著名健康長壽之鄉(xiāng)八丈島，因其生命力強、生長快，有“今日摘葉，明日又長新芽之勢”，故稱為“明日葉”[5]。

明日葉具有抗人體衰老、抗?jié)?、抗血栓、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖、降膽固醇的作用[6-7]。目前，國內(nèi)對明日葉的開發(fā)尚處于初級階段，對其總黃酮的提取工藝研究尚未見系統(tǒng)報道。在植物總黃酮提取工藝研究方面，與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲波提取具有選擇性高、快速高效、有效成分提取率較高、適于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取等優(yōu)點。本試驗利用超聲波法對明日葉中黃酮的提取進行了研究，為其最佳提取工藝條件提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

明日葉地上部分莖葉（干燥）樣品0.5 kg，由遼寧省本溪市農(nóng)業(yè)技術(shù)中心提供，經(jīng)遼寧科技學(xué)院生藥學(xué)專業(yè)葛會奇副教授鑒定為傘形科芹亞科當歸屬明日葉（Angelica keiskei Koidzmi），粉碎并過80目篩備用。

1.2儀器與試劑

主要儀器：721型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海市亞榮生化儀器廠）、SHZ-D循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市英峪豫華儀器廠）、HH數(shù)顯恒溫電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠）、FW135中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、KQ-300VDB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

試劑：蕓香苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇、AlCl3、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、鹽酸等試劑均為分析純（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.3總黃酮含量測定方法

1.3.1檢測波長的選擇和標準曲線的繪制明日葉中主要有效成分為黃酮類化合物，因此試驗選用蕓香苷為對照品，用1% AlCl3顯色，用分光光度法[8]對總黃酮含量進行測定。

精確量取0.1 mg/mL蕓香苷對照品溶液1.0 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用體積分數(shù)80%的乙醇補足至5 mL，加入 4 mL 1%的AlCl3溶液，用80%的乙醇定容，搖勻放置 10 min，在200～600 nm波長范圍檢測吸光度，確定其可見光區(qū)最大吸收波長為409 nm。

分別精確量取0.1 mg/mL蕓香苷標準品溶液1.0、2.0、30、4.0、5.0、6.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按照上述操作，在409 nm波長條件下測定吸光度，以蕓香苷對照品濃度（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性擬合，得到線性方程y=0027 1 x+0.039 3，r2=0.998 1，檢測限為1×10-5 μg/mL。

1.3.2樣品的提取制備精確稱取明日葉地上部分莖葉粉末2.5 g，共計9份，置于250 mL磨口三角瓶中，參照文獻[9，11]，采用L9（34）正交設(shè)計超聲波提取，固定提取次數(shù)為3次，抽濾，合并3次濾液，減壓蒸餾，回收乙醇，將提取液用一定濃度的乙醇定容至250 mL，搖勻，作為待測樣品溶液[10]。

1.3.3樣品總黃酮含量測定精確量取供試品溶液 1.0 mL，用1% AlCl3在409 nm處按照標準曲線的測定方法和步驟測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮的含量和相應(yīng)的提取率。

2結(jié)果與分析

2.1總黃酮提取方法的選擇

考慮到同屬植物當歸總黃酮在乙醇中溶解度較好，提取時間為3.5 h的條件下溶出量較大[9-10]，故考察了明日葉的2種提取方法：

回流法：取明日葉粉末5 g，用30倍量的80%乙醇提取3次，每次1 h，抽濾，合并3次濾液。

超聲波法：取明日葉粉末5 g，用30倍量的80%乙醇浸泡3次，每次20 min，抽濾，合并3次濾液。

用以上2種提取方法提取明日葉總黃酮，依次測定其中總黃酮得率，得出回流法提取總黃酮的含量高（表1），但回流法操作時間長加熱溫度高，不利于總黃酮的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。故選用超聲波法作為明日葉總黃酮的提取方法，并通過下面正交試驗選擇最佳提取條件。

2.2總黃酮提取的正交試驗

選擇超聲波法作為提取方法，選定乙醇濃度、料液比、提取功率、提取時間作為考察因素，每個因素取3個水平，固定提取次數(shù)為3次，選用L9（34）正交表進行試驗[11]。因素水平見表2，以提取物中總黃酮的得率為考察指標，結(jié)果見表3。

對于總黃酮的提取，通過直觀分析，B因素影響不顯著，故以B因素作為誤差進行方差分析，結(jié)果見表4。

根據(jù)表2和表3可以看出乙醇用量、提取功率對指標影響不顯著，乙醇濃度對指標有顯著影響，極顯著的因素為提取時間。由極差計算可知RD>RA>RC>RB，因此，影響明日葉中總黃酮提取得率的各因素主次順序為D>A>C>B。分析各因素對總黃酮的綜合影響，并考慮到提取成本，最佳提取方案為A2B2C1D3。

2.3最佳提取條件的驗證

按照上述確定的最佳條件，做5次平行試驗，得出總黃酮表4正交試驗方差分析

方差來源離差平方和SS自由度df方差SFPA0.008 097 63620.004 048 81820.776 744 92<0.05B（誤差）0.000 389 74520.000 194 873C0.001 564 66720.000 782 3344.014 590 73>0.05D0.042 161 97620.021 080 988108.178 312 1<0.01注：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.0。

的含量比正交試驗中的任何一次實驗的得率都高，平均得率為1.56%，RSD為0.883%。表明正交試驗所得到的上述最佳條件為超聲波法提取明日葉總黃酮的最佳工藝。

3結(jié)論與討論

利用超聲波提取方法，設(shè)計了4因素3水平的正交試驗，研究了4種因素對明日葉中總黃酮提取的影響，結(jié)果表明超聲波提取技術(shù)與傳統(tǒng)的回流法相比較具有提取時間短、總黃酮得率相近等優(yōu)點。根據(jù)試驗結(jié)果，最終確定提取工藝如下：提取時間為25 min，乙醇濃度為80 %，提取功率為60 W，料液比為1 g ∶20 mL。

明日葉莖葉中含有黃酮類物質(zhì)，本研究選用正交試驗法優(yōu)化試驗條件，為天然黃酮類化合物的獲得提供另一種可利用資源，同時也為明日葉藥用成分的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]孫赫，鐘進義，孟揚，等. 明日葉查爾酮對小鼠肝癌細胞 PCNA 和BCL-2蛋白表達影響[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2011，11（9）：1659-1662.

[2]樊琛，曾慶華，王會，等. 金銀花總黃酮的提取[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：255-256.

[3]王亦敏. 明日葉中查耳酮的分離純化工藝研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（1）：53-54.

[4]李曉芬，周學(xué)進，張公信，等. 大孔吸附樹脂對竹葉蘭中總黃酮的分離純化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（14）：2939-2942.

[5]李盈蕾，陳建華，陳麗娟，等. 大孔吸附樹脂純化大米草總黃酮的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）：1182-1184.

[6]陳燕芹，劉紅，蔡麗. 蕨菜總黃酮的提取及抗氧化性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（12）：299-301.

[7]楊慶利，畢潔，禹山林，等. 應(yīng)用大孔樹脂純化花生殼總黃酮[J]. 食品科學(xué)，2009，30（20）：44-48.

[8]劉晨，劉安軍，馬艷弘，等. 藍莓酒渣花色苷的超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：242-247.

[9]王芙蓉，吳冬青，安紅鋼，等. 當歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010，29（5）：11-15.

[10]郭曉青，吳金鴻，周焱富，等. 明日葉葉水溶性總黃酮提純工藝[J]. 食品科學(xué)，2012，33（22）：27-32.

[11]魏元鋒，劉新國，韓建偉，等. HP20樹脂純化黃芩總黃酮的研究[J]. 湖北中醫(yī)雜志，2007，29（2）：50-51.龔艷冰，胡娜，劉高峰，等. 蘇北地區(qū)季節(jié)性旱災(zāi)特征研究——以江蘇省徐州市、鹽城市為例[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：340-344.