廣山藥組織培養(yǎng)技術(shù)的研究

張振霞++葉靜鵬++鄭莉++陳貴豪++鄭玉忠

摘要：以廣山藥塊莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究了消毒劑、消毒濃度、消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒的影響，在此基礎(chǔ)上研究了不同激素配比、培養(yǎng)條件對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，用0.1%HgCl2 12 min的消毒條件處理山藥地下塊莖的效果較好；8 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA和5 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)廣山藥塊莖愈傷組織的效果較好；采用1/2 MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA的培養(yǎng)基對(duì)于廣山藥再生苗的生根效果最好，主根明顯，出現(xiàn)更多的不定根和毛狀根；添加1 g/L活性炭對(duì)于廣山藥塊莖褐化的防治效果明顯；黑暗培養(yǎng)能更好地誘導(dǎo)愈傷組織。

關(guān)鍵詞：廣山藥；組織培養(yǎng)；愈傷組織；激素；消毒

中圖分類號(hào)： S632.104+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0076-05

收稿日期：2015-03-20

基金項(xiàng)目：韓山師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：QD20120626）。

作者簡(jiǎn)介：張振霞（1975—），女，博士，副教授，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：zhangzhenxia2006@gmail.com。

通信作者：鄭玉忠，博士，副研究員，從事中藥學(xué)工作。E-mail：zhengyuzhong@gmail.com。 山藥是薯蕷 （Dioscorea opposita Thunb.） 的塊莖，早在宋代廣山藥就是中藥山藥的一個(gè)品種，在中醫(yī)上屬于補(bǔ)益類中藥，具有健脾止瀉、補(bǔ)肺益腎等功能；同時(shí)也是南方各地的傳統(tǒng)保健菜肴，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]。 山藥通常利用塊莖育苗或零余子播種等方式進(jìn)行繁殖。這種傳統(tǒng)的繁殖方式有著一定的弊病，主要是因?yàn)槎鄶?shù)薯蕷科種類的細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)目較多，容易發(fā)生變異，出現(xiàn)性狀分離，引起品種品質(zhì)的退化[3]。另外，薯蕷科植物自身為了生存下來，會(huì)盡量多保留對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的性狀，例如零余子的增多，塊莖變小，品質(zhì)變差，須根增多等[4]。此外，長(zhǎng)期的無性繁殖會(huì)不斷積累病毒，使其生產(chǎn)力明顯下降[5-6]。目前對(duì)于山藥的培養(yǎng)研究多為懷山藥，而對(duì)廣山藥的組織培養(yǎng)少見報(bào)道。本研究利用植物生物技術(shù)中組織培養(yǎng)的方法對(duì)廣山藥進(jìn)行快速無性繁殖，不僅可以保持其優(yōu)良性狀，在短期內(nèi)生產(chǎn)出大量整齊、均勻的健壯種苗，解決繁殖系數(shù)低、塊莖帶病毒等問題，從而滿足市場(chǎng)的大量要求。

1材料與方法

1.1材料來源

材料是購(gòu)自廣東省汕頭市潮陽區(qū)的廣山藥塊莖，并種植于花盆中待其長(zhǎng)出植株，選取其幼嫩葉片和塊莖作為試驗(yàn)材料。

以MS、NB為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，pH值5.8，不同濃度2，4-D、NAA、6-BA、KT、IBA等激素。所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

培養(yǎng)室溫度（25±1） ℃，空氣相對(duì)濕度50%～60%，光照時(shí)間每天12 h，光照度1 000～1 500 lx 。

1.2方法與步驟

1.2.1廣山藥塊莖外植體的消毒選取新鮮廣山藥塊莖，用自來水清洗干凈后，放在蒸餾水中浸泡30 min，用蒸餾水清洗干凈，70%乙醇消毒10 s，再按不同的方式進(jìn)行消毒處理（表1），加入消毒劑之后再加入2滴吐溫，恒溫?fù)u床100 r/min振蕩滅菌，最后用無菌水清洗5次。用無菌濾紙吸干水分后將塊莖切成1 cm大小、厚度0.3 cm的塊狀接種到MS培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄。

1.2.2廣山藥塊莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有著不同的影響，本試驗(yàn)設(shè)置MS、1/2MS、NB母液培養(yǎng)基對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織的誘導(dǎo)。以消毒后的廣山藥塊莖作為試驗(yàn)外植體，均切1 cm大小、厚度0.3 cm的塊狀，接種至含5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA的MS、1/2MS、NB的培養(yǎng)基上，觀察并記錄基本培養(yǎng)基成分對(duì)廣山藥愈傷組織誘導(dǎo)的差異。

取消毒后的廣山藥塊莖接種到MS基本培養(yǎng)基上，其中不同的生長(zhǎng)激素分別為1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA、1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA、1 mg/L NAA+1 mg/L IBA、1 mg/L 2，4-D+1 mg/L IBA，觀察記錄廣山藥愈傷組織的生長(zhǎng)狀況，比較哪種激素條件更適合誘導(dǎo)廣山藥塊莖愈傷組織的誘導(dǎo)。

將廣山藥的無菌塊莖接種在MS+0.5 mg/L 6-BA，設(shè)置2，4-D濃度分別為1、2、4、8、10 mg/L等5個(gè)不同濃度。通過觀察記錄，分析不同的2，4-D濃度對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織生長(zhǎng)的影響。

廣山藥塊莖均切小塊，接種在MS+5 mg/L 2，4-D，其中6-BA濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/L等5個(gè)不同處理。觀察記錄，分析不同的6-BA濃度對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織生長(zhǎng)的影響。

1.2.3廣山藥塊莖愈傷組織誘導(dǎo)的光照條件設(shè)置24 h、12 h 光照和黑暗培養(yǎng)3種光照條件，將廣山藥塊莖接種在 MS+5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，分別在上述的光照條件下培養(yǎng)。1個(gè)月后，觀察比較不同光照條件下廣山藥愈傷組織生長(zhǎng)的差異。

1.2.4廣山藥愈傷組織防褐變處理取廣山藥的無菌塊莖接種到MS+5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，采用不同防褐化添加物：1 g/L PVP、2 g/L PVP、1 g/L 活性炭、2 g/L 活性炭，設(shè)置對(duì)照，觀察記錄5組試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行比較分析。

1.2.5誘導(dǎo)生根培養(yǎng)從試驗(yàn)所得的廣山藥再生苗接種到不同培養(yǎng)基中（表2），觀察記錄再生苗生根的生長(zhǎng)狀況，并統(tǒng)計(jì)生根率。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方式對(duì)廣山藥塊莖外植體培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)設(shè)置了不同種消毒方式，1周后比較染菌率及存活狀態(tài)，篩選適合廣山藥塊莖外植體的消毒方法。研究發(fā)現(xiàn)，不同的消毒條件，無論是哪種消毒劑、消毒濃度，消毒時(shí)間越長(zhǎng)，污染率越低，壞死率越高（表3）。通過比較HgCl2的2個(gè)濃度0.05%和0.1%，以及次氯酸鈉的2個(gè)濃度20%和30%的消毒效果，選擇0.1%HgCl2消毒12 min作為廣山藥塊莖的消毒條件，在此條件下外植體污染率為8%，壞死率為34%，誘導(dǎo)率為58%。

2.2不同基本培養(yǎng)基對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本試驗(yàn)設(shè)置了MS、1/2MS、NB 的3種基本培養(yǎng)基，激素條件均為5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，來選擇誘導(dǎo)愈傷組織的最佳基本培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 不同基本培養(yǎng)基成分對(duì)廣山藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果不相同。廣山藥塊莖外植體在MS基本培養(yǎng)基中的出愈率最高，為78%；而1/2MS培養(yǎng)基中的出愈率僅有34%，且愈傷組織疏松，形狀不規(guī)則；NB與1/2MS 相比，其愈傷的外部形狀相似，出愈率相對(duì)高一些（表4）。由此可見，無機(jī)鹽含量高的MS基本成分更適合用于廣山藥愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)生長(zhǎng)，誘導(dǎo)的愈傷組織出愈率高，質(zhì)地好，不會(huì)疏松，而且出根率、出芽率相對(duì)較低。

2.3不同生長(zhǎng)激素配比對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素的配比決定植物組織培養(yǎng)過程中外植體的發(fā)育方向[6]，2，4-D、NAA、6-BA、IBA等都是使用廣范的植物激素。本試驗(yàn)設(shè)置了4種不同組合來探究廣山藥塊莖誘導(dǎo)愈傷組織的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種不同組合的生長(zhǎng)激素對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織的誘導(dǎo)都表現(xiàn)出較高的出愈率，分別能達(dá)到75%、73.75%、63.75%、58.75%，4種培養(yǎng)基的生根率、出芽率以及愈傷的生長(zhǎng)狀況都不同（表5）。

2.4不同2，4-D濃度對(duì)廣山藥塊莖愈傷組織生長(zhǎng)的影響

設(shè)置了5個(gè)不同的2，4-D濃度與0.5 mg/L 6-BA搭配來探究最適宜廣山藥塊莖誘導(dǎo)愈傷組織的2，4-D濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2，4-D濃度從1 mg/L到8 mg/L，隨著濃度的逐漸增大廣山藥外植體的出愈率也不斷升高，其中8 mg/L時(shí)出愈率高達(dá)100%，且愈傷顆粒狀、紫紅色。但當(dāng)濃度增加到10 mg/L 時(shí)，出愈率反而比8 mg/L的出愈率下降了10百分點(diǎn)，同時(shí)外植體的愈傷生長(zhǎng)速度變慢，愈傷質(zhì)地更硬（圖1至圖5，表6）。根據(jù)以上分析可得出，在MS基本培養(yǎng)基上，8 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA 時(shí)更適合于誘導(dǎo)廣山藥塊莖愈傷組織。

2.5不同6-BA濃度對(duì)廣山藥愈傷組織生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)也同時(shí)選擇確定適合誘導(dǎo)愈傷組織的6-BA濃度。在2，4-D為5 mg/L的基礎(chǔ)上，設(shè)置5個(gè)6-BA的不同濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA 的濃度從0.1 mg/L到0.8 mg/L，隨著濃度的逐漸增加愈傷的出愈率也不斷升高，濃度為0.4 mg/L和 0.8 mg/L 時(shí)的出愈率均達(dá)到最高（95%），但當(dāng)6-BA 的濃度增加到1 mg/L 時(shí)其出愈率反而下降了（表7）。由此可見，5 mg/L的 2，4-D+0.4 mg/L 6-BA組合誘導(dǎo)廣山藥愈傷組織比較理想。

2.6不同光照條件對(duì)廣山藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

光照條件也是植物組織培養(yǎng)中的影響因子，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響[6]。本試驗(yàn)設(shè)置了24 h 光照培養(yǎng)、12 h光照培養(yǎng)、 黑暗培養(yǎng)3種

條件，來研究哪一種光照條件更適合廣山藥塊莖愈傷組織的培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，3種光照條件對(duì)于淮山藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果都不錯(cuò)，其出愈率都達(dá)到85%以上，其中在黑暗培養(yǎng)的出愈率最高，為92%，愈傷的質(zhì)量也是黑暗培養(yǎng)最好（表8）。由此可見，黑暗培養(yǎng)更適合誘導(dǎo)廣山藥塊莖愈傷組織的誘導(dǎo)生長(zhǎng)。

2.7不同抗氧化措施對(duì)廣山藥塊莖褐變抑制的影響

廣山藥塊莖切塊培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，影響了組織培養(yǎng)的成活率。本試驗(yàn)采用PVP和活性炭來防止、減輕廣山藥塊莖褐變現(xiàn)象的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，添加各種防褐化材料對(duì)于廣山藥外植體誘導(dǎo)愈傷組織影響明顯，出愈率都達(dá)到90%以上；對(duì)比5組試驗(yàn)的褐化率可以得出，活性炭的防褐化效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于PVP，從外植體及愈傷組織的褐化變化過程中也可以得到同樣的結(jié)果（表9）。同時(shí)注意到活性炭的防褐化效果比較好，但濃度較高又會(huì)影響到外植體的存活率。

2.8誘導(dǎo)生根培養(yǎng)

在MS、1/2MS、1/2MS+1 mg/L IBA、1/2MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA培養(yǎng)條件下，于廣山藥再生植株的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)的效率均達(dá)到100%，只是誘導(dǎo)出來的根之間有一定的差別。MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的再生苗的根數(shù)量較少、纖細(xì)，毛狀根較少；1/2MS培養(yǎng)基上的根數(shù)量比前者多且粗壯；在1/2MS的基礎(chǔ)上添加1 mg/L IBA后，再生苗長(zhǎng)出明顯的主根，并且又壯又長(zhǎng)，還有少數(shù)的不定根；在1/2MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出來的根主根明顯，還有比較多的不定根，毛狀根也比較多，幼苗生長(zhǎng)快（表10）。綜上所述，1/2MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA培養(yǎng)基誘導(dǎo)再生苗生根比較理想（圖6）。

3結(jié)論與討論

3.1消毒劑的選擇以及消毒時(shí)間、消毒濃度的確定

選擇正確的消毒劑、消毒時(shí)間以及消毒濃度是建立組織培養(yǎng)體系的前提[6-7]。在試驗(yàn)中選擇的消毒劑有HgCl2和次氯酸鈉，升汞的濃度分別為0.01%、0.02%、0.05%、0.1%，次氯酸鈉的濃度分別為20%、30%，消毒時(shí)間分別為5、8、12、15 min。不同的外植體設(shè)置有不同的消毒時(shí)間和消毒濃度。從消毒的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，消毒劑濃度越低，消毒時(shí)間越短外植體污染率越高；消毒劑濃度越高，消毒時(shí)間越長(zhǎng)，外植體的污染率越低，但是外植體的死亡率越高，這是因?yàn)橛械耐庵搀w在消毒過程中死亡。在用乙醇處理過程中也要注意消毒時(shí)間，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)造成外植體脫水死亡。此外，消毒過程中滴加適量的吐溫作為表面活性劑，并不斷振蕩搖晃，可以改善消毒效果。

3.2生長(zhǎng)激素的選擇

在植物組織培養(yǎng)中配以適宜的植物激素是非常關(guān)鍵的，適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)以及生根培養(yǎng)是極其重要的[7]。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，比例高時(shí)，有利于根的形成和愈傷組織的形成；比例適中時(shí)，有利于根芽的分化；比例低時(shí)，有利于芽的形成[8]。豐鋒等[9]的報(bào)道也指出高濃度細(xì)胞分裂素有利于芽誘導(dǎo)增殖。本試驗(yàn)中，廣山藥塊莖為外植體時(shí)選用高濃度的2，4-D和低濃度的6-BA有利于愈傷組織的生成，低濃度的2，4-D和高濃度的6-BA有利于根的生成。在生根培養(yǎng)中用了生長(zhǎng)素NAA和IBA，對(duì)生根有很好的效果，其生根率都能達(dá)到 100 %，且主根明顯、粗壯。

3.3光照條件的選擇

光照條件對(duì)于植物生長(zhǎng)是必不可少的條件，對(duì)于植物愈傷組織的誘導(dǎo)也是重要的條件之一[6]。試管苗或無菌苗的培養(yǎng)需要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，愈傷組織的誘導(dǎo)也需要一定的光暗周期，也有一些植物的愈傷組織在全黑暗的誘導(dǎo)下會(huì)長(zhǎng)得更好。在試驗(yàn)中設(shè)置有全日照培養(yǎng)、半日照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)3種光照條件。研究發(fā)現(xiàn)，不管從出愈率還是愈傷組織的生長(zhǎng)狀況來看，黑暗培養(yǎng)更加適合廣山藥塊莖愈傷組織的生長(zhǎng)。

3.4褐化的防止

褐化是植物組織培養(yǎng)中一種常見的不利現(xiàn)象，對(duì)于外植體的脫分化和再分化過程的影響非常大，甚至是影響某些植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵[10]。影響外植體褐化的因素多種多樣，不同植物品種、同種植物的不同類型因?yàn)橥庵搀w材料的基因型不同，在組織培養(yǎng)中褐化發(fā)生的頻率和程度都存在著較大的差異[11]。防褐化的途徑也多種多樣，適宜的培養(yǎng)基、良好的培養(yǎng)條件、適宜的外植體或者增加抗褐化劑或吸附劑都可以有效地防止褐化現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過在培養(yǎng)基中增加抗褐劑和吸附劑活性炭和PVP來防止外植體的褐化。蔡建榮采用聚乙烯吡咯烷酮PVP來抑制淮山莖段和葉片外植體的褐化[12]。本研究結(jié)果顯示對(duì)于廣山藥塊莖，活性炭可以明顯吸附培養(yǎng)物分泌的酚、醌等有害物質(zhì)，能有效降低褐變。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳仁修. 潮汕生物資源志略[M]. 廣州：中山大學(xué)出版社，1997.

[2]梁宗鎖，高致明. 藥用植物學(xué)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2007.

[3]王志安，許炫玉. 運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)篩選盾葉薯蕷新品種[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17（1）：13-14.

[4]李明軍，薛建平，陳明霞，等. 不同因子對(duì)山藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 廣西植物，2000，20（2）：156-160.

[5]朱德慰. 植物組織培養(yǎng)與脫毒快繁技術(shù)[M]. 北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2001.

[6]潘瑞熾. 植物細(xì)胞工程[M]. 廣州：廣東高等教育出版社，2006.

[7]蔡建榮，曾軍，張志勇，等. 懷山藥莖段組織培養(yǎng)及增殖的研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技，2002（2）：14-15.

[8]李代麗，康向陽. 植物愈傷組織培養(yǎng)中內(nèi)外源激素效應(yīng)的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 生物技術(shù)通訊，2007，18（3）：546-548.

[9]豐鋒，葉春海，王耀輝，等. 淮山的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，20（1）：24-28，32.

[10]李新鳳，趙瀅，田玉龍. 植物組織培養(yǎng)褐化問題的研究進(jìn)展[J]. 吉林農(nóng)業(yè)，2010（2）：66-67.

[11]高國(guó)訓(xùn). 植物組織培養(yǎng)中的褐變問題[J]. 植物生理學(xué)通訊，1999，35（6）：501-506.

[12]蔡建榮. 山藥組織培養(yǎng)褐化反應(yīng)的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（8）：118-120.陳英，吳友根，楊東梅，等. 廣藿香不同部位總DNA提取方法比較與PTS基因克隆[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：81-84.