抗輪紋病蘋果砧木1—1—10—8莖尖培養(yǎng)快繁體系建立

陳曉潔++鄭伶杰++李方方++李忠勇++張學英+++徐繼忠

摘要：以抗輪紋病蘋果砧木1-1-10-8的莖尖為外植體，通過研究培養(yǎng)基中不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對芽苗誘導、增殖和生根的影響，篩選出適合蘋果砧木1-1-10-8莖尖組培快繁的培養(yǎng)基配方。結果表明：1-1-10-8砧木外植體材料經(jīng)0.1%HgCl2浸泡處理10 min的消毒效果最好，外植體成活率較高，為65%；以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖 35 g/L、瓊脂6.2 g/L，適宜啟動培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；適宜增殖培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.075 mg/L，增殖系數(shù)可達到每4周12.71倍；以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖15 g/L、瓊脂6 g/L，適宜組培苗生根的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6mg/L，生根率達 98.06%，每株苗平均生根7.89條，移栽成活率達92.38%。

關鍵詞：蘋果砧木；莖尖培養(yǎng)；組培快繁；植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號： S436.611.1+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0051-03

收稿日期：2015-01-26

基金項目：河北省科技項目（編號：14226307D-5）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201203075-05）。

作者簡介：陳曉潔（1989—），女，河北張家口，碩士研究生，主要從事果樹栽培生理研究。E-mail：15933593516@163.com。

通信作者：徐繼忠，博士，教授，博士生導師，主要從事果樹生物技術、果樹栽培生理與生態(tài)研究。E-mail：xjzhxw@126.com 。

蘋果輪紋病，是由輪紋病病原菌（Botryosphaeria dothidea）引起的真菌性病害，已成為威脅蘋果產(chǎn)業(yè)的重大病害之一[1-2]。蘋果輪紋病不僅危害蘋果果實，造成爛果，降低果實品質(zhì)，而且危害枝干，削弱樹勢，影響結果年限，嚴重時造成枝干枯死[3]。近年來，果實套袋技術的推廣使蘋果果實輪紋病的發(fā)生受到抑制，但枝干輪紋病卻日趨嚴重，成為蘋果生產(chǎn)中的瓶頸問題。蘋果枝干輪紋病在高溫多雨地區(qū)發(fā)病嚴重，楊軍玉等統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)全國除了甘肅和黑龍江較輕外，蘋果枝干輪紋病在各地均發(fā)生嚴重[4]。目前，生產(chǎn)上對蘋果枝干輪紋病的防治主要是采取重刮皮結合施用化學農(nóng)藥的措施[5]，但是這些措施很難根除蘋果枝干輪紋病的發(fā)生，且刮樹皮、施藥等需要耗費較多的人力、物力[6]，長期大量使用化學農(nóng)藥不僅會增加果實的農(nóng)藥殘留，嚴重影響著蘋果果實的質(zhì)量與安全，而且容易使輪紋病菌對化學藥劑產(chǎn)生抗性[7-9]。所以尋求一條能夠安全有效解決蘋果枝干輪紋病的正確途徑成為蘋果產(chǎn)業(yè)亟待解決的關鍵問題。

選用輪紋病抗性砧木是防治蘋果枝干輪紋病安全有效的方法之一。研究表明，采用抗輪紋病的砧木能夠增強樹體對蘋果輪紋病的抗性，有效降低蘋果輪紋病的發(fā)病率[6，10-12]。姜忠武等從雞冠自然雜交實生苗中選育出的“煙砧1號”砧木對蘋果輪紋病菌具有抗性，以其作中間砧的富士枝干輪紋病的發(fā)病率比未嫁接中間砧的富士降低59.3%[10]。因此，選育優(yōu)良抗輪紋病蘋果砧木成為果樹育種工作人員的迫切任務之一。

應用抗輪紋病砧木防治蘋果枝干輪紋病的首要任務是生產(chǎn)培育健壯的抗輪紋病自根砧木苗。自根砧的繁殖方式主要有種子繁殖、扦插、壓條與組織培養(yǎng)等[13]，其中組織培養(yǎng)技術是快速穩(wěn)定高效繁殖苗木的最佳方式[14]。1-1-10-8砧木是由河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院蘋果課題組經(jīng)田間自然發(fā)病調(diào)查和接菌試驗鑒定的抗輪紋病蘋果砧木，對防治蘋果枝干輪紋病具有重要利用價值，迄今對1-1-10-8砧木組培快繁的研究尚未見報道。本試驗以抗輪紋病蘋果砧木1-1-10-8為試材，采用莖尖培養(yǎng)的方法，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的激素配比，篩選出適宜于蘋果砧木1-1-10-8誘導成活、增殖與生根的最佳培養(yǎng)基配方，建立其快速繁殖體系，為進一步研究輪紋病的防治奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

2014年3月下旬，自河北省保定順平縣滕家莊村蘋果試[LM]驗園剪取具飽滿芽的1-1-10-8砧木未萌芽枝條，清水沖洗干凈后置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培，培養(yǎng)條件為：光/暗周期12 h/12 h，光照條件下溫度為（24±2） ℃，黑暗條件下溫度為（15±2） ℃，空氣濕度保持70%以上，每天噴霧保濕并更換清水。芽萌發(fā)后取2.0 cm以上的嫩梢作為外植體，用流水沖洗干凈，置于100 mL三角瓶中備用。

1.2試驗方法

1.2.1外植體的消毒時間對接種成活的影響在超凈工作臺上用0.1% HgCl2溶液進行消毒處理，消毒時間設置8、9、10、11 min 4個處理，0.1% HgCl2溶液浸泡后，用無菌水沖洗 4～5次，然后用槍狀鑷取出置于無菌的玻璃皿中，最后切除外植體傷口部位褐變的部分，接種于啟動培養(yǎng)基上。啟動培養(yǎng)基選用蘋果組織培養(yǎng)通用培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂 6 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L），2周后調(diào)查污染率和外植體成活情況。

1.2.2外源激素對蘋果砧木1-1-10-8啟動培養(yǎng)的影響啟動培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，其中蔗糖35 g/L，瓊脂 6.2 g/L，pH值為6.0～6.5，NAA濃度為0.05 mg/L保持不變，將6-BA設為0.5、0.75、1.0、1.5 mg/L 4個濃度梯度，共4個處理，重復3次。接種后置于光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度2 000～3 000 lx，光/暗周期各12 h交替。接種25 d后，統(tǒng)計誘導成活率。

誘導成活率=誘導成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.3外源激素對1-1-10-8組培苗繼代增殖的影響繼代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，其中蔗糖35 g/L、瓊脂 6.2 g/L，6-BA設為0.5、1.0、1.5 mg/L 3個濃度梯度，NAA 設為0.05、0.075、0.1 mg/L 3個濃度梯度，兩兩組合，共9個處理。選取啟動培養(yǎng)基中生長健壯一致的芽苗，分別接種至上述9種不同繼代培養(yǎng)基中，每個處理20株，重復3次，培養(yǎng)條件與啟動培養(yǎng)保持一致。接種后4周左右統(tǒng)計接芽的增殖系數(shù)和分枝高度。

[JZ]增殖系數(shù)=增殖莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)。

1.2.4外源激素對J35-8組培苗生根的影響選擇健壯情況一致、高于2.0 cm的繼代苗，分別接種于不同生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖15 g/L，瓊脂6 g/L，IAA濃度為1.0 mg/L保持不變，IBA設置為0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L 4個濃度梯度，每個處理20株，重復3次，培養(yǎng)條件同啟動培養(yǎng)。接種20 d后統(tǒng)計生根率、根數(shù)和根長，評價生根苗生長狀態(tài)。

生根率=誘導生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù)×100%。

1.2.5煉苗與移栽生根培養(yǎng)20 d，移至溫室中煉苗，1周后去除封口膜，再鍛煉2～3 d后移栽至營養(yǎng)缽中。蛭石和草炭等體積混合后用0.1%多菌靈溶液殺菌配制成培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)基質(zhì)的濕度以“手握成團不滴水，落地即散”為宜。將基質(zhì)裝入事先準備好的營養(yǎng)缽中，栽入生根苗。移栽后立即用0.1%的多菌靈溶液澆透，覆蓋棚膜，保溫保濕。1周左右開始放風鍛煉，經(jīng)過2周左右揭開棚膜，3周后長出新葉，統(tǒng)計成活率。

移栽成活率=移栽成活株數(shù)/總移栽株數(shù)×100%。

2結果與分析

2.1HgCl2消毒時間對外植體消毒效果的影響

由表1可知，HgCl2消毒時間對外植體成活具有較大影響，在8～11 min之間，隨消毒時間延長，外植體真菌污染率呈降低趨勢，消毒處理11 min時外植體的污染率為0；但消毒時間越長外植體褐變率也越高，消毒處理11 min的褐變率高達82.5%。消毒處理10 min時，外植體污染率和褐變率控制在較低水平，分別為10.0%和25.0%，外植體接種成活率最高，為65.0%，所以1-1-10-8砧木外植體消毒的最適時間為10 min。

2.2不同6-BA濃度對芽誘導的影響

由表2可知，NAA濃度為0.05 mg/L不變，6-BA的濃度對外植體誘導成活有較大的影響，6-BA濃度在0.5～1.5 mg/L 范圍內(nèi)，外植體成活率呈顯先升高后降低的規(guī)律，6-BA 濃度為1.0 mg/L時，外植體誘導成活率最高，為7714%。因此認為，本試驗中最適宜于抗輪紋病蘋果砧木1-1-10-8啟動培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為NAA 0.05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。

2.3不同6-BA與NAA配比對組培苗繼代增殖的影響

由表3可知，6-BA濃度一定，NAA濃度在0.05～0.10 mg/L 范圍內(nèi)，繼代苗的增殖系數(shù)和分枝高度均呈顯先上升后下降的趨勢。增殖系數(shù)最高的是處理5，為12.71，顯著高于其他處理；其次為處理4，增殖系數(shù)為10.27；處理1的

增殖系數(shù)最低，僅5.13，不足處理5和處理4的1/2。分枝高度最高的也是處理5，為5.13 cm，其次為處理9和處理8，分枝高度分別為4.66 cm和4.61 cm，再次為處理4，分枝高度為3.99 cm，分枝高度最小的是處理1，低于2 cm。所以，處理5更適宜應用于抗輪紋病蘋果砧木1-1-10-8的增殖培養(yǎng)，其植物生長調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.075 mg/L。

2.4不同IAA與IBA配比對組培苗生根及移栽成活率的影響

由表4可知，各處理的外植體材料均容易生根，生根率均達90%以上，平均生根5條以上，根長為1.36 cm以上，且較易移栽成活。當IAA濃度為1.0 mg/L、IBA濃度為0.6 mg/L時， 不論生根率、生根數(shù)目和成活率都顯著高于其他處理，生根率為98.06%，每株生根苗平均生根7.89條，移栽成活率高達92.38%。因此，較適宜于蘋果抗輪紋病砧木1-1-10-8組培苗的生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L。

3討論與結論

外植體材料接種成活受多種因素的影響[15-19]，如材料的種類、質(zhì)量、消毒處理時間和啟動培養(yǎng)基配方等。褐變和真菌污染是威脅蘋果砧木外植體材料成活的2個最重要的影響因素，所以外植體材料消毒處理時間應綜合考慮兩者的影響，使外植體材料的褐變率和真菌污染率同時控制在較低水平下。試驗證明1-1-10-8砧木外植體材料最適消毒時間為10 min，外植體污染率和褐變率較低，分別為10%和25%，外植體接種成活率高，為65%。

試驗結果表明：抗輪紋病蘋果砧木1-1-10-8的外植體經(jīng)HgCl2消毒處理10 min，外植體褐變率和污染率較低，有利于外植體材料成活；適宜于1-1-10-8外植體啟動培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；適宜于繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.075 mg/L；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L。

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，蘋果砧木1-1-10-8外植體材料接種成活后轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基中繼代苗莖明顯變細，但組培苗生長旺盛，增殖系數(shù)較高，組培苗生根和移栽成活不受影響。該現(xiàn)象可能與材料本身的遺傳特性有關，也可能與激素配比有關，有待進一步證實。

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