關聯(lián)分析及其在不同分子標記中的應用綜述

韓俊杰++王昊龍++李衛(wèi)華

摘要：關聯(lián)分析技術在植物中的應用較晚，近些年才在植物數(shù)量性狀和植物遺傳育種研究中得以應用。關聯(lián)分析以連鎖不平衡作圖（LD mapping）為基礎，用來鑒定植物性狀與目標基因之間的關系。關聯(lián)分析有很明顯的應用優(yōu)勢，它不僅不需要特殊的構圖群體，而且還能夠同時對多個基因位點進行檢測，精度非常高。由于其良好的實用性，關聯(lián)分析技術已經成為國際基因組學的研究熱點。介紹了LD的定義和度量方法，綜述了基于分子標記的關聯(lián)分析在植物遺傳中的應用，并對其在遺傳學中的應用和發(fā)展作了展望。

關鍵詞：植物；分子標記；關聯(lián)分析；連鎖不平衡；遺傳學；應用

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0013-05

關聯(lián)分析又稱連鎖不平衡作圖（linkage disequilibrium mapping，LD mapping），是建立在連鎖不平衡的基礎上用于鑒定群體內目標性狀與遺傳標記相關關系的方法[1]。關聯(lián)分析最早在人類疾病的研究中得以應用，并取得了豐碩的成果，目前在人類不同致病基因方面已有許多成功的報道[2]。在動物中的應用也相對較多，如在奶牛、魚、羊、豬、雞中的應用等。然而，由于目前對植物基因組LD結構的認識還不夠全面，導致關聯(lián)分析在植物中的應用相對較少[3]。但是，隨著生物信息學、統(tǒng)計學和基因組學技術的快速發(fā)展，關聯(lián)分析也已成功應用到許多植物上，如玉米、小麥、擬南芥、大麥、大豆等。近年來，許多植物的全基因組測序已經完成，這極大地促進了基因組學的發(fā)展，特別是近年來大量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）標記的開發(fā)，關聯(lián)分析在植物關鍵基因的發(fā)掘上更是得到了廣泛的應用，可為植物分子育種提供標記，在國際上已經成為熱點研究方向。

關聯(lián)分析通過群體上的進化歷史和重組，可以在序列水平上來研究復雜的數(shù)量性狀，因此與其他分析手段相比，關聯(lián)分析有其獨特的優(yōu)勢：（1）所需時間短，用自然群體作為材料，不需要專門構建，且有較大的選擇范圍，相對于數(shù)量性狀基因座（QTL）至少需要2年以上的群體能節(jié)約大量的時間；（2）檢測范圍大，同一座位的不同基因可以用來同時檢測，而QTL作圖只能檢測來自雙親的2個等位基因；（3）準確度高，QTL作圖精度一般在10～30cM左右，很少能在基因水平上被標記，而關聯(lián)分析可達到單基因的水平[4-5]，如Gebhardt等利用關聯(lián)分析方法將馬鈴薯抗晚瘟病基因RI定位在0.2cM的基因組區(qū)段內[6]。在植物相關研究中，由于其雜交方式和重復類型都可以得到人為有效控制，因此關聯(lián)分析在植物中的應用比在動物中的吸引力更高。

作物很多重要的農藝性狀（如株高、產量、營養(yǎng)品質和抗病性等）都屬于數(shù)量性狀，了解這些數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律對作物的改良有重要意義。目前，人們主要是通過全基因組圖譜和QTL定位來了解植物數(shù)量性狀，而關聯(lián)分析是QTL定位的有效手段，在分子育種中發(fā)揮了重要作用。近年來，隨著新一代分子標記——SNPs標記技術的出現(xiàn)以及植物基因組測序技術日趨成熟，植物遺傳學研究已經進入基因組研究時代。如今，在許多重要作物中都已經應用到關聯(lián)分析技術[7-8]，不僅應用到模式植物、三大糧食作物，還在甘蔗、大豆、馬鈴薯、甜菜、番茄和向日葵等其他植物中得到大量的應用。

1關聯(lián)分析的統(tǒng)計學意義

1.1LD連鎖不平衡

Jennings于21 世紀初期提出了LD這一概念[9]，這是自然選擇中的一種現(xiàn)象。在某一群體中，如果2個等位基因同時出現(xiàn)的概率與期望值不相同時，那么它們就處于LD狀態(tài)。連鎖不平衡和遺傳連鎖是不相同的，遺傳連鎖指的是由于物理作用而導致的不同位點不分開的現(xiàn)象，而連鎖不平衡則是等位基因間的作用。當2個基因位點緊密連鎖時，就會導致LD值處在比較高的水平。關聯(lián)分析是基于LD的，對LD結構的了解是關聯(lián)分析的前提。因此影響LD的因素同樣影響關聯(lián)分析的結果，這些因素有選擇、突變、重組、遺傳漂變、群體混合等。選擇、遺傳漂變和群體混合會增加LD程度，使關聯(lián)分析的精確性降低；而突變和重組由于多態(tài)性位點的產生而破壞LD狀態(tài)，因此突變和重組是影響LD的2個最主要的因素。標記類型也是LD的1個影響因素，Remington等用SSR標記和SNPs對來自全世界的102份常用玉米育種自交系全基因組標記的LD大小進行了研究，結果表明SSR標記檢測的LD水平明顯偏高，這說明在反映群體演化中SSR標記更有說服力[10]。另外，授粉方式也是影響LD的因素，一般而言異花授粉重組率高于自花授粉，其LD水平相較于自花授粉作物要低，所以異化授粉作物作關聯(lián)分析的效果要好于自花授粉作物。

1.2LD度量

LD統(tǒng)計的是2個不同位點在實際觀測中同時出現(xiàn)的頻率與隨機分離時期望同時出現(xiàn)的頻率之間的差異，即D。假設有2個連鎖的位點A、B，則A、a和B、b是其4種等位基因，頻率分別為φA、φa、φB、φb；AB、aB、Ab、ab的頻率分別為φAB、φaB、φAb、φab。那么D的計算公式為：Dab=φAB-φAφB。D=0時，2個基因座位處于連鎖平衡狀態(tài)；D=1時，2個基因座完全關聯(lián)；0

[JZ（]γ2=D2 /（φAφaφBφb）；[JZ）][JY] （1）

[JZ]D′=D2/min（φAφb，φaφB）（D<0）；

或：

[JZ（]D′=D2/min（φAφB，φaφb）（D>0）。 [JZ）][JY] （2）

D′、γ2代表的意義是不同的，它們的取值范圍都是0～1。D′僅包括重組史，對于一些稀有的等位基因來說，D′可能比較大，有較高的LD水平。在小樣本研究中，由于這4種等位基因相互組合的可能性較小，D′不能準確反映群體LD水平。γ2包括重組史、突變史，γ2可以反映標記是否與QTL有關，因此在關聯(lián)分析中通常用γ2來表示群體的LD水平[12]。而在實際的統(tǒng)計過程中，發(fā)生的頻率低于0.05或0.1的變異基本上都是可以忽略不計的。

由于不同作物群體的LD程度是不同的，而這恰恰是影響關聯(lián)分析有效性的主要因素。對LD結構有效利用，變異位點與表型性狀關聯(lián)，作出更加精確的高分辨率圖譜，在生物基因組的研究上意義重大。在關聯(lián)分析研究中，LD弱的群體找到與目的基因連鎖的標記相對較為容易，易于實現(xiàn)精確作圖；LD強的群體，找到與目標基因緊密連鎖的標記較為困難，不易于實現(xiàn)精確作圖。

2關聯(lián)分析的研究方法

目前關聯(lián)分析常用的研究方法有2種：全基因組掃描和候選基因途徑。全基因組掃描是在標記水平上對一些突變位點進行掃描，這些突變位點可能造成表型變異；而候選基因途徑則是通過統(tǒng)計分析將那些與目標性狀相關的等位基因從種質資源中挖掘出來，是在基因序列水平上進行的。

2.1全基因組掃描的關聯(lián)分析

在全基因組范圍內對分子標記進行掃描，將所得分子標記數(shù)據(jù)與表型性狀進行關聯(lián)分析。本方法需要的標記密度很高，如大量的簡單序列重復（SSR）、SNP標記等，但是不需要對研究對象再作任何假設，直接對全基因組的DNA變異進行研究。但是全基因組關聯(lián)分析花費巨大、耗時較多，目前完成起來困難重重。

對野生甜菜的研究是全基因組關聯(lián)分析的最早應用[13]。在試驗中發(fā)現(xiàn)，甜菜抽薹基因B與440個擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記中的2個顯著相關，并且存在1個與B基因緊密連鎖的標記。這一結果表明，關聯(lián)分析可以用來發(fā)掘與目的基因連鎖的分子標記。此后越來越多的人通過關聯(lián)分析的手段在全基因組水平上對不同作物的不同性狀進行分析，以期發(fā)掘出與性狀緊密連鎖的標記位點。Huang等對水稻進行全基因組關聯(lián)分析，在950個品種中分別檢測出32、10個與開花期、產量性狀顯著相關的位點[14]。Weng等用41 101個SNP 對284個玉米自交系進行全基因組關聯(lián)分析，鑒定出105個與株高相關的遺傳位點，并借助關聯(lián)分析進行精心作圖，實現(xiàn)了抗玉米絲黑穗病主效位點精細定位[15]。張煥欣等同樣用41 101個SNP 標記對203份玉米自交系進行全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)9個與穗行數(shù)顯著關聯(lián)的SNP[16]。連鎖分析、關聯(lián)分析都可以進行QTL定位，而連鎖分析檢測到的QTL數(shù)目一般少于關聯(lián)分析；2種方法檢測到的QTL在位置上有相當一部分具有一致性。這也表明，進行全基因組的關聯(lián)分析是對植物數(shù)量性狀研究的一條有效途徑。由于全基因組關聯(lián)分析可以同時對很多個基因位點進行檢測，并且不需要對特定的基因位點進行假設，因此全基因組關聯(lián)分析可以大大減少所需成本，加快植物分子育種的研究進程。

2.2候選基因的關聯(lián)分析

候選基因的關聯(lián)分析對性狀的表型鑒定數(shù)據(jù)和候選基因的多態(tài)性進行關聯(lián)分析，將對目標性狀有貢獻的等位基因從基因水平上發(fā)掘出來，一般涉及候選基因的功能預測。這需要對目標基因有一定的了解，目前應用比較多，特別是在多基因控制的性狀（如抗病性、抗逆性）研究中具有十分重要的作用。

候選基因關聯(lián)分析在植物上的應用起步較晚。2001年，Thornsberry等第1次將關聯(lián)分析應用到對玉米基因的研究中[17]，這意味著關聯(lián)分析可用于驗證基因功能和發(fā)掘新基因，為植物數(shù)量性狀研究提供了新的思路?；诤蜻x基因關聯(lián)分析在玉米上的研究或許能作為典型代表。Tian等為鑒定影響玉米花期性狀的遺傳位點，選用含5 000個重組自交系（RIL）的玉米巢式作圖群體作關聯(lián)分析，成功鑒定出其候選基因[18]。Salvi等對參與玉米開花期的基因[WTBX][STBX]Vgt1[WTBZ][STBZ]也進行了基于候選基因策略的關聯(lián)分析[19-20]。在研究與淀粉代謝有關的關鍵酶基因及其核苷酸LD的基礎上，Wilson等選擇6個基因的不同區(qū)域進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有4個與玉米籽粒各成分和淀粉糊化特性的一些指標呈顯著相關[21]。于永濤運用候選基因關聯(lián)分析法，選出了94份能代表我國玉米核心種質的自交系，采用關聯(lián)分析方法鑒定候選基因[WTBX][STBX]rab17[WTBZ][STBZ]并成功檢測到6個與表型性狀相關的位點[22]。Ravel等以控制高分子谷蛋白亞基的2個QTL位點為候選基因，對113份小麥進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)其中1個QTL位點與所測性狀存在顯著關聯(lián)[23]。Zheng等使用7個與小麥品質相關的候選基因對96份小麥栽培種和高代品系進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，個體親緣關系分析可以起到改進小麥品質性狀關聯(lián)分析的效果[24]。另外，基于候選基因的關聯(lián)分析在大麥、高粱、棉花、番茄等作物中也多見報道。

對于全基因組序列已經獲得的材料，可以先通過QTL把候選基因在基因序列上的位置縮小，然后利用生物信息學手段排除多的冗余序列，再對候選基因進行關聯(lián)分析，這樣就可以比較快速地找到目標性狀的候選基因。

3基于分子標記的關聯(lián)分析及在植物研究中的應用

全基因組關聯(lián)分析需要大量的分子標記，隨著許多物種測序工作的逐步完成，各種標記類型的大量開發(fā)，關聯(lián)分析在鑒定植物數(shù)量性狀上將表現(xiàn)出更大的應用潛力。目前，已有很多分子標記在植物性狀關聯(lián)分析中得到成功應用。

3.1AFLP標記與關聯(lián)分析

在植物研究中，首次運用全基因組掃描方法進行關聯(lián)分析的是2001年Hansen等對野生甜菜生長習性的研究[13]。2004年，Kraakman等對春大麥品種產量特征作關聯(lián)分析時，發(fā)現(xiàn)所用的236個AFLP標記中有8個與產量相關聯(lián)，有5個與產量穩(wěn)定性相關聯(lián)[25]。在2006年，Kraakman等又利用148份春大麥栽培種的部分性狀與AFLP標記進行LD作圖，找到與性狀對應的標記位點，證明LD作圖是尋找標記位點的另一種重要途徑[26]。王蕾等以215份芝麻核心種質為材料進行芝麻素、芝麻酚林與SSR、AFLP、SRAP標記的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)33個標記位點與供試群體的芝麻素、芝麻酚林極顯著關聯(lián)，與芝麻酚林極顯著關聯(lián)的8個位點中有1個AFLP標記[27]。楊鑫雷等以陸地棉和海島棉為材料，設計20對AFLP引物，共發(fā)現(xiàn)有125個位點，用這些位點與不同的農藝性狀進行關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)有15個位點與不同的性狀有著顯著相關性，其中6個AFLP位點可以用于分子標記輔助育種[28]。AFLP標記用到的選擇引物較少，并且可以在短時間內檢測大量的位點，作為一種高密度標記系統(tǒng)，結合關聯(lián)分析應用時，可以作為全基因組作圖和基因定位的一種補充手段，依然具有很大的應用價值。

3.2限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記與關聯(lián)分析

由于RFLP分子標記有限，因此其應用也是有限的，只能作為一種初級工具使用。Beer等利用64個燕麥地方品種分析13個QTL區(qū)域的RFLP位點與表型的相關性，在未考慮群體結構的前提下檢測到了較多的顯著關聯(lián)[29]。RFLP雖然應用有限，但是其結果穩(wěn)定、重復性好，在關聯(lián)分析中應用時，仍然可以作為分子標記輔助育種的手段。而且在鑒定外源染色體、確定易位系的易位斷點、定位外源基因和水稻秈粳分類及度量秈粳分化程度等方面也有很好的應用。

3.3SSR標記與關聯(lián)分析

SSR標記在關聯(lián)分析中的應用較多，在不同的作物中都有大量應用，并取得了豐碩的研究成果。2006年，F(xiàn)lavio等為了驗證已開發(fā)的18個SSR標記和籽粒性狀之間的關系，采用不同的小麥品種進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)其中有3個標記與籽粒寬度存在顯著關聯(lián)[30]。Parisseaux等利用全基因組掃描，對與玉米不同性狀相關的QTL進行圖譜定位查詢，將1 266個玉米品種自交系分為A～I 9個組，并對不同的組進行7年多地點試驗，用SSR標記對相關性狀進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與株高、黑穗病抗性、籽粒含水量相關聯(lián)的SSR標記分別有37、24、44個[31]。Malysheva-Otto 等對953個大麥栽培種進行研究，用48個SSR標記分析了它們在染色體上的LD水平，發(fā)現(xiàn)LD衰減的距離在 1～150cM，這表明其標記位點之間連鎖不緊密，LD水平較高[32]。劉新倫等對小麥99個SSR標記作關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，有16個標記與麥長管蚜抗性相關聯(lián)[33]。孫曉棠等對456 份水稻材料的144個SSR標記與紋枯病抗性進行關聯(lián)分析表明，有13個標記位點與紋枯病抗性顯著關聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)3個新的抗病相關位點[34]。范虎等利用SSR標記對大豆不同的農藝性狀進行關聯(lián)分析，共獲得51個與籽粒和花期等性狀相關聯(lián)的位點，其中與QTL定位一致的有16個[35]。左巧美等研究發(fā)現(xiàn)，有40個SSR位點與大豆生育期性狀關聯(lián)，與光溫反應值相關的位點有5個[36]。同樣是對大豆相關性狀的關聯(lián)分析，王歡等研究發(fā)現(xiàn)，有33個SSR標記位點與大豆花莢脫落性顯著相關[37]。陳氏秋江等對不同地區(qū)的540份水稻品種用262個SSR標記進行基因組變異掃描檢測到與粒長、粒寬、粒厚顯著相關的標記位點分別有45、7、11個[38]。賀道華等利用132個SSR標記，對92份栽培棉花進行全基因組掃描，獲得了21個與棉花纖維品質相關的SSR位點[39]。邵冰欣等利用SSR分子標記對134份陸地棉栽培種進行檢測，共檢測出148個多態(tài)性位點，涉及246個等位變異，關聯(lián)分析共發(fā)現(xiàn)與棉花耐鹽性狀相關的SSR分子標記位點有8個[40]。這些研究表明，關聯(lián)分析在探究標記與相關性狀的關聯(lián)性、發(fā)掘功能位點的研究中具有重要作用。

3.4SNP標記與關聯(lián)分析

單核苷酸多態(tài)性是由單堿基的轉化、顛換，以及單堿基的插入和缺失等改變引起的[41]，作為第3代標記類型，它比RFLP、SSR標記等更有優(yōu)勢，是目前所有標記類型中精確度最高的標記類型。隨著大量SNP標記的開發(fā)，基于SNP標記的關聯(lián)分析成為研究植物數(shù)量性狀的重要手段。

Christian等利用56 110個SNP 標記對289份玉米自交系的表型和生理性狀進行全基因組關聯(lián)分析，最后找到15個SNP標記與生理性狀顯著關聯(lián)[42]。Aranzana等為了研究擬南芥的花期和抗病性與SNP位點的相關性，利用覆蓋全基因組的2 553個SNP標記作關聯(lián)分析，結果表明有4個基因與目標性狀存在關聯(lián)[43]。姚玉瑩對水稻作全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在檢測到的48個SNPs中有6個與水稻種質資源農藝性狀顯著相關[44]。Beló等鑒定出了與油酸含量相關的主效位點[45]，采用全基因組掃描的方法，對553份優(yōu)良自交系的 8 950 個SNP位點與油酸性狀進行關聯(lián)分析表明，1個油酸去飽和酶基因[WTBX][STBX]fad2[WTBZ][STBZ]與油酸含量相關聯(lián)。任鳳陽用玉米10條染色體上的35 171個SNP標記對172 份玉米自交系在干旱脅迫條件下的相對發(fā)芽率、相對活力指數(shù)以及綜合指標進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與3個指標相關聯(lián)的標記有114個，其中20個SNP標記與相對發(fā)芽率關聯(lián)、53個SNP標記與相對活力指數(shù)關聯(lián)、41個SNP 標記與綜合指標關聯(lián)[46]。Hao等對191個大豆地方品種的209個單倍型和1 536個SNP位點分析，得到與產量性狀顯著相關的19個SNP標記位點[47]。姜曉東等通過對58份大麥品種中[WTBX][STBX]Amy6-4[WTBZ][STBZ]基因核苷酸多態(tài)性與α-淀粉酶活性的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，[WTBX][STBX]Amy6-4[WTBZ][STBZ] 基因的7個SNP 位點及其構成的單倍型均與酶活性無關聯(lián)性[48]。

在植物遺傳研究中，各種類型的分子標記不斷被發(fā)現(xiàn)，特別是SNP高密度圖譜構建，對目標QTL的定位越來越精細。關聯(lián)分析在QTL定位中的應用也日趨成熟，已經由最初應用于候選基因的功能驗證發(fā)展為全基因組關聯(lián)分析，成為挖掘作物數(shù)量性狀新基因的強力工具。如在玉米的研究中，美國農業(yè)部建立了代表全球玉米種質多樣性的巢式關聯(lián)圖譜群體，并通過全基因組關聯(lián)分析鑒定了1批與農藝性狀相關的QTL。目前，基于分子標記的關聯(lián)分析已經得到了十分廣泛的應用，通過關聯(lián)分析可以找到與性狀相關的位點、實現(xiàn)標記的精確定位，也能夠對候選基因進行多態(tài)性分析、驗證候選基因功能。利用連鎖分析作圖，一般其QTL位點目的基因之間的圖距都比較大，而關聯(lián)分析鑒定標記則可以達到單基因水平，使精度得到很大的提升，在分子標記輔助育種（molecular assisted selection，MAS）中可極大地提高選擇的目的性和準確性，進而提高育種效率。分子標記在關聯(lián)分析中的應用價值巨大，可以明確目的基因與目標性狀之間的內在關系、鑒定評價多個基因等。通過關聯(lián)分析對大量等位基因分析，不但有助于了解不同基因變異對基因功能的影響，同時還可以通過基因變異發(fā)現(xiàn)最適合的等位基因，為深入了解植物數(shù)量性狀、作物數(shù)量性狀的遺傳改良提供新的手段。

另外，關聯(lián)分析在功能基因的驗證上也得到了很好的應用。由于植物的很多性狀都屬于數(shù)量性狀，由多個途徑共同控制，很難通過轉化的方法予以驗證。例如著名的“黃金水稻”，通過把控制類胡蘿卜素合成的4個基因同時轉入水稻，才獲得了能合成類胡蘿卜素的黃金水稻。在對目的基因的代謝網(wǎng)絡不清楚的情況下，可以用關聯(lián)分析技術來驗證，例如Palaisa對維生素A的2個限速酶基因[WTBX][STBX]Y1、PSY2[WTBZ][STBZ]在黃色玉米（含類胡蘿卜素）、白色玉米（不含類胡蘿卜素）中進行分析發(fā)現(xiàn)，[WTBX][STBX]Y1[WTBZ][STBZ]基因是控制類胡蘿卜素的關鍵基因，[WTBX][STBX]PSY2[WTBZ][STBZ]則可能是假基因[49]。

4存在的問題與展望

對植物基因組的研究目前正由簡單性狀到復雜性狀過渡，傳統(tǒng)的QTL已經逐漸失去優(yōu)勢，建立在“自然群體”上的關聯(lián)分析則成為研究的熱點。但是，關聯(lián)分析仍然存在一些問題，如關聯(lián)分析數(shù)據(jù)量太大，而統(tǒng)計處理的方法還有待提高；群體結構的影響；另外，對于遺傳多樣性不高的群體，關聯(lián)分析作圖并不理想。然而，隨著各種生物學手段和生物技術得到飛速發(fā)展、基因型分析技術和高通量測序技術的不斷提高，關聯(lián)分析必將在植物遺傳學研究中發(fā)揮更為重要的作用。與此同時，關聯(lián)分析在植物種質資源的遺傳改良和種質創(chuàng)新領域也有重大應用價值，關聯(lián)分析的應用大大加快了種質資源的研究進程（如核心種質資源庫的構建）。關聯(lián)分析技術雖然已有多項成功運用的報道，但是在植物上的應用還是相對較少，因此在植物遺傳領域具有巨大的應用價值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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