高等植物赤霉素生物合成關(guān)鍵組分GA20-oxidase 氧化酶基因的研究進(jìn)展

吳建明 陳榮發(fā) 黃杏 丘立杭 李楊瑞

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

綜述與專論

高等植物赤霉素生物合成關(guān)鍵組分GA20-oxidase 氧化酶基因的研究進(jìn)展

吳建明 陳榮發(fā) 黃杏 丘立杭 李楊瑞

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

GA-20氧化酶（GA-20 oxidase）是重要的GA生物合成和調(diào)控酶，直接催化生成有生物活性的GAs，是一種多功能酶，最顯著的特點就是負(fù)反饋調(diào)節(jié)。GA20-氧化酶在植物發(fā)育和生理過程中起著重要的調(diào)控作用。綜述了高等植物體內(nèi)GA20氧化酶基因的克隆及表達(dá)調(diào)控研究及其對株高、纖維、開花、產(chǎn)量性狀等影響，重點闡述了GA20氧化酶基因與激素、光周期、抗性等之間的相互作用，以便更好地揭示GA-20氧化酶信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)及其作用機(jī)制。

植物激素；赤霉素合成酶；GA-20氧化酶；基因

赤霉素是種類最多的植物激素，作用于高等植物的整個生命周期，在植物節(jié)間伸長、纖維發(fā)育、葉片生長、開花結(jié)果、打破種子休眠等方面具有顯著調(diào)控作用。目前，已知有136種天然赤霉素，但在植物中只有少數(shù)GA分子（如GA1、GA3、GA4和GA7等）具有生物活性［1］。植物體內(nèi)赤霉素的

生物合成受到許多酶的調(diào)控，如牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶、古巴焦磷酸合成酶、GA20-氧化酶、GA3-氧化酶等［2］。GA-20氧化酶是赤霉素合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控酶，在赤霉素合成最后步驟中行使限速酶的作用從而控制赤霉素的含量。GA-20氧化酶影響植物生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，這個過程在時間和空間上都受到嚴(yán)格而精密的調(diào)控，內(nèi)源 GA 對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)及外界環(huán)境因子對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)都與 GA20-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。要了解這一復(fù)雜的過程，分離并鑒定基因功能尤為重要。多種因素直接或間接通過影響赤霉素生物合成中關(guān)鍵酶GA-20氧化酶基因的表達(dá)，調(diào)控赤霉素生物合成，維持植物體內(nèi)赤霉素動態(tài)平衡。隨著不同植物GA-20氧化酶基因研究的深入，尤其是植物中的各種 GA20-ox 基因的克隆和 GA 突變體的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為在分子水平上揭示 GA20-氧化酶的作用與功能提供了重要依據(jù)。本文總結(jié)了高等植物體內(nèi)GA20氧化酶基因的克隆及表達(dá)調(diào)控研究，闡述了GA20氧化酶基因與株高、纖維、花、果等性狀的關(guān)系，及其與其他因子之間的相互作用，以便更好地揭示GA-20氧化酶信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)及其作用機(jī)制。

1 GA20-oxidase在赤霉素合成途徑中的作用

GA-20氧化酶（GA-20 oxidase）是重要的GA生物合成和調(diào)控酶，屬于可溶性的雙加氧酶，它由小的多基因家族編碼，而基因家庭成員的表達(dá)模式既重疊又存在區(qū)別［3］。GA-20氧化酶影響赤霉素生物合成的第三個階段，通過GA20氧化酶和GA3 氧化酶催化C20-GA分子經(jīng)過連續(xù)的氧化后脫去CO2而生成C19-GA分子。主要通過兩種途徑13-羥化和非13-羥化形成中間產(chǎn)物GA53和GA12。南瓜、擬南芥、豌豆等植物的GA20-氧化酶對GA12的親和力高于對GA53，所以主要通過非13-羥化途徑形成GAs［4，5］；而水稻剛好相反，GA 20-氧化酶對GA53親和力高于GA12，主要是通過13-羥化途徑形成GAs［6］；當(dāng)然也有一些特殊的植物如西胡蘆的GA-20氧化酶催化形成非活性的GAs［7］。GA-20氧化酶的催化作用需要2-酮戊二酸和氧分子作為輔底物，F(xiàn)e2+和抗壞血酸為輔因子的參與，從GA12到具有生物活性的GAs 的形成涉及3 種雙加氧酶，即GA 13-羥化酶（GA 13-oxidase，GA13ox）、GA 20-氧化酶（GA 20-oxidase，GA20ox）和GA 3β-羥化酶（GA 3-氧化酶，GA 3-oxidase，GA3ox）。首先，GA12通過GA13ox 被氧化成GA53；其次，GA12和GA53經(jīng)GA20ox 和GA3ox 催化形成多種GA 中間產(chǎn)物和生物活性的GAs（GA1和GA4）；最后，經(jīng)另外一個雙加氧酶GA 2β-羥化酶（GA 2-oxidase，GA2ox）分別將生物活性的GA1和GA4催化為GA8和GA34代謝產(chǎn)物。GA12和GA53可以經(jīng)羥基化（R = OH）和非羥基化（R = H）2 種途徑催化形成一系列 GAs［8］。

2 GA20-oxidase基因克隆及序列比較

1994 年，首次從南瓜中分離出GA20-oxidase基因［4］，隨后在擬南芥［9］、菠菜［10］、水稻［6］、煙草［11］、豌豆［12］、番茄［13］、西瓜［14］、馬鈴薯［15］、柑橘［16］、萵苣［17］和黑麥草［18］等植物中相繼被克隆。近年來，越來越多植物的GA20-oxidase基因被克隆和進(jìn)行生物信息學(xué)分析，如玉米［19］、簇毛麥［20］、菊花［21］、結(jié)縷草［22］、西谷椰子［23］、葡萄［24］、矮牽牛［25］、蘋果［26］、荔波連蕊茶［27］和番荔枝［28］。GA20-oxidase 由小基因家族編碼，一般為3-5個基因家族成員如擬南芥有 5個基因家族成員，水稻有 4 個［29］。我們克隆到了甘蔗GA20 氧化酶基因片段，通過氨基酸序列比較結(jié)果表明，與玉米、高粱、結(jié)縷草、大麥、簇毛麥、小麥、水稻和黑麥草的同源性分別為89%、88%、81%、77%、77%、76%、76%和 75%［30］。GA20-oxidase氨基酸序列在不同的物種中同源性較低，為50%-60%，而基因家族成員間的同源性比較高，為65%-90%。通過比較不同植物的GA20-氧化酶氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，它們都有一些共同的保守基元，如與2-酮戊二酸結(jié)合有關(guān)的保守序列NYYPXCQKP，保守的H和D殘基；與GA底物結(jié)合有關(guān)的LPWKET基元［18］。

3 GA20-oxidase基因的表達(dá)

3.1 時空表達(dá)

每個基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的量，是受到時空等多種因素調(diào)控的，個體在不同的生長發(fā)育階段，或者不同的組織水平，基因轉(zhuǎn)錄出mRNA的量都是不一樣的。擬南芥GA 20-氧化酶基因家族中ATGA20ox1在莖和花序中表達(dá)；ATGA20ox2在花和莢果中表達(dá)；ATGA20ox3只在莢果中表達(dá)［10］。楊樹中的GA20ox1基因在所有組織中均有表達(dá)，但不同品種表達(dá)模式不一樣，如歐美洲雜種山楊PttGA20ox1基因在分生組織中及伸長的節(jié)間、葉片和根中表達(dá)［31］；小黑楊PnsGA20ox1均是在成熟木質(zhì)部中表達(dá)豐度最高［32］；小葉楊的PsGA20ox在未成熟木質(zhì)部和嫩葉中表達(dá)豐度較高，在頂端分生組織中有少量表達(dá)，在形成層組織中表達(dá)豐度極低［33］。柑橘、向日葵、荔波連蕊茶和觀賞羽衣甘藍(lán)等植物的GA20ox基因表達(dá)量最高的部位均是新梢或幼葉［34-37］。有些植物GA20ox基因在花和種子的表達(dá)量最高，如牽?；ǎ?8］、棉花［39］、蘋果［40］、葡萄［24］、黃瓜［41］和番荔枝等［28］。不同生長階段和不同品種GA20ox基因表達(dá)差異研究也有一些研究報道，簇毛麥DvGA20ox-1和DvGA20ox-2基因在葉片、葉鞘、莖、節(jié)間、根和花序中均有表達(dá)，在苗期、拔節(jié)初期和拔節(jié)中期3個生長階段兩個基因的表達(dá)相似，整個生育期DvGA20ox-1和DvGA20ox-2在葉片顯下降趨勢，在莖中、莖節(jié)和花序呈上升趨勢；然而幼苗期到抽穗期這兩個基因在根中是首先呈上升然后下降［42］。對4個不同的山茶品種的GA20ox表達(dá)研究表明，喬木類的浙江紅山茶（C. chekiangoleosa）GA20ox1 表達(dá)量最高；其次是岳麓連蕊茶（C. handelii）及金花茶（C.nitidissima），表達(dá)量最低的為矮生品種‘恨天高’［43］。從上述研究表明，GA20ox基因主要在幼葉、種子、新梢、莖及花等器官中具有較高的表達(dá)量，如柑桔和向日葵等植物主要是在新梢或生長點的表達(dá)最高；牽?；?、蘋果、黃瓜和番荔枝等植物主要是在種子的表達(dá)最高；其他作物如楊樹在木質(zhì)部表達(dá)量最高，而觀賞羽衣甘藍(lán)在花中表達(dá)量高。GA20基因家族不同成員之間表達(dá)模式也不一樣。

3.2 光周期調(diào)控表達(dá)

光作為植物生長必不可少的物理因素，不僅參與光合作用，還影響光合作用和光形態(tài)建成的相關(guān)基因表達(dá)，且其復(fù)雜的過程往往涉及相關(guān)基因的調(diào)控。光能影響植物的生長發(fā)育，而光的調(diào)控和植物體內(nèi)的赤霉素含量有關(guān)，赤霉素含量又受到GA-20氧化酶基因的影響。光對植物GA合成的影響主要體現(xiàn)在光影響GA20-氧化酶、GA3-氧化酶和GA2氧化酶等基因的表達(dá)和翻譯［44］。日照時間對于植物來說，是一個非常重要的因素，影響植物的生長發(fā)育。日照長短影響GA20-氧化酶基因表達(dá)，長日照條件下促進(jìn)基因表達(dá)，而短日照條件下抑制表達(dá)，這已經(jīng)對許多植物的研究得到證實，如菠菜［45-47］、擬南芥［5］、馬鈴薯［48］和白楊［31］等。光的強(qiáng)度也影響GA20-氧化酶基因表達(dá)。豌豆幼苗從低光強(qiáng)到高光強(qiáng)，GA20-氧化酶濃度增加了7 倍，而生長在黑暗條件下的豌豆幼苗 GA20 含量是高光強(qiáng)下的 25%，這可以說明 GA20-氧化酶對光強(qiáng)的敏感程度［49］。馬鈴薯的StGA20ox1基因表達(dá)在光條件下上調(diào)，而在黑暗中下調(diào)［50］。黃化豌豆苗GA 20-氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平低于正常苗，但將黃化豌豆轉(zhuǎn)到光下4 h后基因轉(zhuǎn)錄水平增加5倍［51］，說明GA20-氧化酶基因受到光強(qiáng)的正調(diào)控。另外，GA20-氧化酶基因還受到光質(zhì)的影響，GA20ox1在藍(lán)光下抑制表達(dá)需要隱花素來介導(dǎo)［52］。從這些研究結(jié)果表明，光可以影響植物赤霉素的合成與代謝，而這個過程可能是通過光信號接收影響赤霉素合成酶的活性，進(jìn)而影響GA20ox基因表達(dá)。

3.3 激素和其他因子的調(diào)控

3.3.1 激素的調(diào)控 赤霉素與其他激素存在相互作用，共同調(diào)控植物的生長發(fā)育。GA20-氧化酶 基因受到植物激素，如赤霉素、生長素和脫落酸等的影響。GA4處理擬南芥后GA 20-oxidase基因的表達(dá)水平降低，說明GA 20-oxidase基因的表達(dá)受到赤霉素的反饋調(diào)節(jié)［5］。水稻GA20基因在兩個赤霉素缺失型突變體的表達(dá)量高于正常植株，赤霉素合成抑制劑唏效唑處理增加基因的表達(dá)量，而外源赤霉素處理則減少基因表達(dá)量，說明Os20ox基因是調(diào)節(jié)赤霉素生物活性水平，受到赤霉素的反饋調(diào)節(jié)［6］。在4℃、赤霉素或乙烯利處理打破山毛櫸種子休眠條件下，F(xiàn)sGA20ox1轉(zhuǎn)錄組下調(diào)，然而，在多效唑或茉莉酸處理下，F(xiàn)sGA20ox1轉(zhuǎn)錄組急劇增加［53］。用赤霉素的抑制劑處理向日葵影響HaGA20ox2基因表達(dá)，抑制生物活性赤霉素合成，但HaGA20ox1基因沒有影響［35］。我們研究結(jié)果也表明，甘蔗用赤霉素處理后GA20ox基因表達(dá)量持續(xù)下降，在6 h達(dá)到最低值，12 h后逐漸上升，但到48 h又明顯下降，所有處理的表達(dá)量均低于未處理，6、12、24和48 h比對照的表達(dá)量分別下降了24.75%、13.18%、10.23%和20.34%［30］。GA3處理不同水稻品種的表達(dá)研究表明，日本晴GA20ox2基因表達(dá)略微下調(diào)，其余4個品種的GA20ox2基因表達(dá)上調(diào)；ABA處理抑制GA20ox2基因表達(dá)［54］?；ㄇ?4 d赤霉素處理葡萄的花序，分析5個VvGA20ox基因在花前14 d和花后5 d這段時間的表達(dá)情況，結(jié)果VvGA20ox3在花前5 d的表達(dá)量比其他家族成員高；在花完全展開時VvGA20ox3表達(dá)被下調(diào)，其他VvGA20oxs基因在接近花完全展開就被下調(diào)［55］。從上述研究結(jié)果可看出，GA20ox基因受到外源赤霉素的抑制，當(dāng)然也有一些特例，如楊艷華等研究結(jié)果表明，有些水稻品種受GA3上調(diào)，而赤霉素的抑制劑則上調(diào)GA20ox基因的表達(dá)，但不同基因的表達(dá)模式不一樣。

研究發(fā)現(xiàn)生長素（IAA）會影響赤霉素代謝途徑部分酶的表達(dá)，如 IAA 促進(jìn)豌豆 GA20ox 和 GA3ox的表達(dá)，并抑制 GA20ox 的表達(dá)。吲哚乙酸處理擬南芥幼苗后放于光照條件下，AtGA20ox1基因的表達(dá)量提高［56］。萘乙酸處理擬南芥24 h后，AtGA20ox1和AtGA20ox2的表達(dá)水平均提高［57］。4種生長素的類似物（4-Cl-IAA，IAA；4-Me-IAA，4-Et-IAA 和4-F-IAA）處理碗豆種子24 h，結(jié)果表明，4種生長素類似物均促進(jìn)果皮PsGA20ox1基因的表達(dá)，4-Cl-IAA促進(jìn)PsGA20ox1基因在果皮的表達(dá)量最高，果皮生長也最明顯，但生長素沒有影響；4-Me-IAA是第2個促進(jìn)PsGA20ox1基因的表達(dá)，4-Et-IAA 和4-F-IAA對種皮PsGA20ox1的基因表達(dá)影響最小，對于果皮生長的影響也是最小；在低濃度的4-Cl-IAA（30-300 mg/L）處理下果皮PsGA20ox1基因表達(dá)水平和4-Cl-IAA含量都顯示瞬時增加［58］。

油菜素內(nèi)酯（BR）上調(diào)GA20ox基因表達(dá)，擬南芥油菜素內(nèi)酯缺陷突變體噴施 BR 則上調(diào)AtGA20oxl 的表達(dá)量［59］。擬南芥BR不敏感突變體的幼苗中，GA20ox1 mRNA總量下降，外源BR處理可提高GA20ox1的表達(dá)。在BR和GA合成雙突變體中，也能觀察到BR對GA20ox1 mRNA的誘導(dǎo)作用，表明BR 對GA20ox1表達(dá)水平的調(diào)控作用不依賴于GA［60，61］。

其他如細(xì)胞分裂素、ABA也影響GA20ox基因表達(dá)。用細(xì)胞分裂素處理的擬南芥基因組表達(dá)譜表明，細(xì)胞分裂素能夠抑制 GA20ox和 GA3ox 的表達(dá)，同時促進(jìn) RGA 和 GAI 的表達(dá)［62］。擬南芥GA20ox3在ABA 處理下轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果顯示，GA20ox3 轉(zhuǎn)錄水平在 ABA 處理下有所上升，說明 GA20ox3 蛋白的表達(dá)很有可能在轉(zhuǎn)錄水平就受到ABA 的調(diào)控［63］。

3.3.2 其他因素的調(diào)控 GA20-氧化酶基因還受到溫度、病毒等因素的影響。在擬南芥中，低溫處理可提高AtGA20ox1、AtGA20ox2的表達(dá)，進(jìn)而提高活性GA的濃度；高溫抑制擬南芥AtGA20ox1，AtGA20ox2和AtGA20ox3基因的表達(dá)，從而引起內(nèi)源活性赤霉素含量降低［64］。高溫處理枳橙提高莖尖CcGA20ox1基因表達(dá)水平；感染裂皮類病毒，導(dǎo)致枳橙莖尖CcGA20ox1基因表達(dá)水平減少，GA1含量也減少，說明GA1含量和CcGA20ox1基因表達(dá)相關(guān)，溫度和裂皮類病毒抑制柑桔的生長可能部分是由于調(diào)節(jié)GA20ox基因的表達(dá)引起［34］。

4 GA20-oxidase基因的功能

4.1 GA20-oxidase與植物株高的關(guān)系

株高是作物品種一個重要的農(nóng)藝性狀，傳統(tǒng)高稈作物品種植株過高會容易引起倒伏，半矮稈品種是現(xiàn)代育種的重要方向。因此，發(fā)掘和鑒定控制植物株高的基因，開展影響株高基因的定向改良，具有重要的意義。GA20-oxidase基因與植物株高的關(guān)系已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，特別是在水稻、擬南芥及番茄等植物中得到了系統(tǒng)的研究。

4.1.1 水稻GA20-oxidase與株高的關(guān)系研究 水稻矮化現(xiàn)象與GA20ox基因相關(guān)密切，OsGA20ox2基因的缺失突變體就是水稻的sd1矮化突變體，矮化表型植株中GA53含量積累，而主要產(chǎn)物GA20和GA1水平下降，推測半矮化表型是延伸莖中生物活性GA 降低所致［65］。水稻GA20ox2基因轉(zhuǎn)基因研究表明，正義轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出植株增高，反義轉(zhuǎn)化表達(dá)現(xiàn)植株明顯“矮化”［66-71］。但多數(shù)研究主要是針對OsGA20ox2與株高的關(guān)系［70］，而其他家族成員與株高的關(guān)系研究鮮有報道。

4.1.2 擬南芥GA20ox基因與株高的關(guān)系研究 在擬南芥發(fā)現(xiàn)AtGA20ox基因與GA5 基因位點緊密相連，擬南芥ga5 半矮化突變體是由AtGA20ox 基因突變導(dǎo)致［4］。擬南芥GA20-oxidase超表達(dá)轉(zhuǎn)化增加了轉(zhuǎn)基因苗的內(nèi)源赤酶素含量而引起的赤霉素過量的表型，使轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出子葉和下胚軸伸長，提前開花，莖伸長，纖維變長等特性［72-74］。擬南芥GA20ox基因家族不同成員之間的功能不同，反義AtGA20ox1轉(zhuǎn)基因株系，呈現(xiàn)下胚軸縮短和減少節(jié)間伸長；在短日照，開花推遲和節(jié)間伸長受阻較大；反義AtGA20ox2轉(zhuǎn)基因株系，在長日照，外型沒有明顯影響，但在短日照條件下，轉(zhuǎn)基因株系株高減少20%；反義AtGA20ox3轉(zhuǎn)基因株系其表型與WT沒有明顯差異［73］。用反義遺傳學(xué)分析擬南芥AtGA20ox1和AtGA20ox2的生理功能，結(jié)果表明，AtGA20ox1和AtGA20ox2過量促進(jìn)下胚軸伸長、節(jié)間伸長、提早開花、花藥花絲伸長、增加種子數(shù)量、果實伸長；AtGA20ox1主要是促進(jìn)節(jié)間伸長和纖維伸長，AtGA20ox2主要影響花期和果實長度［75］。閆春霞等［76］獲得了TSN1/TSN2雙基因沉默的RNAi轉(zhuǎn)基因植株以及TSN1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因（OE）植株，通過實時定量PCR分析了TSN與GA20ox3的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在RNAi轉(zhuǎn)基因植株中，GA20ox3的轉(zhuǎn)錄本水平下調(diào)；而在TSN1OE植株中，GA20ox3轉(zhuǎn)錄本水平上調(diào)。同時對TSN1/TSN2RNAi植株和TSN1OE植株的表型進(jìn)行了分析。在正常生長條件下，與野生型（WT）相比，TSN1OE植株表現(xiàn)出了萌發(fā)提前、主根較長、葉片較大、株高更高以及開花提前等GA過量的表型。從上面研究表明，擬南芥中有5個GA20ox 基因（AtGA20ox1-AtGA20ox5），轉(zhuǎn)錄分析顯示它們有不同表達(dá)模式，并且在GA 調(diào)控發(fā)育過程中起不同作用，GA20ox1在對株高的影響上起主要作用；AtGA20ox2對株高影響較小，主要影響花期和果實長度，AtGA20ox3對株高的影響存在不同研究觀點，而關(guān)于AtGA20ox4 和AtGA20ox5對株高的影響還有待進(jìn)一步研究驗證。

4.1.3 蔬菜作物GA20ox與株高的關(guān)系 用RNA干擾技術(shù)抑制番茄3個基因，即GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3，結(jié)果表明，抑制GA20ox1或GA20ox2使得轉(zhuǎn)基因植株的莖變短、節(jié)間伸長減少、深綠葉變?。欢种艷A20ox3 轉(zhuǎn)基因植株的莖和葉都沒有改變；3種轉(zhuǎn)基因株系均能開花和正常結(jié)實，但這些轉(zhuǎn)基因株系發(fā)芽比正常植株慢，生長點內(nèi)源GAs減少［77］。通過構(gòu)建甘藍(lán)BoDWARF、BoGA20ox 和BoSP 3個基因RNAi干擾共同載體，然后轉(zhuǎn)入羽衣甘藍(lán)植物，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株變小、生長變慢、加速根的形成和提早開花；且轉(zhuǎn)基因植株的油菜素內(nèi)脂和赤霉素含量在葉和花芽是顯著減少，這些研究結(jié)果說明，BoDWARF、BoGA20ox 和 BoSP 3個基因在對植物的株型構(gòu)成具有重要作用［36］。從上述研究表明，GA20ox基因沉默或干擾抑制后，轉(zhuǎn)基因植株的株高變短，過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株增高，這些研究結(jié)果在水稻和擬南芥中已經(jīng)得到大量的研究證實。說明GA20ox基因與植株高度呈正相關(guān)關(guān)系。但也有一些研究結(jié)果與之相反，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株變矮如黃瓜［40］、南瓜［16，78，79］。而且GA20氧化酶基因家族成員之間的功能也有很大的差異，如抑制番茄3個基因GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3，結(jié)果是抑制GA20ox1和GA20ox2莖變短和節(jié)間伸長減少，而對GA20ox3沒有影響。

4.1.4 果樹作物GA20ox與株高的關(guān)系 果樹作物GA20ox基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，大部分結(jié)果均表明，過量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株體內(nèi) GA含量明顯提高，且植株變高如柑桔的CcGA20ox1［15，80］、枳橙的GA20ox，而抑制基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株變矮［81］。通過不同生長類型梨品種中不同時期新梢葉片中的PcGA20ox1基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明，在中矮1號、親本錦香和對照早酥3個品種不同發(fā)育階段新梢葉片中的表達(dá)強(qiáng)度均為中矮1號＞錦香＞早酥，與植株高矮表現(xiàn)一致，表明PcGA20ox1基因的表達(dá)強(qiáng)弱與植株高矮相關(guān)［82］。但也有相駁的研究結(jié)果，對蘋果砧木不同材料的植株生長量測定和相對定量表達(dá)結(jié)果表明，MdGA20ox1 基因在砧木 SH28、SH40 和 M26自根苗的表達(dá)呈先下降再上升然后下降的趨勢，這與其生長動態(tài)基本一致；嘎啦/SH28 的植株生長量MdGA20ox1 表達(dá)量最高，嘎啦/M26 次之，嘎啦/SH40 最低，初步表明該基因的表達(dá)有與蘋果植株矮化程度呈負(fù)相關(guān)的趨勢［26］。說明不同類型果樹的GA20ox基因與株高的關(guān)系的差異較大，但目前研究主要集中于GA20ox1，而對其他家族成員的研究極少見有相關(guān)報道。

4.1.5 其他植物GA20ox與株高的關(guān)系 近年來，其他如楊樹、茶樹和棉花等植物的GA20ox與株高的關(guān)系也得到了進(jìn)一步研究，結(jié)果均表明，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株變高如棉花［83］、雜交楊［84，85］、毛白楊［86］、結(jié)縷草［87］和山茶［43］，而反義轉(zhuǎn)基因植株顯矮化如煙草［3］和結(jié)縷［87］。但主要是對GA20ox1基因的研究較多，而對其他家族成員的研究鮮有報道。荔波連蕊茶 ClGA20ox1、ClGA20ox2基因的正義轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)量均顯著提高，其中 ClGA20OX1基因在轉(zhuǎn)基因植株中最高表達(dá)量是 149；ClGA20ox2 基因的表達(dá)量達(dá)到 144，隨著 ClGA20ox1 和 ClGA20ox2 基因的表達(dá)量提高，轉(zhuǎn)基因煙草植株節(jié)間伸長和株高增加等表型更加明顯［28］。

4.2 GA20-oxidase與植物纖維的關(guān)系

赤霉素對棉纖維的起始、分化和發(fā)育有很大影響，它可明顯改變生殖發(fā)育的起止時間，也影響細(xì)胞分裂和伸長［88］。棉花GhGA20ox1基因在胚珠和纖維中優(yōu)勢表達(dá)，在纖維伸長期表達(dá)量最高；GhGA20ox2基因也在胚珠和纖維中優(yōu)勢表達(dá)，但其表達(dá)范圍比GhGA20ox1更廣，在根和次生壁厚期的纖維中也有一定的表達(dá)量［39］。棉花GhGA20ox1基因的超量表達(dá)和RNA干擾對棉花（特別是纖維）發(fā)育的影響，結(jié)果表明，超量表達(dá)的棉花表現(xiàn)出GA過量表達(dá)的性狀，如植株變高、節(jié)間伸長、葉片變小、現(xiàn)蕾開花晚、結(jié)實率低，并且纖維較野生型略長，種子略?。?9］。棉花GhGA20ox1超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因材料衣分下降，纖維變長，馬克隆值下降，纖維強(qiáng)度增加。對成熟纖維進(jìn)行組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，成熟纖維橫截面周長變短，纖維細(xì)胞壁厚度變薄。以上結(jié)果表明超量表達(dá)GhGA20ox1能促進(jìn)棉花纖維伸長，并抑制纖維細(xì)胞壁增厚，可能推遲轉(zhuǎn)基因棉纖維次生壁合成的起始時間［90］。小黑楊PnsGA20ox1正反義轉(zhuǎn)化煙草，測定過表達(dá)煙草植株及未轉(zhuǎn)基因煙草植株的綜纖維素含量、纖維長度和Klason木質(zhì)素含量，方差分析表明，轉(zhuǎn)基因煙草的Klason木質(zhì)素含量并無明顯變化，而綜纖維素含量和纖維長度比對照組均有顯著的提高，且不同株系之間也存在顯著差異。初步證明過表達(dá)PnsGA20ox1基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中對纖維素生物合成的影響有所不同，而對木質(zhì)素的生物合成并無明顯影響［91］。赤松GA20-ox1過量表達(dá)轉(zhuǎn)化白楊，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株膠質(zhì)纖維的提高，纖維細(xì)胞的次生壁增厚和伸長［92］。GA20ox1 超表達(dá)的玉米植株莖長而細(xì)，用化學(xué)分析超表達(dá)的玉米植株的質(zhì)量表明，具有更多的纖維素、木質(zhì)素和細(xì)胞壁的積累［93］。

4.3 GA20-oxidase與花、果、種子的關(guān)系

棉花GhGA20ox1超量表達(dá)植株的單鈴種子數(shù)比對照顯著減少，外施GA也使對照的單鈴種子數(shù)顯著減少。這說明超量表達(dá)GhGA20ox1基因和過量GA均能抑制棉花結(jié)實［39，42］。對棉花GhGA20ox1基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)化番茄，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因番茄果實變小，單個果實的種子數(shù)顯著減少［83］。對番茄3個GA20-oxidase RNAi轉(zhuǎn)基因植株的種子進(jìn)行了發(fā)芽實驗，結(jié)果表明，抑制GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3的表達(dá)影響種子萌發(fā)，種子萌發(fā)率降低，萌發(fā)時間推遲［77］。通過病毒誘導(dǎo)CaOvate基因沉默，改變了CaGA20ox1基因表達(dá)，導(dǎo)致延遲開花和影響辣椒果實的形成［94］。利用250個重組自雜系檢測水稻種子活力，對OsGA20ox1基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明，Dunghan Shali和重組自交系的基因表達(dá)水平高于Kakehashi品種，Dunghan Shali和重組自交系具有活性的赤霉素含量高于Kakehashi品種，這些結(jié)果說明，QTL侯選基因OsGA20ox1是主要控制種子活力［95］。馬鈴薯StGA20ox1反義轉(zhuǎn)基因植株與對照的莖相比較短，節(jié)間縮短，結(jié)薯早，產(chǎn)量增加，在頂端和第一葉片內(nèi)源GA20和GA1含量下降。這些結(jié)果說明，StGA20ox1基因誘導(dǎo)節(jié)間伸長和塊莖形成，但對塊莖休眠沒有影響［96］。柑桔CcGA20ox1轉(zhuǎn)番茄超表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株開花比野生型延遲，產(chǎn)量、植株結(jié)果數(shù)和果實無核率都提高［80］。番茄GA20ox1基因沉默不利花粉產(chǎn)生和嚴(yán)重阻礙種子萌發(fā)［97］。

4.4 GA20-oxidase與抗性的關(guān)系

水稻OsGA20ox2干擾轉(zhuǎn)基因植株提高了對稻瘟病和白葉枯病菌的抗性，增強(qiáng)防御相關(guān)基因的表達(dá)，相反的OsGA20ox3過量表達(dá)植株比野生型更容易受到病原體侵染，說明OsGA20ox3基因不僅影響株高，且影響抗病性［70］。干旱脅迫后，擬南芥GA20ox1 表達(dá)被下調(diào)，引起植株內(nèi)GA積累，生長受到抑制［98］。通過RT-PCR技術(shù)研究日本結(jié)縷草ZjGA20ox1基因在不同調(diào)控因素低溫（4℃）、氧化（H2O2）、鹽（NaCl）、干旱（PEG6000）和高溫（42℃）調(diào)控下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，日本結(jié)縷草在低溫（4℃）、干旱（PEG6000）和高溫（42℃）脅迫處理中，ZjGA20ox1表達(dá)明顯降低，而在鹽（NaCl）和氧化（H2O2）鹽脅迫中，ZjGA20ox1表達(dá)分別在10 h和5 h出現(xiàn)峰值［99］。研究了 GA與干早逆境之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，活性GA含量較高的株系GA20ox1過表達(dá)，對干旱逆境的忍耐性明顯下降；活性GA含量較低的株系GA20ox1和GA20ox2的雙突變體（ga20ox1/2）和GA20ox1、GA20ox2 和 GA20ox3的三突變體（ga20ox1/2/3）對干早逆境的忍耐性則明顯提高［100］。

4.5 GA20-oxidase與其他因子的互作

GA20-oxidase與其他因子之間的互作也對調(diào)節(jié)植物的發(fā)育起決定作用。在早期研究中發(fā)現(xiàn) POTH1與StGA20ox1存在一定關(guān)系，POTH1 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系中StGA20ox1表達(dá)量減少［101］。隨后研究發(fā)現(xiàn)，StBEL5 和 POTH1 都可以結(jié)合到StGA20ox1的啟動子區(qū)域，負(fù)調(diào)控StGA20ox1基因的表達(dá)。與StBEL5 和 POTH1 單獨存在相比，它們共存時與StGA20ox1 啟動子的結(jié)合更緊密［102］。2013年，有研究表明，StBEL5與StGA20ox1存在相關(guān)性，在StBEL5 過表達(dá)株系中，StGA2ox1 表達(dá)量上升，GA活性降低，促使匍匐莖向塊莖轉(zhuǎn)變［103］。通過染色體免疫共沉淀法證實AtGA20ox1作為擬南芥的赤霉素合成酶基因受到AiOFP1的調(diào)節(jié)，AtOFP1通過調(diào)節(jié)赤霉素生物合成進(jìn)而影響植物細(xì)胞伸長［104］。染色體免疫共沉淀實驗，結(jié)果表明，DELLA 蛋白可能結(jié)合到 GA3ox1 和 GA20ox2 基因啟動子上，調(diào)控這些基因的表達(dá)，實現(xiàn)反饋調(diào)節(jié)［105］。KN1是植物中第一個從玉米中克隆到的一個homeobox基因家族的基因，KNOX是KN1的同源基因，KNOX能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素在芽頂端表達(dá)，并能結(jié)合到 GA20-氧化酶基因的啟動子上，調(diào)控芽頂端分生組織的赤霉素合成，而 KINOXI 又會促進(jìn) GA2-氧化酶在此部位的表達(dá)［106］。另有研究表明，煙草的KNOX基因NTH15抑制GA20ox基因的表達(dá)，使其體內(nèi)GA1水平下降［107］。采用了 CPRG 法定量分析測定 AtGA20ox1啟動子與 AtMYB32 相互作用的強(qiáng)度，結(jié)果顯示二者的相互作用強(qiáng)［105］。RNA免疫共沉淀實驗證明TSN1在體內(nèi)能夠特異結(jié)合GA20ox3mRNA。mRNA降解的動力學(xué)分析實驗表明TSN1在體內(nèi)能夠穩(wěn)定GA20ox3的mRNA［76］。

5 展望

目前對GA20氧化酶基因的克隆、表達(dá)及功能已取得了較大的進(jìn)展，使得研究者在分子水平上認(rèn)識GA20氧化酶基因表達(dá)調(diào)控方式、功能鑒定及其代謝調(diào)節(jié)有了更深入的了解。但是仍然有很多問題有待研究。如GA20氧化酶基因家族成員之間各自的確切作用還不完全清楚，另外基因家族成員之間相互作用也有待進(jìn)一步研究驗證。GA20氧化酶基因和其他激素在分子水平上相互作用如何調(diào)控；GA20氧化酶基因與抗逆性的關(guān)系，這些問題都還需進(jìn)一步深入研究。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等研究手段的不斷發(fā)展，對 GA20代謝調(diào)控及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究將得到進(jìn)一步深入，這不僅有助于我們對GA20氧化酶的作用機(jī)理有更深了解，還將有助于我們利用基因工程手段定向改良作物提供理論指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Studies on the Gene of Key Component GA20-oxidase for Gibberellin Biosynthesis in Plant

WU Jian-ming CHEN Rong-fa HUANG Xing QIU Li-hang LI Yang-rui
（Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement of Guangxi（Ministry of Agriculture），Sugarcane Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 5300007）

GA20-oxidase，as a key synthetizing and regulating enzyme in the biosynthesis of gibberellic acid，directly regulates the generation of biological GAs. It is also a multifunctional enzyme，and its most important feature is negative feedback regulation. GA20-oxidase plays an important regulating role in the development and physiological processes of plants. This article summarizes the recent studies on the molecular cloning and regulating expression analysis of GA20-oxidase genes and their effects on plant height，fiber formation，flowering，yield traits，etc.，and explains the interactions of GA20-oxidase gene with hormones，photoperiod，stress resistance and other factors，aiming at revealing the signal network system and its mechanism of GA20-oxidase.

plant hormones；gibberellic acid synthetase；GA20-oxidase；gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.001

2016-02-24

國家自然科學(xué)基金項目（31360312），國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”計劃（2013AA102604），廣西自然科學(xué)基金重點項目（2015GXNSFDA139011），廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFBA118087），國際科技合作計劃（2013DFA31600），廣西八桂學(xué)者專項基金（2013），廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)展基金項目（2014YP03，2014YD02，2015YM13，2015YT03）

吳建明，男，博士，副研究員，研究方向：甘蔗栽培生理及生物分子學(xué)；E-mail：409395605@qq.com

李楊瑞，男，博士，教授，研究方向：甘蔗育種栽培；E-mail：liyr@gxaas.net