CRISPR/Cas系統(tǒng)
——基因組定向編輯新技術(shù)

曹 博 趙怡霞 江 嫚

(北京市第四中學(xué)順義分校 101318)

朱 琳

(陜西省勉縣第二中學(xué) 724200)

基因組編輯技術(shù)是利用核酸酶對(duì)基因組進(jìn)行定向編輯的技術(shù)，主要用于研究特定基因的功能[1]。目前用于基因組編輯的核酸酶主要分為三類：鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)和歸巢核酸內(nèi)切酶(engineered meganucleases)。近年來，在分子生物學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了一種新興的RNA導(dǎo)向的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)—— CRISPR/Cas[2]，該系統(tǒng)因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，迅速得到認(rèn)可，并在不同研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是指最初來自于E.coliK12 堿性磷酸酶基因附近區(qū)域的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列[3]，隨后發(fā)現(xiàn)約40%左右的已測(cè)序細(xì)菌基因組都存在CRISPR位點(diǎn)。Cas(CRISPR-associated nuclease)是存在于CRISPR位點(diǎn)附近的一系列保守基因，往往與重復(fù)序列相連，在 CRISPR 的防御體系中起關(guān)鍵作用。在Cas基因附近有一段幫助CRISPR RNA (crRNAs)成熟的轉(zhuǎn)錄活化RNA(tracrRNA)。通過CRISPR /Cas系統(tǒng)，細(xì)菌構(gòu)建了一種特殊的防御系統(tǒng)，進(jìn)而可以有效抵抗外源基因侵?jǐn)_。根據(jù)Cas基因核心元件的不同，CRISPR /Cas系統(tǒng)可以分為三種類型：I型、II型和III型。其中I型和III型需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，而II型只需要一個(gè)Cas9蛋白核酸酶進(jìn)行切割，因此成為目前應(yīng)用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統(tǒng)[4]。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)原理

II型CRISPR/Cas系統(tǒng)由三部分組成：tracrRNA、Cas9 核酸酶和pre-crRNA[5]，其具體作用機(jī)制可分為三個(gè)步驟：①適應(yīng)階段：Cas蛋白復(fù)合物靶向?qū)ふ也⒘呀馔庠椿蛑械脑烷g隔序列(protospacer)，隨后protospacer整合到CRISPR位點(diǎn)5′端，并被轉(zhuǎn)錄成crRNA。外源基因再次進(jìn)入時(shí)，CRISPR的重復(fù)序列會(huì)截取其中的一些片段，并將其轉(zhuǎn)錄形成pre-crRNA，之后與tracrRNA的重復(fù)序列結(jié)合。②成熟階段：pre-crRNA/tracrRNAs復(fù)合體在內(nèi)源 RNase III的作用下，位于5′末端的間隔序列被切除，形成成熟的 crRNA，并與 tracrRNA 形成向?qū)?RNA (sgRNA)。③干擾階段：成熟的sgRNA能夠招募 Cas9蛋白，形成crRNA-tracrRNA-Cas蛋白復(fù)合體，引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別并結(jié)合雙鏈DNA靶位點(diǎn)，接下來在原型間隔毗鄰序列(PAM)的上游 3～8 bp 位置對(duì)結(jié)合序列進(jìn)行切割。

crRNA-tracrRNA-Cas蛋白復(fù)合體對(duì)DNA序列進(jìn)行切割以后，會(huì)在特定的基因組位置造成DNA 雙鏈斷裂，進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的兩種DNA修復(fù)機(jī)制：同源重組或非同源末端連接，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)修飾[5]。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用

3.1 在生物學(xué)研究中的應(yīng)用 目前，使用CRISPR/Cas技術(shù)進(jìn)行的基因定點(diǎn)編輯已在包括動(dòng)物、植物、微生物等在內(nèi)的多個(gè)物種中廣泛應(yīng)用。在常見的細(xì)胞系如HEK293、U2OS、K562，以及經(jīng)典模式生物如小鼠、果蠅、線蟲、水稻、擬南芥、釀酒酵母、大腸桿菌等多種生物中進(jìn)行的基因編輯均獲得成功(表1)[5]。同時(shí)，我國科學(xué)家黃行許等在靈長類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的多位點(diǎn)基因編輯也獲得理想效果[6]，表明CRISPR/Cas系統(tǒng)及其作用機(jī)制在整個(gè)生物界具有普遍性。在CRISPR/Cas系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，研究者對(duì)其功能進(jìn)一步完善和開發(fā)[7]，例如，利用缺失核酸酶活性的Cas9(dCas9)與功能蛋白或RNA結(jié)合，可以調(diào)控基因的表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)；利用dCas9和向?qū)gRNA，可以將單個(gè)因子結(jié)合到特定位點(diǎn)，精確研究基因功能和調(diào)控機(jī)制。

3.2 在生物技術(shù)中的應(yīng)用 在生物技術(shù)研究方面，特別在疾病相關(guān)模型的構(gòu)建方面，CRISPR/Cas具有非常廣闊的應(yīng)用前景。例如，染色體易位常常與腫瘤的發(fā)生密不可分，利用CRISPR/Cas可以對(duì)腫瘤相關(guān)的染色體易位進(jìn)行精確研究。Choi等利用 CRISPR/Cas9將DSBs準(zhǔn)確引入人胚腎HEK293T細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞AALE中，模擬肺癌中ROS1基因和CD74基因的染色體易位，說明Cas9所誘導(dǎo)的雙鏈斷裂能夠?qū)崿F(xiàn)染色體靶向易位。隨后，Chen等和Torres等分別在白血病和尤文氏肉瘤的染色體易位中得到證實(shí)[1]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，Xue等和Heckl等在小鼠中分別建立了肝癌和髓系惡性腫瘤的致癌模型，顯示 CRISPR/Cas9可用于研究腫瘤發(fā)生過程中的基因重組機(jī)制[1]。

CRISPR/Cas9也是系統(tǒng)研究哺乳動(dòng)物基因功能的有力工具。Wang等和Zhou等創(chuàng)建了慢病毒聚焦型人源細(xì)胞sgRNA文庫，可以對(duì)功能基因進(jìn)行篩選，也可用于篩選與腫瘤細(xì)胞和多能干細(xì)胞細(xì)胞活性相關(guān)的基因[1]。利用這一工具，可以有效降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)，進(jìn)行大規(guī)模篩選藥物靶點(diǎn)以及非模式生物中的基因功能定位等研究。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可以用于真核生物基因表達(dá)的精確調(diào)控研究。Qi等人發(fā)現(xiàn)，缺失核酸內(nèi)切酶活性的dCas9可以形成復(fù)合體，與RNA聚合酶結(jié)合，從而特異性抑制轉(zhuǎn)錄延伸，表現(xiàn)為CRISPR干擾(CRISPRi)現(xiàn)象[8]。借助這一手段，Gilbert 等和Konermann等對(duì)KRAB和SID轉(zhuǎn)錄抑制因子進(jìn)行修飾，從而加強(qiáng)了表觀遺傳沉默程度[7]。同時(shí)，Cas9也可作為合成的轉(zhuǎn)錄激活因子，單一sgRNA導(dǎo)向的Cas9激活因子會(huì)引起特定內(nèi)源基因啟動(dòng)子的適度轉(zhuǎn)錄上調(diào)，若使用多個(gè)sgRNA聯(lián)合導(dǎo)向，則可呈現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，從而大大增強(qiáng)激活程度。

此外，CRISPR/Cas9在表觀遺傳調(diào)控方面的研究也取得了重要進(jìn)展。Cas9表觀遺傳因子(epiCas9s)可以在特定位點(diǎn)插入或去除特定的表觀遺傳標(biāo)記(甲基化、乙?；?，進(jìn)一步確定特定表觀遺傳標(biāo)記在整個(gè)基因組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。Kearns等通過將缺失核酸內(nèi)切酶活性的dCas9和組蛋白去甲基化酶結(jié)合，靶向多個(gè)基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，并闡明其作用機(jī)制，表明CRISPR/Cas9可作為研究表觀遺傳調(diào)控中單個(gè)標(biāo)記的重要工具[9]。

3.3 在疾病診療中的應(yīng)用 利用CRISPR-Cas9技術(shù)，可以對(duì)遺傳性疾病相關(guān)的基因突變進(jìn)行定點(diǎn)修復(fù)，并可破壞侵入的病毒基因組。例如，Wu等在小鼠中成功修復(fù)了與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)的Crygc基因。Schwank等通過同源重組的方法，在囊腫性纖維化病人的小腸干細(xì)胞中對(duì)相關(guān)的CFTR位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，這一研究不僅為體內(nèi)或體外干細(xì)胞中定向引入、修飾特定基因提供思路，也為獲得特定遺傳修飾的“類器官”(迷你器官)奠定基礎(chǔ)[1]。

利用CRISPR-Cas9技術(shù)在高等動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的多基因編輯也取得了突破性進(jìn)展。我國學(xué)者黃行許等成功利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)孿生的食蟹猴進(jìn)行基因修飾[6]，為世界上首次在靈長類動(dòng)物中進(jìn)行基因編輯，且同時(shí)進(jìn)行了三個(gè)基因的精確定向修飾，表明該技術(shù)在研究多基因引起的復(fù)雜的神經(jīng)疾病方面具有巨大潛力。

3.4 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，CRISPR-Cas9的研究主要集中在植物和真菌。例如，國內(nèi)高彩霞實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR-Cas 系統(tǒng)首次在植物中進(jìn)行定點(diǎn)突變。其中，在水稻和小麥中定點(diǎn)突變了OsPDS和TaMLO等5個(gè)基因，在水稻原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植株中均得到了較高的突變率[10]。同時(shí)，通過同源重組 DNA 修復(fù)途徑，利用單鏈寡核苷酸 DNA (ssDNA )作為模板，在基因特定位點(diǎn)精確插入 12bp限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，在世界上首次證實(shí)CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠用于作物基因組定點(diǎn)編輯，該技術(shù)的突破有望加速重要農(nóng)作物水稻、小麥性狀改良與分子定向育種。

利用CRISPR-Cas9技術(shù)在植物中進(jìn)行的基因定向編輯具有穩(wěn)定、持久等特點(diǎn)。Li等利用同源重組的方法，在擬南芥和本氏煙中成功進(jìn)行基因編輯，隨后在小麥、水稻、高粱、甜橙等不同的作物中均有報(bào)道[11]。Zhang等在水稻中利用guide RNA進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)約50%的胚細(xì)胞中靶基因被編輯，并且編輯發(fā)生在第一次細(xì)胞分裂之前[12]。進(jìn)一步研究表明，這些遺傳改變可以傳遞給下一代，不會(huì)出現(xiàn)變異或恢復(fù)，全基因組測(cè)序結(jié)果也顯示未出現(xiàn)大量脫靶現(xiàn)象。結(jié)果表明，植物本身進(jìn)化出來的防御病蟲害或極端環(huán)境的修飾機(jī)制，可能比其他技術(shù)性的修飾更容易。

4 CRISPR/Cas研究展望

作為一種新型的基因定向編輯技術(shù)，CRISPR/Cas已經(jīng)在動(dòng)物、植物、微生物等不同物種中獲得了巨大成功。隨著該技術(shù)的不斷普及，在動(dòng)植物基因功能領(lǐng)域即將迎來一次新的革命，從而為生物學(xué)研究帶來新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。與此同時(shí)，CRISPR/Cas也引發(fā)一些新的問題，例如，其本身存在的“脫靶效應(yīng)”、與胚胎細(xì)胞基因編輯相關(guān)的倫理學(xué)問題[5]等。但隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas技術(shù)將會(huì)逐步成熟和完善，更加有效地應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。