組織蛋白酶S在原發(fā)性干燥綜合征中的臨床意義

李　霞，張麗麗，費(fèi)允云，趙　巖

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome，pSS)是一種主要累及外分泌腺體的自身免疫性疾病，常伴抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)、抗SSA和(或)抗SSB抗體陽性，目前病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明。本研究通過探討pSS患者與健康對照組血清組織蛋白酶(Cathepsin，Cat) S的水平，分析Cat S與臨床疾病活動(dòng)度評分及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性，并檢測唇腺組織Cat S的表達(dá)。

資料和方法

對象和分組

pSS組：收集2014年12月至2015年12月于北京協(xié)和醫(yī)院門診就診的pSS患者，入選標(biāo)準(zhǔn)為符合2002年pSS國際分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]和2012年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)干燥綜合征分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，且均未經(jīng)過糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：頸、頭、面部放療史、丙型肝炎病毒感染、艾滋病、淋巴瘤、結(jié)節(jié)病、移植物抗宿主病、應(yīng)用抗乙酰膽堿藥(如阿托品、莨菪堿、顛茄等)。根據(jù)IgG水平，將pSS患者分為高免疫球蛋白(簡稱高球)組(IgG>25 g/L)和非高球組(IgG≤25 g/L)。

健康對照組：同期北京協(xié)和醫(yī)院健康體檢中心的體檢者，所有體檢者經(jīng)過詳細(xì)查體及實(shí)驗(yàn)室檢查，排除自身免疫性相關(guān)疾病及家族史，無心臟、肝腎疾病史，無過敏性疾病史等。

所有納入對象均經(jīng)過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且簽署知情同意書。

方法

資料收集：采集詳細(xì)的臨床資料，包括癥狀、體征，口腔科檢查(唾液流率、腮腺造影或唇腺活檢)、眼科檢查(膜破碎時(shí)間、Schirmmer試驗(yàn)、角膜熒光染色)，以及實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)(血常規(guī)、尿常規(guī)和沉渣分析、肝腎功能電解質(zhì)、免疫球蛋白及補(bǔ)體、ANA、類風(fēng)濕因子、抗SSA和抗SSB抗體、抗著絲點(diǎn)抗體)。此外，根據(jù)器官受累不同選擇性完善胸部高分辨CT、腎臟超聲等檢查。所有患者根據(jù)歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟pSS疾病活動(dòng)度(EULAR Sj?gren’s syndrome disease activity index，ESSDAI)評分[3]進(jìn)行評估。

標(biāo)本采集及酶聯(lián)免疫吸附法檢測：所有納入對象均采集清晨空腹靜脈血，經(jīng)離心取血清后立即凍存于-80℃冰箱以備后續(xù)檢測。酶聯(lián)免疫吸附法檢測總Cat S和pro-Cat S(R&D公司，貨號分別為DY1183和DY2223)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。兩者之差作為active-Cat S的結(jié)果。

免疫組化：選取pSS組患者有典型灶性淋巴細(xì)胞浸潤的唇腺活檢組織及單純口干癥患者作為對照，進(jìn)行Cat S (R&D公司，貨號AF1183)免疫組化，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一般資料

pSS組共37例患者，其中男1例，女36例，中位年齡47(21～77)歲。評估ESSDAI為(2.49±0.28)分。高球組5例，ESSDAI為(4.40±2.07)分；非高球組32例，ESSDAI為(2.21±1.55)分，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

健康對照組男性2例，女性31例，中位年齡45(25～67)歲。pSS組和健康對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

血清總Cat S、pro-Cat S和active-Cat S水平比較

pSS組血清總Cat S、pro-Cat S和active-Cat S表達(dá)水平高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

表1　pSS組與健康對照組血清Cat S水平比較

Cat S：組織蛋白酶S；pSS：原發(fā)性干燥綜合征

37例pSS患者，高球組和非高球組血清總Cat S、pro-Cat S和active-Cat S水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

Cat S水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

pSS患者血清總Cat S、pro-Cat S和active-Cat S與血清IgG水平、ESSDAI評分之間無相關(guān)性(圖1)。

血清Cat S預(yù)測pSS診斷

以2002年pSS國際分類診斷標(biāo)準(zhǔn)作為參照，ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清總Cat S、pro-Cat S和active-Cat S水平pSS組和健康對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表3、圖2)。

唇腺組織免疫組化分析

pSS患者唇腺組織腺上皮細(xì)胞(圖3A-a)、淋巴細(xì)胞(圖3A-b)和導(dǎo)管上皮細(xì)胞(圖3A-c)均有Cat S表達(dá)；口干癥者顯示散在淋巴細(xì)胞浸潤，并未見明顯Cat S表達(dá)(圖3B)。

討　　論

pSS是一種主要侵犯外分泌腺體的慢性、自身免疫性疾病，又名為自身免疫性外分泌腺體上皮細(xì)胞炎?；颊哐逯卸啻嬖诙嗫寺「呙庖咔虻鞍籽Y以及多種自身抗體如ANA、抗SSA和(或)抗SSB抗體及抗著絲點(diǎn)抗體等的陽性，提示B細(xì)胞高度活化是疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一[4]。而自身抗原通過抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)的提呈，是B細(xì)胞活化的早期重要步驟[5]。

Cat S作為組織蛋白酶家族中的一員，于20世紀(jì)70年代首先在造血細(xì)胞的內(nèi)體中被發(fā)現(xiàn)[6]，主要表達(dá)在人體的專職APC如B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中，也表達(dá)于非專職APC如上皮細(xì)胞中，在體內(nèi)自身抗原提呈、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、損傷修復(fù)、血管生成等多種病理和生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[7]，提示其可能參與自身免疫性疾病的發(fā)病過程。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清Cat S表達(dá)升高，與疾病活動(dòng)度具有弱相關(guān)性[8]；而在國內(nèi)pSS研究中尚未見報(bào)道。深入研究Cat S在pSS表達(dá)水平的變化，可為其診斷以及治療提供新的生物學(xué)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[9]。

表2　pSS高球組和非高球組ESSDAI及血清Cat S水平比較

Cat S：組織蛋白酶S

圖1pSS組血清總Cat S，pro-Cat S和active-Cat S水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

FigFig1Correlation analysis between the serum total-，pro- and active-Cat S with serum IgG and ESSDAI

Cat S：組織蛋白酶S；pSS：原發(fā)性干燥綜合征；ESSDAI：歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟pSS疾病活動(dòng)度

表3　Cat S受試者工作特征曲線分析

Cat S：組織蛋白酶S

圖2血清總、pro-和active-Cat S受試者工作特征曲線分析

FigFig2Receiver operating characteristic curve of serum total-，pro- and active-Cat S

Cat S：組織蛋白酶S

Cat S在pSS發(fā)病機(jī)制中的作用成為近年研究的熱點(diǎn)，尤其是在SS動(dòng)物模型中的研究居多。研究顯示，非肥胖型糖尿病(non-obese diabetes，NOD)小鼠淚腺腺泡表達(dá)Cat S增加，淚液Cat S的活性升高[10]。由于淚液中的Cat S可破壞角膜中的蛋白，從而損害眼球表面的完整性，可能是pSS患者出現(xiàn)干燥性角結(jié)膜炎的機(jī)制之一。同樣地，NFSsld小鼠唾液腺及脾的內(nèi)源性Cat S活性升高，經(jīng)過選擇性Cat S抑制劑治療后，唾液腺淋巴細(xì)胞灶性浸潤的病變顯著減輕，而且淚液、唾液流率升高，血清中抗120KD α-fodrin抗體的產(chǎn)生被抑制[9]。這為以Cat S為靶點(diǎn)的治療提供了依據(jù)，同時(shí)，國外各種特異性Cat S抑制劑的不斷研發(fā)[11]，為靶向治療帶來了希望。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NFSsld小鼠唾液腺上皮細(xì)胞(MSG)較淋巴結(jié)及脾內(nèi)淋巴細(xì)胞表達(dá)更多的主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子[9]。正常小鼠MSG經(jīng)過干擾素(interferon，IFN)-γ刺激后可誘導(dǎo)表達(dá)更多的MHCⅡ類分子，并且此過程可被選擇性Cat S抑制劑而抑制，由此推斷Cat S可參與MHC Ⅱ類分子的成熟及促進(jìn)其表達(dá)于APC的表面，進(jìn)而有助于抗原提呈的過程[12]。一項(xiàng)關(guān)于SS患者的研究顯示，SS患者淚液中Cat S的生物學(xué)活性是HCs的近41.1倍，并且患者淚液越少，CatS活性越高，表明淚液Cat S活性與患者干眼癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[13]。迄今為止，國內(nèi)外對于Cat S在SS患者外周血的濃度和唇腺中的表達(dá)尚未見報(bào)道。

本文首次探討pSS患者血清及唇腺組織中Cat S的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)總Cat S及其前體和活性形式在pSS患者血清中表達(dá)均顯著升高，提示pSS患者不僅合成Cat S增加，而且活性形式的表達(dá)亦明顯升高。此外，通過ROC曲線分析顯示總Cat S對于pSS具有輔助診斷價(jià)值，因此可能成為一種新的生物標(biāo)志物。唇腺組織免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pSS患者伴典型灶性淋巴細(xì)胞浸潤的唇腺組織高表達(dá)Cat S。并且，該酶不僅表達(dá)于淋巴細(xì)胞區(qū)，還表達(dá)于腺上皮細(xì)胞及導(dǎo)管上皮細(xì)胞，表明上皮細(xì)胞在病理狀態(tài)下可轉(zhuǎn)化為非專職APC，參與自身抗原的提呈，進(jìn)而導(dǎo)致T、B細(xì)胞的活化，在pSS發(fā)病初期可能具有舉足輕重的地位。同時(shí)國外研究表明Cat S具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能[14]，因此有利于淋巴細(xì)胞的遷移，通過分泌細(xì)胞因子IFN-γ及趨化因子CXCL13等[15]，最終導(dǎo)致唾液腺的破壞，外分泌功能受損，出現(xiàn)臨床癥狀。

綜上所述，pSS患者血清及唇腺組織中Cat S表達(dá)增加，且血清中活性形式Cat S也顯著增加，提示其可能通過增強(qiáng)自身抗原呈遞、降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤等作用，在pSS患者發(fā)病中起到至關(guān)重要的作用，這也為pSS患者可能提供了一種新的輔助血清學(xué)標(biāo)志物及潛在的治療新靶點(diǎn)。

(本文圖3見插頁Ⅰ)

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