干細胞向生殖細胞分化的研究進展

張琴靜，覃蓮菊，崔毓桂，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，南京　210029)

干細胞向生殖細胞分化的研究進展

張琴靜，覃蓮菊，崔毓桂，劉嘉茵*

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，南京210029)

【摘要】干細胞(SCs)具有在體外分化為生殖細胞的潛能，為研究生殖細胞(GCs)早期發(fā)育提供了良好的模型，并將為干細胞移植修復生殖功能提供細胞資源。本文綜述了胚胎干細胞/誘導多能干細胞(ESCs/iPSCs)、新生兒附屬物來源干細胞(NDSCs)以及成體干細胞(ASCs)向生殖細胞分化所取得的研究進展，同時總結(jié)了各類干細胞向生殖細胞分化時所遇到的障礙及所面臨的挑戰(zhàn)，為干細胞在生殖醫(yī)學領域的應用提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】生殖細胞；胚胎干細胞；成體干細胞；新生兒來源干細胞；分化

(J Reprod Med 2016，25(5)：478-481)

干細胞(SCs)是一類具有分化為各種類型細胞潛能的特殊細胞。干細胞可在體外誘導條件下分化為早期生殖細胞、卵母細胞樣細胞以及精子樣細胞[1]，因此可作為研究生殖細胞早期發(fā)育的可靠模型，該模型的研究不但有利于了解生殖細胞發(fā)育調(diào)控機制，而且可為臨床生殖醫(yī)學和組織再生醫(yī)學帶來福音。根據(jù)來源，干細胞可分為胚胎干細胞(ESCs)、新生兒附屬物干細胞(NDSCs)、成體間充質(zhì)干細胞(ASCs)、組織干細胞(TSCs)、誘導多能干細胞(iPSCs)等。本文總結(jié)了不同來源干細胞向生殖細胞分化的研究現(xiàn)狀，同時也探討了不同類型干細胞分化為成熟生殖細胞所面臨的挑戰(zhàn)，最后展望了各類干細胞在生殖醫(yī)學臨床治療上的前景。

一、ESCs/iPSCs的生殖細胞分化潛能

ESCs來源于囊胚內(nèi)細胞團，是一種全能干細胞，具有分化為三胚層來源所有細胞類型的潛能。iPSCs通過將轉(zhuǎn)錄因子OCT3/4、SOX2、KLF4以及C-MYC轉(zhuǎn)染成體細胞重編程而獲得，其形態(tài)特征、分化潛能均與ESCs類似。目前，ESCs/iPSCs已成為再生醫(yī)學研究領域不可或缺的細胞資源，同時也在生殖醫(yī)學研究中發(fā)揮了重要作用。

2003年，報道首次證實小鼠ESCs(mESCs)能在體外誘導分化為卵母細胞樣細胞(OLCs)[2]，這些配子樣細胞甚至可以產(chǎn)生后代[3-4]。然而，體外分化只能獲得早期配子樣細胞且效率非常低，原因很可能是無法完成正常的減數(shù)分裂[1]。后來，Yu等[5]的研究發(fā)現(xiàn)DAZL基因是調(diào)控生殖細胞成熟的一個關(guān)鍵基因，Wang等[6]發(fā)現(xiàn)GASZ基因能夠顯著促進原始生殖細胞的生成，且GASZ與DAZL相互作用。最近，Hayashi等[7]利用階梯式培養(yǎng)方法從mESCs及iPSCs獲得了卵母細胞，且經(jīng)體外受精獲得了健康后代。該方法分化率高，且避免了過多體外誘導步驟可能導致的遺傳突變。

因倫理限制，人類ESCs/iPSCs向生殖細胞分化的研究進展相對緩慢，且多集中于對誘導分化條件的探索[8]。最近，Wongtrakoongate等[9]證實Stella可促進hESCs分化為生殖細胞及內(nèi)胚層細胞系；而Duggal等[10]報道Actin A可提高hESCs在體外分化為生殖細胞的效率，且這種促進作用與TGFb/Activin信號通路的激活有關(guān)。Gkountela等[11]的研究則顯示，hESCs分化為原始生殖細胞的過程涉及了基因表達和表觀遺傳學的改變。最新的分化體系可使得ESCs/iPSCs向原始生殖細胞樣細胞(PGCLCs)分化的效率大于20%，同時也揭示了SOX17/BLIMP1可能是PGCLCs分化中的關(guān)鍵因子[12]。

二、NDSCs的生殖細胞分化潛能

新生兒附屬物指正常分娩新生兒所帶的臍帶、胎盤、胎膜和羊水等。目前研究表明，臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)、羊膜上皮細胞(AECs)、羊水干細胞(AFSCs)都具有分化為生殖細胞的潛能。

1. UC-MSCs的生殖細胞分化潛能：UC-MSCs分離自臍帶，具有間充質(zhì)干細胞(MSCs)的形態(tài)學特征及特性，在體外誘導培養(yǎng)條件下可向三胚層分化，包括向生殖細胞分化。Huang等[13]在體外用維甲酸(RA)、雄激素和睪丸細胞生長培養(yǎng)基誘導hUC-MSCs分化，在mRNA和蛋白水平分別檢測到生殖細胞特異標志物；隨后的研究證實骨形態(tài)形成蛋白(BMP4)可誘導hUC-MSCs向男性生殖細胞樣細胞分化[14]。2012年，Qiu等[15]證明了高濃度的羊水(FF)可以誘導UC-MSCs分化為原始卵泡階段的卵母細胞樣細胞。Qiu等[16]把Filga轉(zhuǎn)入hUC-MSCs中，最終獲得了突破原始卵泡階段的卵母細胞樣細胞。

2. AECs的生殖細胞分化潛能：AECs分離自羊膜，與生殖細胞具有相同的胚層起源，因此天然具有向生殖細胞分化的潛能[17]。Evron等[18]證明在血清培養(yǎng)基中生長的hAECs可表達生殖細胞的特異標志物并可分化為卵母細胞樣細胞。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)hAECs能分化為卵巢顆粒細胞并且能恢復化療小鼠受損的卵巢功能。

3. AFSCs的生殖細胞分化潛能：2008年，Stefanidis等[20]發(fā)現(xiàn)一部分AFSCs表達生殖細胞標志物DAZL，同時也表達c-Kit、SSEA-4和OCT4。Lai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AFSCs可被誘導分化為高表達生殖細胞標志物的細胞，同時AFSCs移植后可分化為顆粒細胞，改善化療引起的不孕小鼠的卵巢功能。2014年，Yu等[22]從羊水中分離獲得CD117+/CD44+細胞，這些細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)，可表達卵母細胞特異基因并進一步分化為具有孤雌生殖能力的卵母細胞樣細胞。最新文獻報道顯示，AFSCs不但可以防止卵泡閉鎖，也可恢復化療引起的卵巢早衰小鼠的卵巢功能[23]。

三、ASCs的生殖細胞分化潛能

成體干細胞(ASCs)廣泛存在于哺乳動物的組織、臟器，分化能力相對有限，但仍具有向生殖細胞分化的潛能[1]。

1. 骨髓干細胞(BMSCs)的生殖細胞分化潛能：BMSCs起源于中胚層和內(nèi)胚層的早期發(fā)育階段，是干細胞家族的重要成員。RA可體外誘導BMSCs分化為不同分化時期生殖細胞樣細胞[24]，而BMP4可誘導SSEA-1+BMSCs分化為原始生殖細胞樣細胞[25]。BMSCs來源的生殖細胞被阻滯在發(fā)育的早期階段，要獲得更為成熟的生殖細胞需要添加額外的未知細胞因子[24]。有學者提出，骨髓干細胞可能是卵母細胞的起源[26]，此后BMSCs被廣泛應用于受損卵巢的修復治療實驗。2012年，Santiqute等[27]將BMSCs注入卵巢損傷模型小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSCs不能分化為卵母細胞，但可通過影響卵巢生理環(huán)境而改善小鼠的生殖能力。最新的研究表明，BMSCs可減少化療小鼠的細胞凋亡和DNA損傷[28]。

2. 脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)的生殖細胞分化潛能：ADSCs來自脂肪組織，體外可被誘導分化為多種細胞。Cakici等[29]建立輸精管損傷小鼠模型，然后將GFP+ADSCs注入一側(cè)輸精管，發(fā)現(xiàn)注射ADSCs的輸精管形態(tài)正常，輸精管內(nèi)發(fā)現(xiàn)GFP+/VASA+以及GFP+/SCP1+精子，并且這些精子授精后能產(chǎn)生后代；而對側(cè)未注射ADSCs的輸精管則萎縮。這一研究證明，ADSCs在合適的體內(nèi)環(huán)境下可以分化為生殖細胞。最近，Hosseinzadeh等[30]用RA體外誘導ADSCs分化，獲得了表達生殖細胞標志基因DAZL、MVH、Stra8及SCP3的生殖細胞樣細胞，但表達量較BMSCs來源的生殖細胞樣細胞低。

其它來源的成體干細胞，如皮膚干細胞(SDSCs)、胰腺干細胞(PSCs)均已被證明可在體外條件下分化為生殖細胞樣細胞[1]。

四、存在的問題

迄今為止，已在體外自hESCs/iPSCs誘導形成人類PGCLCs[3-4，12]，相信不久即可體外獲得成熟的生殖細胞，這將對臨床生殖醫(yī)學產(chǎn)生重大影響——人類有可能徹底解決因配子質(zhì)量導致的生殖障礙疾病。然而，hESCs在生殖臨床上的應用尚存在倫理限制，同時其來源有限也是臨床應用的一大阻礙，因此，目前hESCs僅局限于生殖醫(yī)學研究領域。與hESCs相比，hiPSCs涉及的倫理問題少、來源廣泛、免疫排斥弱，而且結(jié)合基因修飾技術(shù)可更正遺傳缺陷，最有可能用于徹底解決人類的生殖問題，因此臨床應用前景非常廣闊。不過，現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)尚不能把iPSCs分化為成熟生殖細胞，因此須努力探索更有效的分化體系；此外，重編程獲得hiPSCs的過程中導入了外源基因或暴露于小分子化學物，有可能導致細胞的遺傳和表觀遺傳發(fā)生了很難檢測到的微小變異，而這種變異有可能對hiPSCs來源生殖細胞產(chǎn)生的個體造成嚴重后果：如胎兒畸形及發(fā)育不良，成人高發(fā)慢性病、腫瘤等，故hiPSCs在用于臨床研究前須進行謹慎評估。

胎兒附屬物來源的多能干細胞可能在人類生殖障礙的臨床治療上有所作為。然而迄今為止，從該類干細胞僅能誘導獲得早期生殖細胞樣細胞，無法獲得成熟生殖細胞?？赡艿脑蛴校?1)目前的誘導分化方案尚不夠成熟；(2)該類細胞無法分化為成熟生殖細胞。如果原因為前者，則須克服一系列的技術(shù)障礙，然而即使最終獲得了成熟生殖細胞，依然存在醫(yī)學倫理問題即分化的生殖細胞源自異體，因此需謹慎對待。如果原因為后者，則該類細胞無法作為配子來源細胞。幸運的是，動物實驗顯示，AFSCs、AECs移植后均可分化為卵母細胞的支持細胞——顆粒細胞，從而幫助修復化療引起的卵巢功能損傷。基于此，胎兒附屬物干細胞雖然不能直接分化為成熟生殖細胞徹底解決配子缺乏問題，但移植后可改善生殖功能，因此在生殖障礙輔助治療以及抗衰老領域具有光明前景。值得注意的是，雖然羊水來源的AFSCs較易獲得，但羊水中所含細胞種類繁多，且大部分為已分化的成體細胞，而用于研究的具體細胞類型也很難明確，因此AFSCs在臨床治療前景上不如 AECs。另外，機制研究顯示，間充質(zhì)干細胞可通過分泌相關(guān)細胞因子修復受損器官功能[31-32]；我們最近的研究也表明，新生兒附屬物干細胞可能通過分泌的細胞因子改善卵巢微環(huán)境進而改善生殖(未發(fā)表數(shù)據(jù))，提示將來也許只需注射干細胞培養(yǎng)液即可修復生殖功能。

成體干細胞在生殖臨床上面臨的挑戰(zhàn)、機遇與新生兒附屬物干細胞相似，但價值較新生兒附屬物干細胞低，原因如下：(1)成體干細胞更“老”，其多能性不如新生兒附屬物干細胞，推測其輔助治療效果也不如新生兒附屬物干細胞；(2)成體干細胞發(fā)育、生長的時間更長，存在遺傳及表觀遺傳變異的幾率更高，因此安全性也不如新生兒附屬物干細胞。成體干細胞的優(yōu)勢是可自體移植，然而，個體的年齡及體質(zhì)會嚴重影響成體干細胞的質(zhì)量[33]，而質(zhì)量差的干細胞治療潛力非常有限。也就是說，并非任何個體都適于進行自體干細胞治療。

綜上所述，hESCs在生殖細胞分化機制研究方面具有無可比擬的優(yōu)勢；而iPSCs則可能在攻克生殖細胞成熟的技術(shù)難題后徹底解決人類因配子質(zhì)量低下所導致的生殖問題；新生兒附屬物干細胞目前雖不能分化為成熟的生殖細胞，但可立即作為輔助治療手段進入生殖功能改善臨床試驗；成體干細胞臨床應用前景與新生兒附屬物干細胞類似，但效果不如后者。

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[編輯：侯麗]

Research of stem cells differentiation to germ cells

ZHANG Qin-jing，QIN Lian-ju，CUI Yu-gui，LIU Jia-yin*

State Key Laboratory of Reproductive Medicine，Center of Clinical Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing210029

【Abstract】Stem cells (SCs) are promised to differentiate to germ cells，providing a valuable in vitro model for investigating early development of germ cells，and it will become the cell resource for stem cell transplantation therapy. The paper reviews the advances in the study on embryonic stem cells/induced pluripotent stem cells (ESCs/iPSCs)，neonatal-derived stem cells (NDSCs) and adult stem cells (ASCs) differentiating to germ cells，meanwhile summarizes the obstacles encountered in the differentiation of stem cells to germ cells. It will provide a theoretical basis for the application of stem cells in the field of reproductive medicine.

【Key words】Germ cells (GCs)；Embryonic stem cells (ESCs)；Adult stem cells (ASCs)；Neonatal-derived stem cells (NDSCs)；Differentiation

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.019

【收稿日期】2015-06-26；【修回日期】2015-08-21

【基金項目】公益性衛(wèi)生行業(yè)專項(201402004，201302013)；江蘇省科技廳項目(BL2012009，BM2013058)

【作者簡介】張琴靜，女，江蘇昆山人，碩士，婦產(chǎn)科專業(yè).(*通訊作者)