低相對分子質量肝素接枝羧甲基纖維素超支化聚合物的合成、表征及活性研究

孫媛媛， 鄧 超， 陳敬華*

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122）

劑100 μL，37℃孵育5 min。之后加入37℃預溫的0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 mL，記錄凝固時間。上述測定均于加入試劑的同時啟動秒表，所有試劑使用前均經37℃預溫5 min。

2.2.2 凝血酶原時間（PT）測定 按2.2.1方法收集血漿，取樣品10 μL和待測血漿90 μL震蕩混勻，37℃預溫3 min后加入37℃預溫PT試劑200 μL，記錄凝固時間，即為PT值。

2.2.3 CH活性檢測（抗Xa與抗IIa活性測定） 采用發(fā)色底物分光光度法測定樣品抗Xa和抗IIa活性，其原理為肝素與抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）形成復合物，該復合物小于18個糖鏈可抑制與發(fā)色底S-2765的水解反應；而大于18個糖鏈的復合物，可結合凝血酶即FIIa，從而抑制與發(fā)色底物S-2238產生水解反應。未與AT-Heparin復合物結合的FXa和FIIa，會分別與發(fā)色底S-2765和S-2238發(fā)生反應，釋放出一種具有顏色的物質pNA，通過在405 nm下檢測pNA的濃度，即可計算出抗Xa、抗IIa因子活性。具體如下：

先制定肝素抗Xa與抗IIa活性的標準工作曲線：準備配置0、0.25、0.5、0.75、1 IU/mL的肝素標準液，取標準液40 μL肝素標準溶液，加入40 μL抗凝血酶Ⅲ，振蕩混勻后，于37℃恒溫箱中反應2 min，再加入40 μL發(fā)色底物，振蕩混勻后，37℃精確反應2 min（抗IIa精確反應1min），再加入80 μL檸檬酸終止液終止反應。使用紫外分光光度儀測量肝素標準溶液和CH樣品405 nm處的吸光度值，繪制標準曲線并計算CH的抗Xa因子、抗IIa因子活性。

低相對分子質量肝素接枝羧甲基纖維素超支化聚合物的合成、表征及活性研究

孫媛媛1， 鄧 超2， 陳敬華*1

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122）

為提高低分子量肝素的生物活性，用末端接枝法將末端醛基低相對分子質量肝素（LMWH-CHO）綴合在羧甲基纖維素 （CMC）主鏈上，形成一種強負電性的超支化聚合物（LMWH-grafted CMC，CH）。LMWH-CHO是通過亞硝酸鈉降解法制備獲得，利用EDC催化酰胺鍵生成反應使CMC氨基化，然后通過醛基和氨基的希夫堿反應將二者綴合。運用傅立葉變換紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）、凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯用技術（GPC-MALLS）等方法對產物結構和分子量進行表征，并對聚合物的抗凝血、抗血栓活性進行了測定。結果顯示，在氨基化CMC糖單元與LMWH-CHO摩爾比為1∶5的條件下反應12 h，得到接枝率為23.7%的CH超支化聚合物。該聚合物活化部分凝血活酶時間（APTT）為146 s，比LMWH延長了25%，凝血酶原時間（PT）為27.9 s，約為LMWH的2倍。此外，該聚合物抗Xa IC50值為104.2 nmol/L，比LMWH降低了近4倍；抗IIa IC50值為642 nmol/L，遠低于LMWH（＞2 000 nmol/L）。表明，制備的CH超支化聚合物抗凝血和抗血栓活性均遠優(yōu)于低相對分子質量肝素。

低相對分子質量肝素；超支化聚合物；表征；生物活性

肝素（Heparin）廣泛分布在哺乳動物的組織中，如肝、腸粘膜、脾、肺、心等[1]。肝素作為抗凝血藥物已有80余年[2]，是最重要抗凝血和抗血栓的生化藥物之一[3]。肝素對心血管外科和血液透析的發(fā)展作出了巨大的貢獻，然而，在發(fā)揮其抗凝和抗栓作用的同時會產生許多難以避免的副作用，如肝素多來源于豬、牛的小腸粘膜，存在潛在的病毒感染危險[4]；劑量個體差異性大，導致合適劑量[5]和持續(xù)給藥時間難以確定[6]；并且容易出現因肝素引發(fā)的血小板減少癥[4，7]等。針對上述肝素使用過程中出現的問題，人們研制出了新型抗凝血藥物——低相對分子質量肝素[8]（LMWH）。與傳統(tǒng)肝素相比，LMWH具有鏈短、結合部位少，生物利用度高，且半衰期長，個體差異和不確定因素少，劑量易于確定，無需進行血藥濃度檢測等優(yōu)點[9]，LMWH具有較高的抗凝血活性，但抗血栓性能相比普通肝素卻大幅降低。因此，對LMWH進行修飾以及通過酶法或化學法合成LMWH衍生物備受研究者們青睞。Chen等[10]采用不同酶組合的方法獲得了具有抗凝活性的硫酸乙酰肝素結構，其抗凝活性不如普通肝素但是優(yōu)于LMWH。Oh等[4]以藥物Arixtra戊多糖還原端的兩個糖單元為單位合成了聚合度可控的LMWH類似物。該LMWH類似物均一性較好，但是合成步驟復雜，純化困難，應用受到一定限制。

超支化聚合物是一類可以通過一步法來合成的具有高度支化結構的體型大分子[11]。與相同質量的線型聚合物相比，它有獨特的三維體型分子結構，高度支化的分子鏈分布，這些結構特點賦予了它不同于線性聚合物的優(yōu)異性能，如溶解性能[12]及化學多功能性[13-14]等。超支化聚合物存在高分布密度的端基官能團，增加了聚合物的端效應[15]，賦予聚合物更高的生物性能[16]。Jeong等人[17]研究了星形聚環(huán)氧乙烷-聚乳酸嵌段聚合物，其具有良好的可吸水性和生物相容性，使得該聚合物成為很好的藥物緩釋材料。Frey等[12]以五氯苯酚甲基丙烯酸酯為骨鏈，通過酯化反應成功合成了一種超支化聚甘油類似物用作藥物載體。

作者以羧甲基纖維素糖鏈作為核心，利用其糖單元上C-6位羧甲基與乙二胺發(fā)生酰胺化縮合反應進行氨基化修飾，再與用亞硝酸鈉降解法制備的末端醛基化的LMWH綴合，形成一類新的強負電性羧甲基纖維素-低相對分子質量肝素（CH）超支化聚合物（圖1）。針對聚合物支鏈的空間位阻效應及反應體系中較低的聚合基元濃度，合成出長主鏈的超支化聚合物需要接枝側鏈大量過量，產物的分離純化困難的問題，采用NaCl多次超濾方法對產物進行分離純化，并對純化產物進行結構表征及生物活性檢測。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

亞硝酸鈉、濃硫酸、碳酸氫銨：AR，購于中國國藥集團化學試劑有限公司；肝素鈉，生化試劑：購于中國生工生物工程（上海）股份有限公司；氰基硼氫化鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC）、乙二胺（EDA）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：分析純，購于中國Sigma Aldrich公司；活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒（鞣花酸）、凝血酶原時間（PT）測定試劑盒（凍干型）：購于中國上海太陽生物技術有限公司；肝素抗Xa因子測定試劑盒、肝素抗IIa因子測定試劑盒：購于中國北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

FreeZone 2.5 L冷凍干燥機：美國Labconco公司產品；AUV-1800型紫外-可見分光光度計：日本島津儀器有限公司產品；VATAR-360傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo公司產品；AduanceⅢ400MHz核磁共振分析儀：德國布魯克公司產品；FreeZone 2.5L冷凍干燥機：美國Labconco公司產品；GPCDAWN HELEOS型18角度激光光散射聯用系統(tǒng)：美國懷雅特技術公司產品。

2 實驗方法

2.1 CH超支化聚合物的制備

2.1.1 還原末端為醛基的低相對分子質量肝素（LMWH-CHO）的制備 LMWH-CHO的制備方法參照Wan[18]的亞硝酸降解法。反應得到的澄清溶液在0.1 mol/L NH4HCO3溶液中透析 （MWCO 3 500 Da），樣品經凍干后混合溴化鉀壓片，在波長范圍為500~4 000 cm-1內進行紅外光譜（FTIR）表征。

采用GPC-MALLS技術對肝素降解前后的相對分子質量及分布進行測定。溶劑與流動相：0.2 mol/ L NaCl（含質量分數0.01%NaN3），經0.22 μm濾膜過濾。Wyatt-OPTILAB rEx示差檢測器和GPC色譜柱柱溫均為25℃；流量：0.5 mL/min；定量環(huán)：100 μL；分別準確稱取肝素標準品及LMWH-CHO樣品4 mg，用2 mL流動相溶解，過夜放置，樣品溶液經孔徑為0.22 μm濾膜過濾后注入GPC-MALLS測試系統(tǒng)進行測量。

2.1.2 氨基化羧甲基纖維素鈉（CMC-NH2）的合成取200 mg（0.76 mmol）CMC粉末溶于50 mL去離子水中，加入218.67 mg EDC（1.14 mmol）和87.45 mg NHS（0.76 mmol），調節(jié)體系pH至5.0，反應1 h以活化羧基，隨后逐滴滴入50 μL乙二胺（EDA），將pH調至7.4左右，25℃攪拌反應12 h。反應結束后將反應物用截留相對分子質量為25 000的透析袋在去離子水中透析，冷凍干燥后得到CMC-NH2，樣品用1H NMR確認其結構。

2.1.3 CH產物合成及其分離與純化 CH超支化聚合物的合成是通過Schiff堿親核加成反應制備。取64 mg（0.2 mmol糖單元）CMC-NH2溶于40 mL去離子水中，與40 mL含有700 mg（0.1 mmol）LMWH-CHO的水溶液充分混勻，之后加入63 mg（0.1 mmol）氰基硼氫化鈉，在氮氣保護下65℃油浴中攪拌反應12 h。將反應后的溶液在去離子水中透析（MWCO 1 400 Da），冷凍干燥得到CH超支化聚合物。

稱取適量樣品用0.2 mol/L的NaCl溶液溶解，用超濾管（MWCO 100 kDa）連續(xù)超濾多次，并不斷加NaCl溶液稀釋樣品溶液，用GPC-MALLS對樣品純度進行檢測，當出現均一的LS-RI檢測峰時可視為純化好的樣品，并用1H-NMR和紫外可吸收光譜（UV-vis）對其產物進行確認。

2.1.4 CH中LMWH接枝率測定 稱取10 mg肝素標準品溶于pH為7.4的PBS溶液中，定容至1 L，配置成質量濃度為0.1 mg/mL的肝素鈉母液，分別取0.50、1、1.5、2、2.5、3 mL母液稀釋至10 mL配成質量濃度分別為 0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的肝素鈉PBS標準溶液，取標準液和0.005%甲苯胺藍溶液（0.005%）各2.5 mL，加入到10 mL玻璃管中，充分混勻后于37℃恒溫箱中反應2 h。取出后加入4.5 mL正己烷，劇烈震蕩，使之充分萃取。以甲苯胺藍-PBS溶液為空白，于405 nm處檢測各濃度肝素相對應的吸光度值（Y），以肝素濃度為橫坐標（X）繪制肝素標準工作曲線，根據樣品的吸光度值計算出樣品中LMWH的濃度。

2.2 CH生物活性檢測

2.2.1 活化部分凝血活酶時間（APTT）測定 人靜脈采血1.8 mL于5 mL含0.2 Ml3.2%枸櫞酸鈉的抗凝試管中，反復顛倒3~4次，3 000 r/min離心15 min，收集上層黃色血漿。取樣品10 μL和待測血漿90 μL震蕩混勻，37℃預溫5 min后加入APTT試

劑100 μL，37℃孵育5 min。之后加入37℃預溫的0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 mL，記錄凝固時間。上述測定均于加入試劑的同時啟動秒表，所有試劑使用前均經37℃預溫5 min。

2.2.2 凝血酶原時間（PT）測定 按2.2.1方法收集血漿，取樣品10 μL和待測血漿90 μL震蕩混勻，37℃預溫3 min后加入37℃預溫PT試劑200 μL，記錄凝固時間，即為PT值。

2.2.3 CH活性檢測（抗Xa與抗IIa活性測定） 采用發(fā)色底物分光光度法測定樣品抗Xa和抗IIa活性，其原理為肝素與抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）形成復合物，該復合物小于18個糖鏈可抑制與發(fā)色底S-2765的水解反應；而大于18個糖鏈的復合物，可結合凝血酶即FIIa，從而抑制與發(fā)色底物S-2238產生水解反應。未與AT-Heparin復合物結合的FXa和FIIa，會分別與發(fā)色底S-2765和S-2238發(fā)生反應，釋放出一種具有顏色的物質pNA，通過在405 nm下檢測pNA的濃度，即可計算出抗Xa、抗IIa因子活性。具體如下：

先制定肝素抗Xa與抗IIa活性的標準工作曲線：準備配置0、0.25、0.5、0.75、1 IU/mL的肝素標準液，取標準液40 μL肝素標準溶液，加入40 μL抗凝血酶Ⅲ，振蕩混勻后，于37℃恒溫箱中反應2 min，再加入40 μL發(fā)色底物，振蕩混勻后，37℃精確反應2 min（抗IIa精確反應1min），再加入80 μL檸檬酸終止液終止反應。使用紫外分光光度儀測量肝素標準溶液和CH樣品405 nm處的吸光度值，繪制標準曲線并計算CH的抗Xa因子、抗IIa因子活性。

3 結果與討論

3.1LMWH-CHO的表征

利用傅里葉變換紅外光譜表征亞硝酸鈉降解前后肝素官能團的變化。如圖2所示，經亞硝酸降解后的肝素在1 740 cm-1位置新出現了醛基的C-O伸縮振動吸收峰，說明肝素末端成功被醛基化。在2 919 cm-1處出現的弱吸收峰是烷基的CH伸縮振動吸收峰；3 431 cm-1處出現的寬而強的吸收峰是羥基的O-H伸縮振動吸收峰；在1 620 cm-1處出現的強吸收峰是羧基的C=O非對稱伸縮振動。醛基化前后糖鏈的主要結構并沒有發(fā)生改變。

如圖3所示，與肝素標準品相比，降解得到的LMWH-CHO相對分子質量分散性較好，洗脫體積后延，肝素的重均相對分子質量（MW）為2.009×104g/mol，降解后MW降為7.007×103（表1）。在EDC催化下，CMC上羧甲基與EDA上氨基反應形成酰胺鍵，得到CMC-NH2。LMWH-CHO與CMC-NH2通過Schiff堿綴合，經氰基硼氫化鈉還原后得到CH聚合物。與未經修飾的CMC對比，CMCNH2的1H-NMR波譜（圖4）在2.91×10-6處出現了EDA亞甲基氫。根據其峰面積與理論上均未修飾時CMC C-6位羧甲基上亞甲基氫峰面積的比值計算，糖環(huán)上46.7%的羧甲基成功被氨基化修飾。

3.2 CH聚合物的分離與純化

產物透析、凍干處理后經GPC-MALLS檢測，如圖5（a）所示，樣品的示差信號顯示為非均一峰，樣品中含有兩種不同相對分子質量的物質，且小分子物質占總量的85%。這可能是由于反應過程LMWH-CHO大量過量，未反應的LMWH-CHO以非共價結合方式纏繞在CMC鏈上。經多次加鹽解離超濾，大分子物質比例逐漸提高，超濾10次后，兩種物質的示差峰已明顯分離開（圖5（b）），此時大分子物質占52%。超濾15次后，大分子物質達到總量的90%（圖5（c）），繼續(xù)超濾，得到示差信號均一的大分子聚合物（圖5（d））。

3.3 CH結構表征

樣品的紫外可見光譜圖見圖6，與肝素標準品相比，LMWH-CHO在波長250 nm左右有很強的吸光值，此處為醛基不飽和鍵的紫外吸收特征峰。通過LMWH-CHO上的醛基與CMC上的氨基形成希夫堿結構綴合后，醛基特征峰消失，證明CH中沒有未反應的LMWH-CHO殘留。

CH聚合物的成功合成還可從1H-NMR波譜（圖7）證明，由于肝素具有很強的不均一性，且CMC和LMWH-CHO糖鏈上H在3×10-6~4×10-6處有多處重合，用NMR分析整個CH樣品結構非常困難。但是CH樣品的1H-NMR波譜中明顯既有肝素的特征峰也有CMC的特征峰，2.91×10-6（b）為CMC-NH2上乙二胺亞甲基氫，3.51×10-6（d）為CMC C-5位氫，2.05×10-6為肝素酰胺上的氫 （a），4.5× 10-6~5.5×10-6為肝素糖鏈H的特征峰（f，g）。

3.4 CH中肝素結合量測定

根據測試結果繪制肝素標準工作曲線 （圖8），經線性回歸后得到的標準曲線方程為：y=0.755 14-15x，R2=0.999 1，說明方程擬合較好，根據該方程，計算出CH中LMWH-CHO含量為23.7%。

3.5 CH活性測定

APTT和PT檢測結果顯示（表2），形成CH超支化聚合物后APTT和PT均明顯比LMWH長。LMWH在人血漿中質量濃度為150 μg/mL時，CH聚合物的APTT和PT值分別為146 s、27.9 s，APTT比相同條件的LMWH延長了24.8%；PT比LMWH延長了近2倍。

表2中IC50是指樣品對FXa和FIIa的半抑制濃度，即活性為50%時，所需要的樣品濃度（nmol/mL）。IC50值越大說明在抑制相同程度的FXa和FIIa時，所用的樣品濃度越大，其抗凝血和抗血栓能力就越弱。從表2中可以看出，LMWH FXa IC50值最大，為514.21 nmol/L，形成超支化聚合物后，樣品IC50值為104.2 nmol/L，比LMWH降低了4.9倍。上述結果說明CH超支化聚合物的抗凝血活性較LMWH有顯著提高。CH超支化聚合物對FIIa也有較強的抑制作用，其IC50值為642 nmol/L，說明該聚合物有較好的抗血栓作用，而LMWH沒有明顯的抗血栓作用。

4 結語

以CMC為骨鏈，以LMWH-CHO為支鏈，采用末端接枝的方法成功將LMWH-CHO綴合在CMC鏈上。在CMC-NH2和LMWH-CHO摩爾比為1∶5的條件下反應12 h，可得到LMWH-CHO接枝率為23.7%CH超支化聚合物。1H-NMR譜和紫外可見吸收光譜證明了該CH超支化聚合物的分子結構與實驗所設計的結構相符；研究結果表明，通過這種方法制備的超支化LMWH衍生物活性盡管不及普通肝素，但遠優(yōu)于LMWH。該方法具有制備過程簡單，一步即可完成聚合反應，純化操作簡便可行。

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Synthesis，Characterization and Biological Activity of a LMWH Hyperbranched Carboxymethylcellulose Polymer

SUN Yuanyuan1， DENG Chao2， CHEN Jinghua*1
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A strongly negative hyperbranched copolymer （LMWH-grafted CMC，CH）was synthesized by low-molecular-weight heparin （LMWH）grafted onto carboxymethylcellulose（CMC）backbone to improve the biological activities of LMWH via multivalent effect.LMWH with an aldehyde group at their reduce ends（LMWH-CHO）was prepared from heparin degradation by nitrous acid.The amide bond was formed between the amino group of EDA and the carboxylic groups of CMC when catalyzed by EDC and the primary amino groups were introduced to the backbone（CMC-NH2）.LMWH-CHO was thus grafted onto CMC-NH2by the Schiff-base reaction.The synthesized hyperbranched polymer was characterized by FTIR，NMR and GPC-MALLS to detect its chemical structure and molecular weight.Furthermore，the anticoagulation activities of the polymer were determined.The results showed that the grafted ratio of CMC was 23.7%with a molar ratio of CMC-NH2to LMWH-CHO of 1∶5.The APTT and PT of the polymer were 146 s and 27.9 s，respectively，which were 1.25-fold and 2-fold higher compared with that of LMWH.In addition，the IC50value of anti-factor Xa and anti-factor IIa of the polymer were 104.2 nmol/L and 642 nmol/L，respectively.The values were much lower than those of LMWH.In conclusion，LMWH grafted CMC polymer possessed a better anticoagulation activity than LMWH.

low-molecular-weight heaparin，hyperbranched polymer，characterization，biological activity

Q 538；R 944.9

A

1673—1689（2016）11—1182—07

2015-02-05

教育部博士點基金項目（20110093110008）；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃基金項目（NCET-10-0435）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物大分子和生物功能材料研究。E-mail：jhchenwhut@126.com