L-色氨酸分子印跡光子晶體水凝膠膜的制備及性能

楊兆昆, 張曉棟, 施冬健, 陳明清, 劉士榮

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院, 食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室, 無錫 214122)

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L-色氨酸分子印跡光子晶體水凝膠膜的制備及性能

楊兆昆, 張曉棟, 施冬健, 陳明清, 劉士榮

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院, 食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室, 無錫 214122)

摘要采用膠體晶體模板法, 借助“三明治”結(jié)構(gòu)制備了可與基底剝離的分子印跡光子晶體水凝膠膜(MIPHs). 該MIPHs以L-色氨酸(L-Trp)為模板分子, 丙烯酰胺(AM)為功能單體, N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)為交聯(lián)劑, 在紫外光下引發(fā)聚合. 掃描電子顯微鏡(SEM)表征結(jié)果表明, MIPHs具有相互貫通的三維有序大孔結(jié)構(gòu). 制得的MIPHs在L-Trp的緩沖溶液中可快速響應(yīng), 當(dāng)L-Trp的濃度從10-10mol/L增大到10-5mol/L時, MIPHs的Bragg衍射峰位移83 nm, 并伴有明顯的顏色變化. 此外, MIPHs在L-Trp結(jié)構(gòu)類似物L(fēng)-酪氨酸(L-Tyr)和L-苯丙氨酸(L-Phe)的緩沖溶液中Bragg衍射峰位移較小, 表明制得的MIPHs具有良好的選擇性.

關(guān)鍵詞“三明治”結(jié)構(gòu); 反蛋白石; 光子晶體; 分子印跡; L-色氨酸

色氨酸(Tryptophan)是生命體系中蛋白質(zhì)及其它生物活性物質(zhì)必不可少的組成成分. 由于僅通過日常飲食攝取的色氨酸量不能滿足人體的正常需求, 所以色氨酸常被添加于各種食品和藥品中. 然而, 人體攝入過多色氨酸則可能引起惡心、食欲不振及有困意等不良反應(yīng)[1～3]. 因此, 檢測食品和藥品中色氨酸的含量對于公眾健康極其重要.

目前, 用于檢測色氨酸的分析方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[4]、毛細(xì)管電泳法(CE)[5]、熒光光譜法[6]和電化學(xué)方法[7～9]等, 這些方法雖然都具有一定的靈敏性和選擇性, 但都需要復(fù)雜的儀器及繁瑣的操作, 甚至需要專業(yè)人員來進行檢測. 因此, 建立一種快速、靈敏、方便的現(xiàn)場檢測手段具有重要的意義.

分子印跡凝膠光子晶體(MIPHs)是基于分子印跡技術(shù)與凝膠光子晶體技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來的. 分子印跡技術(shù)是研究制備具有特異性納米識別空腔的分子印跡聚合物(MIPs)的技術(shù)手段[10]. 特異性納米識別空腔與印跡分子在尺寸、形狀以及功能團作用上相匹配, 使其可與混合物中待分離的印跡分子發(fā)生特異性的結(jié)合[11,12]. 凝膠光子晶體(HPCs)周期性的介電結(jié)構(gòu)可使電磁波發(fā)生Bragg衍射, 當(dāng)電磁波落在可見光波長范圍內(nèi)時, 凝膠光子晶體即呈現(xiàn)出裸眼可視的鮮艷的結(jié)構(gòu)顏色[13]; 同時HPCs可對外界環(huán)境刺激響應(yīng)而發(fā)生快速可逆的溶脹收縮, 進而引起結(jié)構(gòu)顏色的變化[14～17]. MIPHs既具有MIPs特異性識別的特點, 又能維持HPCs對外界刺激響應(yīng)而導(dǎo)致肉眼可視的顏色變化的性質(zhì). 因此, MIPHs有望用于實際環(huán)境中待分析物的快速、靈敏、特異性檢測. Li等[18]率先制備了用于識別L-多巴(L-Dopa)的MIPHs. 此后, 用于檢測食品中香蘭素[19]、膽固醇[20]及脯氨酸[21]等的分子印跡凝膠光子晶體被相繼制得. 但迄今尚未見文獻報道用于色氨酸檢測的MIPHs的制備.

本文制備了L-Trp分子印跡光子晶體水凝膠膜(L-MIPHs)和非印跡光子晶體水凝膠膜(NIPHs); 研究了L-MIPHs對L-Trp的特異響應(yīng)性, 以及其對相應(yīng)構(gòu)型異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)類似物的選擇性. 結(jié)果表明, MIPHs不僅展現(xiàn)出快速響應(yīng)及可重復(fù)使用的特點, 還具有肉眼可區(qū)分的顏色變化.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

L-色氨酸(L-Trp)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、丙烯酰胺(AM)和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)均為分析純, 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 2,2′-二乙氧基苯乙酮(DEAP)和D-色氨酸(D-Trp)均為分析純, 購自百靈威科技有限公司; 聚苯乙烯微球乳液(PS, 自制). 供膠體晶體生長的玻璃片(76.2 mm×24.5 mm×1 mm)依次用丙酮、乙醇和超純水超聲清洗, 用氮氣吹干, 備用.

紫外燈(365 nm, 125 W, 深圳市喜萬年科技有限公司); FLA5000型光纖光譜儀(杭州晶飛科技有限公司); DSC-HX300型數(shù)碼相機(日本SONY公司).

1.2聚苯乙烯(PS)膠體晶體的制備

參考文獻[22], 采用無皂乳液聚合法制備單分散PS微球乳液(單分散系數(shù)<0.005), 配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PS乳液. 采用垂直沉積法制備膠體晶體. 將上述配制好的PS乳液置于小燒杯中, 將處理過的玻璃片垂直插入乳液中, 將燒杯置于恒溫恒濕箱(溫度60 ℃, 濕度40%)中, 至水分完全揮發(fā)即得到PS膠體晶體.

1.3色氨酸分子印跡光子晶體水凝膠膜(L-MIPHs)的制備

將一定量的L-Trp, AM, BIS和DEAP溶于超純水中, 制成前驅(qū)液, 通氮氣10 min備用. 將石英玻璃片覆蓋在膠體晶體表面, 將二者固定, 即得到“三明治”結(jié)構(gòu). 在“三明治”結(jié)構(gòu)間隙中填充上述前驅(qū)液, 直至膠體晶體模板變?yōu)橥该鳡顟B(tài); 在冰浴中紫外光照射下光聚合2 h, 將聚合后的“三明治”結(jié)構(gòu)浸入去離子水中, 使復(fù)合蛋白石膜自動脫落, 再將其置于二甲苯中24 h, 即得到反蛋白石凝膠光子晶體膜(MIPHs). 將MIPHs放入甲醇-乙酸(體積比9∶1)溶液中2 h以除去L-Trp分子, 即制得L-Trp分子印跡光子晶體水凝膠膜(L-MIPHs). Scheme 1示出了MIPHs的制備過程. 采用相同方法制得非印跡光子晶體水凝膠膜(NIPHs).

Scheme 1　Schematic illustration of the procedure for the preparation of L-MIPHs

1.4MIPHs的響應(yīng)性

將MIPHs/NIPHs浸入待測分子(由低濃度到高濃度)緩沖溶液中30 s, 用光纖光譜儀記錄Bragg衍射峰的位置(Bragg衍射光譜圖顯示的衍射峰強度均為相對值), 同時用數(shù)碼相機拍攝相應(yīng)的光學(xué)照片.

1.5MIPHs的響應(yīng)速度和重復(fù)利用性

將MIPHs浸入10-5mol/L的L-Trp緩沖溶液中, 測定Bragg衍射峰位置隨時間的變化, 即響應(yīng)速度曲線. 然后將響應(yīng)L-Trp的MIPHs浸于甲醇-乙酸溶液中2 min以除去吸附的L-Trp, 再用磷酸緩沖溶液洗滌, 其Bragg衍射峰位置即可恢復(fù)到初始水平531 nm, 證明L-Trp已經(jīng)完全洗脫, MIPHs可用于下一輪測試.

2結(jié)果與討論

2.1L-MIPHs的制備

MIPHs的制備主要包括3個連續(xù)步驟(見Scheme 1): (1) 在“三明治”結(jié)構(gòu)的膠體晶體間隙中填入分子印跡預(yù)聚物, 紫外光引發(fā)聚合; (2) 浸入去離子水中得到可從基底剝離的復(fù)合蛋白石膜; (3) 除去PS膠球及印跡分子制得MIPHs. MIPHs制備的關(guān)鍵之一是在前驅(qū)液中形成分子印跡預(yù)聚物. 本反應(yīng)中功能單體丙烯酰胺與色氨酸之間通過氫鍵相互作用可形成穩(wěn)定的復(fù)合物; 然后, 通過光聚合過程將印跡分子固定在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中, 待將其洗脫后即形成與模板分子在形狀、尺寸及功能團上相匹配的特異性識別納米空腔. 此外, 在“三明治”結(jié)構(gòu)中發(fā)生的毛細(xì)誘導(dǎo)驅(qū)使的前驅(qū)液填充可以有效減少最后制得的反蛋白石結(jié)構(gòu)的覆蓋以及膠體微球的滑動, 有助于得到高度有序的、雙連續(xù)結(jié)構(gòu)(相互貫穿的孔結(jié)構(gòu)和相互連續(xù)的聚合物凝膠)的反蛋白石凝膠光子晶體. 圖1(A)和(B)分別為制得的PS膠體晶體和反蛋白石凝膠光子晶體的掃描電子顯微鏡(SEM)照片, 可見制得的MIPHs具有相互貫穿且高度有序的三維大孔結(jié)構(gòu).

Fig.1　SEM images of PS colloidal crystals(A) and inverse opals of MIPHs(B)

2.2L-MIPHs的特異識別性

圖2示出了L-MIPHs[n(L-Trp)∶n(AM)∶n(BIS)=0.3∶20∶1.2]對模板分子的傳感性能. 由圖2(A)可見,L-MIPHs在不同濃度(0, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6和10-5mol/L)的L-Trp緩沖溶液中具有尖銳的布拉格(Bragg)衍射峰, 且隨著L-Trp濃度的增大, Bragg衍射峰位置發(fā)生紅移, 最大紅移達(dá)83 nm. 此外, 由圖3可觀察到MIPHs在不同濃度的L-Trp緩沖溶液中的顏色. 當(dāng)將L-MIPHs浸入L-Trp緩沖溶液中時,L-Trp與L-MIPHs中的印跡空腔發(fā)生相互作用, 造成水凝膠溶脹, 使得光子晶體的晶格間距增大, 從而引起B(yǎng)ragg衍射峰位置的紅移. NIPHs由于不具有印跡位點, 幾乎不能吸附印跡分子, 因此響應(yīng)性較差[圖2(B)]. MIPHs這種肉眼可見的顏色變化為L-Trp的現(xiàn)場快速檢測提供了可能.

Fig.2　Optical response of L-MIPHs(A) and NIPHs(B) upon soaking in L-Trp buffers　c/(mol5L{-1): a. 0; b. 10{-10; c. 10{-9; d. 10{-8; e. 10{-7; f. 10{-6; g.10{-5.

Fig.3　Color change induced by the rebinding of L-Trp at different concentrations　(A) Pure buffer; (B)—(G) concentration of L-Trp/(mol·L-1): 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5.

2.3印跡分子用量對L-MIPHs特異識別性的影響

由圖4可見, 隨著印跡分子用量的增加, MIPHs的Bragg衍射峰紅移量增大. 這是由于隨著前驅(qū)液中印跡分子濃度增大, 制得的L-MIPHs特異性納米識別空腔增多, 將其置于印跡分子的緩沖溶液中時, 吸附的印跡分子的量增多, 導(dǎo)致水凝膠膜溶脹程度較大, 因此Bragg衍射峰紅移量增大. 盡管印跡分子的用量對L-MIPHs的響應(yīng)性有明顯的影響, 但是由于Trp在水中溶解度的限制, 致使前驅(qū)液中印跡分子的用量并不能進一步增大.

Fig.4　Influence of of imprinting molecule content on the sensing property of L-MIPHsContent of L-Trp imprinted/(mmol5L{-1): a. 0; b. 0.1; c. 0.2; d. 0.3.

Fig.5　Influence of the crosslinking monomer(BIS) content on the sensing property of L-MIPHsn(BIS)∶n(AM): a. 4%; b. 6%; c. 8%.

2.4交聯(lián)劑BIS用量對L-MIPHs特異識別性的影響

水凝膠中交聯(lián)劑用量的不同會影響水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)密度, 從而導(dǎo)致水凝膠溶脹程度的不同, 因此交聯(lián)劑的用量可能影響L-MIPHs的傳感性能. 圖5示出了交聯(lián)劑用量對L-MIPHs的傳感性能的影響. 當(dāng)交聯(lián)劑BIS與AM的摩爾比為4%時, Bragg衍射峰位置的最大紅移量為40 nm; 當(dāng)二者摩爾比為8%時, Bragg衍射峰紅移32 nm; 當(dāng)二者摩爾比為6%時, Bragg衍射峰位移最大為83 nm. 這是由于交聯(lián)劑用量較少時, 水凝膠的交聯(lián)密度不足以維持印跡位點的形狀, 將其置于L-Trp緩沖溶液中時吸附的印跡分子量相對較少, 從而導(dǎo)致水凝膠溶脹程度較小, 使得Bragg衍射峰位移較少. 這也說明MIPHs的溶脹是由于其吸附了印跡分子引起的. 而當(dāng)交聯(lián)劑用量較大時, 水凝膠交聯(lián)密度過大, 造成印跡位點剛性較強, 使其不容易吸附印跡分子, 將交聯(lián)劑用量不同的L-MIPHs置于相同濃度印跡分子緩沖溶液中時, 交聯(lián)密度過大的L-MIPHs吸附的印跡分子相對較少, 因此其Bragg衍射峰位移量就相對較小.

2.5L-MIPHs的選擇性

圖2和圖3結(jié)果表明MIPHs可對印跡分子產(chǎn)生響應(yīng), 并伴有裸眼可見的顏色變化. 但是, 評價MIPHs的分子印跡效應(yīng)還需檢測其對結(jié)構(gòu)類似物的選擇性. 由圖6可以看出,L-MIPHs在不同濃度的L-Tyr和L-Phe緩沖溶液中Bragg衍射峰位移較小, 說明L-MIPHs對印跡分子的結(jié)構(gòu)類似物具有良好的選擇性, 這是因為印跡空腔形狀記憶效應(yīng)導(dǎo)致其更容易吸附印跡分子而引起水凝膠膜溶脹程度較大, 而對其它2種結(jié)構(gòu)類似物的吸附則較少. 但是,L-MIPHs對D-Trp緩沖溶液的傳感性能與對L-Trp的響應(yīng)性能差別不大[圖6(C)], 說明制得的L-MIPHs尚不能很好地區(qū)分印跡分子的2種立體異構(gòu)體. 有關(guān)構(gòu)型異構(gòu)體的識別有待進一步研究.

Fig.6　Selectivity of L-MIPHs to L-Tyr(A), L-Phe(B), D-Trp(C) and plots of Bragg diffraction peak shifts for L-MIPHs to L-Trp(■), D-Trp(●), L-Tyr(▲), L-Phe(△) and NIPHs to L-Trp(□)(D)c/(mol5L{-1): a. 0; b. 10{-10; c. 10{-9 ; d. 10{-8; e. 10{-7; f. 10{-6; g. 10{-5.

2.6L-MIPHs的響應(yīng)速度和重復(fù)利用性

L-MIPHs的三維有序大孔結(jié)構(gòu)有利于傳質(zhì)過程, 使其可以快速產(chǎn)生響應(yīng). 圖7(A)示出了L-MIPHs在L-Trp緩沖溶液中的響應(yīng)速度. 可見,L-MIPHs的布拉格(Bragg)衍射峰在30 s時達(dá)到最大, 此后衍射峰不再隨時間變化, 說明L-MIPHs在30 s時已經(jīng)吸附飽和. 圖7(B)示出了L-MIPHs循環(huán)使用5次后的響應(yīng)結(jié)果, 可見制得的L-MIPHs具有良好的重復(fù)利用性. 此結(jié)果表明, 合適的交聯(lián)可使制得的L-MIPHs具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性.

Fig.7　Kinetic response of L-MIPHs when immersed into 10-5 mol/L L-Trp buffers(A) and recoverability of MIPHs incubated in 10-5 mol/L L-Trp buffers and then recovered in deionized water(B)

3結(jié)論

采用光引發(fā)聚合方法, 借助“三明治”結(jié)構(gòu)制備了可與基底分離的分子印跡光子晶體水凝膠膜(MIPHs). 制備的MIPHs具有高選擇性、快速響應(yīng)及自表達(dá)的特點, 還具有優(yōu)異的循環(huán)使用性能. MIPHs能選擇性地識別L-Trp, 并將特異性的識別作用轉(zhuǎn)換成可讀的光學(xué)信號. 此外, 無需依賴任何基底的水凝膠膜在現(xiàn)場檢測中應(yīng)用更加方便.

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Preparation and Characterization ofL-Tryptophan

Molecularly Imprinted Photonic Hydrogels?

YANG Zhaokun, ZHANG Xiaodong, SHI Dongjian, CHEN Mingqing, LIU Shirong*

(SchoolofChemicalandMaterialEngineering,TheKeyLaboratoryofFoodColloidsandBiotechnology,

MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)

AbstractFree-standing molecularly imprinted photonic hydrogels(MIPHs) that peeled from the supporters were prepared using the colloidal crystal template method assisted by “sandwich structure”. MIPHs were fabricated by UV polymerization withL-Tryptophan(L-Trp) as template molecule, acrylamide(AM) as functional monomer,N,N′-methylene bisacrylamide(BIS) as crosslinking agent. MIPHs were characterized by highly ordered three-dimensional interconnected macroporous structure. MIPHs showed rapid response property when immersed intoL-Trp buffers. The Bragg diffraction peak of MIPHs redshifted 83 nm as the concentration ofL-Trp increased from 10-10mol/L to 10-5mol/L, and the color changes could be visible by the naked eyes. Moreover, MIPHs showed only a slight shift in the Bragg diffraction peak in solutions ofL-Tyr orL-Phe, which indicated that MIPHs possessed a certain selectivity. High selectivety, rapid response and signal self-reporting of MIPHs might provide great convenience for the application in the real-world environments.

Keywords“Sandwich” structure; Inverse opal; Photonic crystal; Molecularly imprinted;L-Tryptophan

(Ed.: N, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.51173072).

doi:10.7503/cjcu20150513

基金項目：國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 51173072)資助.

收稿日期:2015-06-01. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-11-17.

中圖分類號O658; O648.1

文獻標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡介: 劉士榮, 男, 副教授, 主要從事功能材料研究. E-mail: liushirong1@aliyun.com