西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織VEGF、MMP9表達(dá)的影響

任征遠(yuǎn)， 馬 杰， 王一堯， 焦 戰(zhàn)， 曾常茜， 高文斌， 梁文波*

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622；2湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰442000；3大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116000）

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西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織VEGF、MMP9表達(dá)的影響

任征遠(yuǎn)1， 馬 杰2， 王一堯1， 焦 戰(zhàn)1， 曾常茜1， 高文斌3， 梁文波1*

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622；2湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰442000；3大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116000）

摘要:目的 通過(guò)檢測(cè)西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （MMP9）表達(dá)的影響，探討西黃丸對(duì)形成腫瘤微環(huán)境炎性相關(guān)因子調(diào)控作用。方法小鼠隨機(jī)分為6組建立荷瘤小鼠模型。藥物治療14 d后，取外周血，取瘤稱重，計(jì)算抑瘤率；用蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫法分別檢測(cè)乳腺荷瘤小鼠腫瘤組織和外周血中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)水平。結(jié)果 西黃丸高劑量組抑瘤率31.49％；西黃丸各組在外周血、腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)量均低于模型對(duì)照組，其中西黃丸高劑量組與模型對(duì)照組相比較作用明顯（P＜0.05）。結(jié)論 西黃丸能夠抑制乳腺荷瘤小鼠炎性相關(guān)因子的表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，具有逆轉(zhuǎn)免疫逃逸的趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞:西黃丸；炎性相關(guān)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；金屬基質(zhì)蛋白酶9

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.047

西黃丸作為抗腫瘤的中成藥已流傳幾百年，臨床主要用于各種癌癥的治療及輔助治療，改善中晚期癌癥患者的臨床癥狀，提高生活質(zhì)量。本課題組前期研究表明西黃丸可通過(guò)調(diào)節(jié)荷瘤鼠機(jī)體免疫及炎性相關(guān)因子TGF-β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β）、IFN-γ（干擾素-γ）、IL-2（白介素-2）、IL-6（白介素-6）、IL-8（白介素-8）等的表達(dá)提高機(jī)體免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤的作用［1-2］，但對(duì)其調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境相關(guān)炎癥因子VEGF、MMP9以及對(duì)腫瘤炎性微環(huán)境的作用尚未系統(tǒng)研究。本研究采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合腫瘤免疫編輯理論，探討西黃丸對(duì)形成腫瘤微環(huán)境中炎性相關(guān)因子調(diào)控作用，以及改善腫瘤微環(huán)境和逆轉(zhuǎn)免疫逃逸作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 小鼠乳腺癌細(xì)胞株（4T1）源自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。清潔級(jí)雌性BALB/C小鼠，體質(zhì)量18～22 g，60只，均購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào): SCKK（遼）2008-0002。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀ELX800產(chǎn)自于美國(guó)BioTek公司；美國(guó)Bio-Rid生產(chǎn)的基礎(chǔ)電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽；美國(guó)Biorad chemidoc xRS +核酸蛋白分子凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 主要試劑 上海朗頓生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ELISA （VEGF、MMP9）試劑盒；ANTI-VEGF antibody ab9570、ANTI-MMP9 antibody ab38898購(gòu)于上海艾博抗貿(mào)易有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔1gG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)藥物 北京同仁堂制藥廠所制的西黃丸，每瓶含有量3 g，每20粒質(zhì)量為1 g，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z1040991。由浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產(chǎn)的每片含有量0.1 g香菇多糖片，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z120501。依據(jù)人鼠劑量換算公式（參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》: db=da×（rb/ra）×（wa-3/w-3b），其中a為人，b為鼠，d為人的給藥劑量，r為鼠的表面積參數(shù)，w為體質(zhì)量；運(yùn)用劑量公式要求給藥劑量分別為正常劑量的2倍、5倍）求得西黃丸正常劑量、2倍劑量、5倍劑量分別為0.39、0.78、1.95 g/kg；香菇多糖為0.045 g/kg；依次稱取西黃丸0.98、1.95、4.88 g；香菇多糖片0.23 g，碾碎，分別加入蒸餾水，使其充分溶解，定容至28 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 模型建立與分組給藥 小鼠乳腺癌細(xì)胞株（4T1）經(jīng)培養(yǎng)和胰蛋白酶消化處理后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞用PBS調(diào)整為2×106/mL待用。隨機(jī)分成6組的60只BALB/c小鼠，抽取1組作為正常組，不作處理；其余小鼠右腋下碘伏消毒，抽取上述細(xì)胞0.1 mL（2×105個(gè)）分別接種于其他小鼠右腋內(nèi)側(cè)皮下，完成荷瘤小鼠模型的建立。自建模后的第2日開(kāi)始，按照每天2次，每10 g體質(zhì)量0.2 m L，連續(xù)灌胃給藥14 d。模型對(duì)照組和正常組給予等體積的蒸餾水。

1.6 小鼠抑瘤率的測(cè)定 末次給藥后小鼠禁食12 h，小鼠眼球取血后斷頸處死，鈍性剝離瘤組織，取瘤稱質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑瘤率。腫瘤抑瘤率（％）=（模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-治療后平均瘤質(zhì)量）/模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100％。

1.7 酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)乳腺癌荷瘤小鼠外周血中VEGF、MMMP9表達(dá)水平 取小鼠血液0.5 mL置放于37℃水浴箱中水浴充分收縮后，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中VEGF、MMP9的水平，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定D（光密度）值，隨后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)VEGF和MMP9的量計(jì)算結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western b1ot)法檢測(cè)乳腺荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP9表達(dá)水平 取20 mg腫瘤組織在液氮中粉碎，RIPA裂解液裂解蛋白提取上清液；各樣本取20 μL上清液做蛋白定量分析比較；80 μg樣品蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳（5％濃縮膠80 V，10％分離膠150 V）；300 mA分別轉(zhuǎn)膜45 min（VEGF）、95 min（MMP9）；TBST漂洗3次，每次10 min，轉(zhuǎn)膜后的聚偏氟乙烯（PVDF）膜用TBST溶解的10％牛血清蛋白封閉過(guò)夜；PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10 min，TBST溶解的5％牛血清蛋白分別與一抗（1 000: 1 MMP9、2 500: 1 VEGF）孵育2 h或過(guò)夜；PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10 min，TBST與羊抗兔二抗5 000: 1孵育二抗2 h，漂洗3次，每次10 min，PVDF膜ECL染色，Biorad chemidoc xRS +核酸蛋白分子凝膠成像系統(tǒng)顯像曝光，用ImageJ軟件對(duì)Western b1ot的結(jié)果圖像進(jìn)行處理，計(jì)算各樣本的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用 西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠的腫瘤具有明顯抑制作用，其中高劑量組抑瘤率31.49％，模型對(duì)照組與高劑量組平均瘤重的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　西黃丸對(duì)不同劑量乳腺荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用（±s，n=10）

表1　西黃丸對(duì)不同劑量乳腺荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用（±s，n=10）

注:與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別　　劑量/（g·kg-1）　瘤質(zhì)量/g　抑瘤率/％模型對(duì)照　　—　0.31±0.13　　—陽(yáng)性藥物　0.045　 0.27±0.08　 11.04西黃丸低劑量組　0.390　 0.28±0.03　9.42西黃丸中劑量組　0.780　 0.26±0.07　 15.58西黃丸高劑量組　1.950　 0.21±0.06△31.49

2.2 西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠外周血VEGF、MMP9表達(dá)量的作用 在乳腺荷瘤小鼠外周血中VEGF、MMP9表達(dá)上，西黃丸各劑量組含有量均低于模型對(duì)照組。在外周血中VEGF表達(dá)量上西黃丸各劑量組與模型對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中正常對(duì)照組與西黃丸高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽(yáng)性藥物

（香菇多糖）組與西黃丸高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。西黃丸高劑量組與模型對(duì)照組比較，外周血中MMP9表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2　西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠外周血中V EGF、MMP 9表達(dá)量的作用（±s，n=10）

表2　西黃丸對(duì)乳腺荷瘤小鼠外周血中V EGF、MMP 9表達(dá)量的作用（±s，n=10）

注:與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與陽(yáng)性藥物組比較，*P＜0.05

組別　　劑量/ （g·kg-1）VEGF/ （ng·L-1）MMP9/ （ng·L-1）正常對(duì)照　　—　269±50.1△　301±63.3模型對(duì)照　　—　405±32.8　 394±69.9陽(yáng)性藥物　0.045　 345±55.3△　319±89.7西黃丸低劑量組　0.390　 339±29.4△　353±33.9西黃丸中劑量組　0.780　 334±20.1△　321±28.5西黃丸高劑量組　1.950　 290±64.1△*　311±32.6△

2.3 西黃丸對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP9表達(dá)影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，西黃丸高、中、低劑量組在小鼠腫瘤組織中的MMP9和VEGF表達(dá)量上，明顯低于模型對(duì)照組。模型對(duì)照組與西黃丸各劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），陽(yáng)性藥物組明顯高于西黃丸中、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而西黃丸低劑量組和陽(yáng)性藥物組之間及西黃丸高劑量組與中劑量組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1和表3。

注: 1.模型對(duì)照組；2.陽(yáng)性藥物；3.西黃丸低劑量組；4.西黃丸中劑量組；5.西量黃丸高劑量組圖1　We r s t e r nb l o t檢測(cè)

表3　西黃丸對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF、MMP 9灰度值的影響（±s，n=10）

表3　西黃丸對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF、MMP 9灰度值的影響（±s，n=10）

注:與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽(yáng)性藥物組比較，*P＜0.05

組別　VEGF　MMP9模型對(duì)照　36 176±5 813　28 198±5 316陽(yáng)性藥物　23 764±5 719△　19 753±5 458△西黃丸低劑量組　22 673±5 345△　20 742±5 743△西黃丸中劑量組　15 993±4 700△△*　11 471±5 083△△*西黃丸高劑量組　10 282±5 108△△*　8 975±5 216△△*

3 討論

西黃丸是由麝香、牛黃、沒(méi)藥（醋制）、乳香（醋制）4味名貴中藥組成，有著清熱解毒、合營(yíng)消腫的藥性，現(xiàn)今臨床上對(duì)于癌癥的治療和輔助治療應(yīng)用廣泛，其具有抗腫瘤，減少放化療的毒副作用，改善微循環(huán)，提高免疫力，鎮(zhèn)痛消炎等功效。研究表明牛黃能促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能，提高機(jī)體免疫力，有助于控制腫瘤發(fā)展［3］。麝香具有較強(qiáng)的抗炎，鎮(zhèn)痛作用，能夠抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)延長(zhǎng)生存期，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用［4］；麝香酮有抗腫瘤新生血管形成的作用［5］。體外實(shí)驗(yàn)表明乳香揮發(fā)油對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。沒(méi)藥的各種劑型都有良好的化瘀消腫作用［6］。

免疫編輯理論認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展一方面取決于腫瘤細(xì)胞本身，還取決于腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境，生存的土壤［7］。腫瘤微環(huán)境是正常組織和相鄰腫瘤細(xì)胞之間的部位，其組成包括腫瘤基質(zhì)細(xì)胞，可溶性分子和細(xì)胞外基質(zhì)［8］。腫瘤起始細(xì)胞賴以生長(zhǎng)的支架和屏障由腫瘤微環(huán)境構(gòu)建［9］。在腫瘤微環(huán)境中，由于缺氧和炎癥，間質(zhì)細(xì)胞會(huì)被腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量的炎性相關(guān)因子、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)降解酶、及細(xì)胞趨化因子，包括IL-6、TGF-β、IL-10、MMP9、COX-2（環(huán)氧化酶-2）、VEGF等，通過(guò)孕育腫瘤干細(xì)胞、誘生新生血管和抑制免疫反應(yīng)等方式促進(jìn)腫瘤發(fā)展。IL-6、IL-10、TGF-β等抑制性炎性因子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制性T細(xì)胞等一系列抑制性細(xì)胞，在腫瘤周?chē)纬梢幻庖咭种频挠质茄装Y的微環(huán)境［10］。免疫抑制的炎性微環(huán)境的形成，會(huì)造成機(jī)體內(nèi)腫瘤識(shí)別細(xì)胞及殺傷細(xì)胞的功能降低或無(wú)能，炎癥的微環(huán)境促進(jìn)炎癥抑制性因子產(chǎn)生，進(jìn)而加重免疫抑制。研究證明在炎癥和免疫抑制因子作用下，MMP9它以酶原的形式分泌，被激活后，形成Ⅳ膠原酶，破壞、降解靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)中的V型、Ⅳ型膠原和明膠。然后腫瘤細(xì)胞在缺失的基底膜的基礎(chǔ)上向周?chē)M織浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。同樣在炎癥和缺氧的微環(huán)境下，VEGF通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，在腫瘤血管新生中起重要作用，同時(shí)能夠誘導(dǎo)促進(jìn)淋巴管的形成。腫瘤血管生成主要需要內(nèi)皮移行增殖和內(nèi)皮移行通道形成，內(nèi)皮移行增殖主要是由VEGF因子參與執(zhí)行。內(nèi)皮移行通道形成主要由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）介導(dǎo)，MMP9參與水解血管與腫瘤之間基質(zhì)，為內(nèi)皮細(xì)胞移行打下基礎(chǔ)。有研究表明，由原發(fā)腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)特殊MMP9表達(dá)，后者通過(guò)VEGF受體酪氨酸激酶導(dǎo)致腫瘤新干細(xì)胞形成［12］。腫瘤的轉(zhuǎn)移和免疫抑制都與腫瘤周?chē)难装Y和缺氧微環(huán)境密切相關(guān)，對(duì)這些炎性相關(guān)因子的調(diào)節(jié)，不是單純由宿主的相關(guān)細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)，而是由機(jī)體的TAM（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）、DC（樹(shù)突細(xì)胞）、Treg（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）、MDSC（髓源抑制性細(xì)胞）等和腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞和被腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)體細(xì)胞等共同參與的非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)過(guò)程，同時(shí)炎性因子與這些細(xì)胞之間通過(guò)復(fù)雜的正反饋和負(fù)反饋的關(guān)系相互影響。腫瘤微環(huán)境中缺氧和過(guò)激的炎癥反應(yīng)引起TAM、DC功能轉(zhuǎn)變和MDSC、Treg高表達(dá)和趨化，以及腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞活性增強(qiáng)，使抑制性因子大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腫瘤免疫抑制和逃逸。

楊偉［1］等研究西黃丸對(duì)乳腺癌荷瘤大鼠IL-6、TGF-β、IL-10的調(diào)節(jié)作用，證明西黃丸明顯降低乳腺癌荷瘤大鼠機(jī)體內(nèi)抑制性因子IL-6、IL-10、TGF-β的表達(dá)水平，同時(shí)提高IL-2和IFN-γ表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，西黃丸可以明顯降低VEGF、MMP9在乳腺癌荷瘤小鼠的外周血及腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平，表明西黃丸能夠減少腫瘤微環(huán)境中相關(guān)的炎性因子，進(jìn)而能夠弱化或逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，提高乳腺癌荷瘤小鼠機(jī)體的抗腫瘤的免疫功能，起到抑瘤，降低腫瘤免疫逃逸的作用。其作用機(jī)制可能是西黃丸通過(guò)抗血小板聚集和抗凝血酶活性及降低纖維蛋白原水平，改善微循環(huán)的高凝狀態(tài)促進(jìn)血液流動(dòng)，同時(shí)微循環(huán)血管開(kāi)放數(shù)量增加提高了攜氧能力，并增加了對(duì)組織的氧氣釋放量和加快酸性物質(zhì)例如乳酸的排放，降低炎性組織內(nèi)前列腺素E2（PGE2）水平，影響花生四烯酸代謝，降低白三烯等炎性物質(zhì)生成，抑制中性粒細(xì)胞的炎性物質(zhì)釋放；抑制NO產(chǎn)生和過(guò)氧化，抑制溶酶體的釋放酶；抑制炎性組織過(guò)氧化作用［13-18］，從而阻斷腫瘤組織微環(huán)境的缺氧反應(yīng)機(jī)制，逆轉(zhuǎn)腫瘤組織的缺氧和抑制腫瘤微環(huán)境的過(guò)激炎癥反應(yīng)。腫瘤組織微環(huán)境的缺氧及過(guò)激炎癥反應(yīng)的改變和西黃丸通過(guò)其他未明的調(diào)節(jié)方式，使TAM、DC等免疫細(xì)胞的功能恢復(fù)或向抑瘤方向轉(zhuǎn)變；降低MDSC、Treg表達(dá)和趨化；以及西黃丸自身對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)提高細(xì)胞毒細(xì)胞、活性T細(xì)胞等腫瘤殺傷細(xì)胞活性，進(jìn)而使IL-6、IL-10、TGF-β、MMP9、VEGF等因子表達(dá)明顯降低，提高IL-2、IFN-γ因子表達(dá)水平，最終形成逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸的趨勢(shì)。

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*通信作者:梁文波（1962—），教授，博士，從事天然藥物活性成分的分離鑒定和成分分析研究。Te1:（0411）87403409，E-mai1: d11-wb@126.com

作者簡(jiǎn)介:任征遠(yuǎn)（1974—），男，碩士生，從事臨床腫瘤及腫瘤的中藥治療及機(jī)制研究。E-mai1: rzy4622@sohu.com

基金項(xiàng)目:大連金州新區(qū)科技計(jì)劃（2012-A1-046）

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0440-04