星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽巴戟炮制工藝

黃玉秋， 范亞楠， 賈天柱，2，3， 張明璇， 邱一鋆， 史 輯，2，3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600）

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星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽巴戟炮制工藝

黃玉秋1， 范亞楠1， 賈天柱1，2，3， 張明璇1， 邱一鋆1， 史 輯1，2，3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600）

摘要:目的 優(yōu)化鹽巴戟的炮制工藝。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以加水量、悶潤(rùn)時(shí)間、蒸制時(shí)間為自變量，耐斯糖、甲基異茜草素-1-甲醚、水晶蘭苷的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選鹽巴戟的炮制工藝。結(jié)果最佳炮制工藝為加水1.05倍，悶潤(rùn)5.48 h，蒸制2.90 h（100 g巴戟肉加鹽1.5 g），測(cè)量值和預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為3.04％。結(jié)論 該方法得到的炮制參數(shù)準(zhǔn)確，重復(fù)性好，有一定實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞:鹽巴戟；耐斯糖；甲基異茜草素-1-甲醚；水晶蘭苷；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.028

KEY W 0RDS: sa1ted Morinda officinalis；nystose；rubiadin-1-methy1ether；monotroPein；centra1 comPosite design-resPonse surfacemethodo1ogy

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效［1］。其中，鹽巴戟是巴戟天臨床應(yīng)用最廣泛的炮制品種，經(jīng)鹽制后專入腎經(jīng)，溫而不燥，補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨作用增強(qiáng)［2］，但藥典未對(duì)其炮制工藝作嚴(yán)格規(guī)定，而且文獻(xiàn)報(bào)道不一［3-6］，致使鹽巴戟的內(nèi)在質(zhì)量有較大差異。本實(shí)驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)鹽巴戟的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其質(zhì)量評(píng)價(jià)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)（centra1 comPosite design，CCD）是一種多因素5水平的設(shè)計(jì)方法，與常用的正交設(shè)計(jì)法相比，不但具有非線性擬合的特點(diǎn)，而且其結(jié)果可以用效應(yīng)面法（resPonse surface method，RSM）進(jìn)行優(yōu)化，能較好地對(duì)因變量與自變量的關(guān)系進(jìn)行描述，使最佳試驗(yàn)條件在一個(gè)更小的范圍內(nèi)。該方法精密度高，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值更接近，而且所用實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，目前在制劑工藝和處方優(yōu)化中較常用，但鮮見(jiàn)于炮制工藝的篩選［7-10］。本實(shí)驗(yàn)將星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法應(yīng)用到鹽巴戟的炮制中，以優(yōu)選出理想的炮制工藝。

1 儀器與材料

LC-20A型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、LC-20AB泵、LC So1ution LC工作站（日本島津公司）；Corona CAD電霧式檢測(cè)器（美國(guó)ESA公司）；E2695-2998型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；FA1004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；100 g手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（250 W、40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）。

巴戟天藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根。

耐斯糖對(duì)照品（批號(hào)292-64121，純度≥99.0％，日本W(wǎng)ako公司）；水晶蘭苷對(duì)照品（批號(hào)MUST-11062204，純度≥98.0 ％，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲基異茜草素-1-甲醚（自制，純度＞95 ％）。食鹽（延吉高麗亞食品經(jīng)銷部）；水為超純水；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的準(zhǔn)備 巴戟天用1.0倍量水浸泡，50℃下悶潤(rùn)9 h，去除木心，切段10～15 mm，干燥。然后，以此工藝得出的巴戟肉來(lái)制備鹽巴戟。

2.2 耐斯糖的含有量測(cè)定［1，11-12]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取耐斯糖對(duì)照品128 mg，甲醇∶水（3∶97）定容至500 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件 Ecosi1C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 mm），包括Corona CAD電霧式檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇∶水（3∶97）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30℃，見(jiàn)圖1。

2.2.3 供試品溶液的制備及樣品測(cè)定 精密稱取不同炮制方法制得的鹽巴戟粉末（過(guò)60目篩）0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min，過(guò)濾，棄去濾液，揮干，濾渣再加70％乙醇50 mL，相同條件下超聲處理，過(guò)濾，回收乙醇，用甲醇-水（3∶97）定容至25 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。在“2.2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行操作，測(cè)得峰面積，計(jì)算含有量。

2.3 水晶蘭苷的含有量測(cè)定［12]

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取水晶蘭苷對(duì)照品15.8 mg，80％甲醇定容至50 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3.2 色譜條件 Venusi1 MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1 ％磷酸水溶液，梯度洗脫（5∶95→28.8∶71.2，15 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫25℃，見(jiàn)圖2。

2.3.3 供試品溶液的制備及樣品的測(cè)定 精密稱取不同炮制方法制得的鹽巴戟粉末（過(guò)60目篩）1 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入80％甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲（250 W、40 kHz）處理1 h，過(guò)濾，80 ％甲醇定容至10 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。在“2.3.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行操作，測(cè)得峰面積，計(jì)算含有量。

2.4 甲基異茜草素-1-甲醚的含有量測(cè)定［13]

2.水晶蘭苷2.monotroPein圖2　水晶蘭苷對(duì)照品及樣品的H P L C色譜圖Flg.2 HPLC chromatograms of monotropeln reference substance and samp le

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品2.93 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

2.4.2 色譜條件 Ecosi1C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 mm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脫（20∶80→42∶58，15 min；60∶40 →95∶5，5 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30℃，見(jiàn)圖3。

3.甲基異茜草素-1-甲醚3.rubiadin-1-methy1ether圖3　甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品及樣品的HP LC色譜圖Flg.3 HPLC chromatograms of rubladln-1-methylether reference substance and sample

2.4.3 供試品溶液的制備及樣品的測(cè)定 稱取不同炮制方法制得的鹽巴戟粉末（過(guò)60目篩）2 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加氯仿80 mL，回流提取兩次，每次2 h，合并濾液，甲醇定容至10 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。在“2.4.2”項(xiàng)色譜條件下，得到相應(yīng)的峰面積，計(jì)算含有量。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 加鹽量 取“2.1”項(xiàng)下巴戟肉5份，每份30 g，分別加入0.3、0.45、0.6、0.75、0.9 g鹽進(jìn)行炮制，按上述方法測(cè)得耐斯糖、水晶蘭苷、甲基異茜草素-1-甲醚的含有量，以加權(quán)綜合評(píng)分OD值為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)（綜合評(píng)分OD=0.4X/Xmax+0.3Y/Ymax+0.3Z/Zmax，X為耐斯糖測(cè)定值，Y為水晶蘭苷測(cè)定值，Z為甲基異茜草素-1-甲醚測(cè)定值，Xmax、Ymax、Zmax分別為各自對(duì)應(yīng)的最大測(cè)定值），滿分是1.0分。結(jié)果，綜合評(píng)分OD值分別為0.848、0.933、0.864、0.765、0.792分，故藥材加鹽0.45 g最好。

2.5.2 加水量 取“2.1”項(xiàng)下巴戟肉5份，每份30 g，各加鹽0.45 g，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0倍量的水進(jìn)行炮制，HPLC法測(cè)得3種指標(biāo)性成分的含有量，按“2.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果，OD值在加水量為1.0倍量時(shí)最高，而且低于0.8倍量時(shí)，藥材不能完全軟化，故在星點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)，中值水平設(shè)定為1.0倍量。

2.5.3 悶潤(rùn)時(shí)間 取“2.1”項(xiàng)下巴戟肉5份，每份30 g，加1.5 ％鹽水30 mL，分別悶潤(rùn)3、4、5、6、7 h后，再蒸制2 h，干燥，對(duì)不同悶潤(rùn)時(shí)間進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)悶潤(rùn)5 h效果最好。另外，當(dāng)悶潤(rùn)時(shí)間低于4 h時(shí)，水分剩余較多，不能完全吸收，故在星點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)，將悶潤(rùn)時(shí)間的最小水平設(shè)定為4 h。

2.5.4 蒸制時(shí)間 取“2.1”項(xiàng)下巴戟肉5份，每份30 g，加1.5 ％鹽水30 mL，悶潤(rùn)5 h，分別蒸制0.5、1、1.5、2、3 h，干燥，HPLC法測(cè)得3種指標(biāo)性成分的含有量，計(jì)算綜合OD值。結(jié)果，最佳蒸制時(shí)間為3 h。

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝

2.6.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，選擇加水量（A，倍）、悶潤(rùn)時(shí)間（B，h）、蒸制時(shí)間（C，h）作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)水平，以加權(quán)綜合評(píng)分OD值為指標(biāo)（計(jì)算方法同“2.5.1”項(xiàng)）。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of tests

2.6.2 模型擬合 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，用Design-Ex-Pert.V8.0.6.1軟件并以總評(píng)OD值為因變量，對(duì)自變量進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y=-15.200 6 +14.067 4A+1.912 9B+2.427 3C-0.068AB+ 0.539 7AC+0.015 6BC-7.297 8A2-0.172 2B2-0.53C2（r=0.912 6，P=0.000 3），r較大，說(shuō)明模型擬合度高，預(yù)測(cè)性較好。方差分析見(jiàn)表3，可見(jiàn)A（加水量）和C（蒸制時(shí)間）對(duì)總評(píng)OD值的影響較為顯著（P＜0.05）。

表3　方差分析Tab.3 Analysls of varlance

2.6.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè)性評(píng)價(jià) 根據(jù)所擬合的回歸方程，應(yīng)用Design-ExPert.V8.0.6.1軟件，分別繪制總評(píng)OD值與影響較顯著的兩個(gè)因素的三維效應(yīng)面，確定最佳工藝區(qū)域，篩選最佳炮制工藝，見(jiàn)圖4。

圖4　各因素的三維效應(yīng)面Flg.4 Three-d lmenslonal response surfaces of varlous factors

由圖可知，在A、B兩個(gè)因素中，隨著A（加水量）的增加，曲面慢慢變得陡峭，而B（悶潤(rùn)時(shí)間）對(duì)曲面影響較小，隨著其改變，曲面較平滑；在A、C兩個(gè)因素中，隨著兩者的增加，總評(píng)OD值也在增加，直到達(dá)到一個(gè)最大值；B、C兩因素跟A、C較相似。由此表明，A和C影響較顯著，而B影響較小。

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design-ExPert.V8.0.6.1軟件計(jì)算，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，得出鹽巴戟的最佳炮制工藝為加水1.05倍量，悶潤(rùn)5.48 h，蒸制2.90 h （100 g巴戟肉加鹽1.5 g）。按照篩選出的最優(yōu)炮制工藝條件重復(fù)3次，得出平均實(shí)際測(cè)定值（0.913 9），與理論預(yù)測(cè)值（0.942 6）的相對(duì)誤差為3.04％（相對(duì)誤差=［預(yù)測(cè)值-實(shí)際值］/預(yù)測(cè)值），小于5％，說(shuō)明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法得到的鹽巴戟炮制工藝技術(shù)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

3 討論

鹽巴戟的補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨作用相比巴戟肉有所增強(qiáng)，原因是其在炮制過(guò)程中，化學(xué)成分發(fā)生了變化。目前認(rèn)為，巴戟天寡糖具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、抗衰老、抗抑郁以及提高細(xì)胞免疫的功能，而耐斯糖是其中含有量較高的成分，《中國(guó)藥典》2010版中就是以耐斯糖的含有量變化來(lái)評(píng)價(jià)巴戟天質(zhì)量的優(yōu)劣。另外，巴戟天中具有抗風(fēng)濕作用的環(huán)烯醚萜苷類成分，如水晶蘭苷等具有明確的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，而甲基異茜草素-1-甲醚等茜草素型蒽醌可能是其發(fā)揮補(bǔ)益作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。由于巴戟天經(jīng)鹽蒸后，耐斯糖、水晶蘭苷、甲基異茜草素-1-甲醚的含有量均有所增加［12］，因此以這3個(gè)成分為指標(biāo)，對(duì)鹽巴戟炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，客觀科學(xué)地評(píng)價(jià)其飲片質(zhì)量，提高其在臨床上的藥效。

本實(shí)驗(yàn)選擇星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，用非線性數(shù)學(xué)模型對(duì)模型進(jìn)行擬合，用三維效應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，可直接看出最佳效應(yīng)區(qū)域。該方法具有較高的可靠性，得到的最佳工藝條件穩(wěn)定精密，而且重復(fù)性好，比常用的正交設(shè)計(jì)更直觀形象，說(shuō)明其應(yīng)用于巴戟天的炮制工藝研究是有效可行的。

參考文獻(xiàn):

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典: 2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010: 75.

［2］ 崔 妮，史 輯，賈天柱.巴戟天不同炮制品補(bǔ)腎壯陽(yáng)作用的比較研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（22）: 3898-3901.

［3］ 胡昌江，周弋芠，李金連，等.鹽炙巴戟天工藝研究［J］.中成藥，2009，31（12）: 1890-1893.

［4］ 許冬瑾，伍小妹，黃 云，等.鮮巴戟天鹽制工藝［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（12）: 50-52.

［5］ 王成永，金傳山，吳德玲，等.鹽巴戟天炮制工藝改進(jìn)實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24 （4）: 46-47.

［6］ 鄒 兵，馬雪松，佟連琨，等.鹽巴戟天炮制工藝的優(yōu)化［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，8（34）: 223-226.

［7］ 史亞軍，王昌利，趙海峰，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選止鼾顆粒成型工藝［J］.中成藥，2014，36（9）: 1863-1866.

［8］ 朱可馨，王志成，王 冰，等.白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒的處方和制備工藝優(yōu)化［J］.中成藥，2015，37（2）: 409-412.

［9］ 石慶平，張志濤，丁 峰，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化薯蕷總皂苷口腔崩解片處方［J］.中成藥，2014，36（12）: 2508-2511.

［10］ 符少蓮，馮翠娟，李 莎.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化脂溶性丹參提取物速釋滴丸處方工藝［J］.中成藥，2013，35 （4）: 690-695.

［11］ 景海漪，史 輯，崔 妮，等.巴戟天炮制前后寡糖類成分HPLC-CAD指紋圖譜研究［J］.中草藥，2014，45（10）: 1412-1417.

［12］ 景海漪，史 輯，崔 妮，等.不同炮制方法對(duì)巴戟天中寡糖類成分和水晶蘭苷含量的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（17）: 20-23.

［13］ 崔 妮，史 輯，賈天柱.巴戟天不同炮制品HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2014，45（13）: 1871-1875.

0 ptlm lzatlon of the processlng procedure of salted Morinda officinalis by central com poslte deslgn-reponse surfacemethodology

HUANG Yu-qiu1， FAN Ya-nan1， JIA Tian-zhu1，2，3， ZHANG Ming-xuan1， QIU Yi-yun1，SHI Ji1，2，3*
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；2.Key Laboratory of Processing PrinciPle Analysis，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；3.Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

ABSTRACT:AIM To oPtimize the Processing Procedure of sa1ted Morinda officinalis.METH0 DS On the basis of sing1e factor exPeriment，water addition，moistening time and steaming time were taken as indePendent variab1es.The comPrehensive scores of nystose，rubiadin-1-methy1ether and monotroPein were taken as eva1uation indexes.Then centra1 comPosite design-resPonse surface methodo1ogy was aPP1ied to oPtimizing the Processing Procedure of sa1ted Morinda officinalis.RESULTS The oPtimized Processing Procedure was 1.05 times forwater addition，5.48 hours formoistening time and 2.9 hours for steaming time（100 g Morinda officinalis was added with 1.5 g sa1t）.The re1ative error between themeasured va1ue and forecast va1uewas3.04％.C0NCLUSI0N The Processing Parameters obtained by thismethod are accuratewith good reProducibi1ity，having a certain Practica1significance.

*通信作者:史 輯（1977—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥炮制化學(xué)研究。Te1:（0411）85890146，E-mai1: 1nshiji@ 163.com

作者簡(jiǎn)介:黃玉秋（1989—），女，碩士，從事中藥炮制原理研究。Te1:（0411）85890157，E-mai1: hyq198996@126.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81001635）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81473350）

收稿日期:2015-06-29

中圖分類號(hào):R283

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0361-05