補(bǔ)腎活血方與其組方藥材指紋圖譜的相關(guān)性

王紫燕， 張 梅*， 李春沁， 劉美琳， 董佳悅， 穆敏婕， 謝學(xué)軍

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都610075）

?

補(bǔ)腎活血方與其組方藥材指紋圖譜的相關(guān)性

王紫燕1， 張 梅1*， 李春沁1， 劉美琳1， 董佳悅1， 穆敏婕1， 謝學(xué)軍2*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都610075）

摘要:目的 建立補(bǔ)腎活血方（地黃、丹參、葛根、人參）的HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜，研究該方與其組方藥材指紋圖譜的相關(guān)性。方法 通過(guò)HPLC-DAD-ELSD法建立復(fù)方及各單味藥材指紋圖譜，以色譜峰保留時(shí)間和紫外光譜信息為考察指標(biāo)。結(jié)果 補(bǔ)腎活血方HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜中標(biāo)定了35個(gè)共有峰，其中有10個(gè)色譜峰來(lái)自丹參，9個(gè)來(lái)自葛根，9個(gè)來(lái)自人參，地黃對(duì)共有峰的貢獻(xiàn)不明顯。另外，1個(gè)色譜峰為丹參和葛根共有，6個(gè)色譜峰不能明確其來(lái)源。結(jié)論 HPLC-DAD建立的指紋圖譜反映丹參和葛根中化學(xué)成分的相似度較高（均大于0.8），而HPLCELSD建立的指紋圖譜反映人參中化學(xué)成分的相似度相對(duì)偏低。

關(guān)鍵詞:補(bǔ)腎活血方；組方藥材；指紋圖譜；HPLC-DAD-ELSD

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.024

KEY W 0RDS: Bushen Huoxue PrescriPtion；re1evant herbs；fingerPrints；HPLC-DAD-ELSD

糖尿病是世界各國(guó)日益關(guān)注的公共健康問(wèn)題，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinoPathy，DR）是導(dǎo)致糖尿病患者失明的最主要、最嚴(yán)重、最棘手的并發(fā)癥，也是世界四大致盲眼病之一。中醫(yī)藥在改善糖尿病患者的視力損害，延緩DR的發(fā)生發(fā)展，促使發(fā)生病理變化的眼底恢復(fù)以及改善提高患者全身整體狀況和生活質(zhì)量方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，顯示出廣闊的前景。補(bǔ)腎活血方由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科謝學(xué)軍教授等研制而成，由地黃、丹參、葛根、人參等中藥配伍組成，用于防治糖尿病性視網(wǎng)膜病變，效果良好［1］。謝學(xué)軍課題組對(duì)其防治DR的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，已取得多項(xiàng)研究結(jié)果［2-7］，但對(duì)該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制的研究還鮮有報(bào)道。

中藥指紋圖譜已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的一種有效手段，它能夠較全面地反映出中藥質(zhì)量的綜合信息［8］。中藥復(fù)方由組方中藥配伍而成，文獻(xiàn)［9-13］報(bào)道，在分別建立復(fù)方與單味藥材指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究其色譜峰之間的相關(guān)性，歸屬?gòu)?fù)方色譜峰的來(lái)源，分析復(fù)方與單味藥材化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)性，可為復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用HPLCDAD-ELSD法建立補(bǔ)腎活血方指紋圖譜，并對(duì)復(fù)方化學(xué)成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agi1ent 1200高效液相色譜儀，包括Agi1ent 1200四元泵、Agi1ent 1200色譜工作站、DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agi1ent公司）；A11tech 3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)A11tech公司）；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版，國(guó)家藥典委員會(huì)）；KQ-3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海右一儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）；純凈水（Mi11i-Q純水制備系統(tǒng)制備，0.45 μm濾膜濾過(guò)）。

地黃、丹參、葛根、人參購(gòu)自成都市荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定，分別為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥塊根、唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根、豆科植物甘葛藤粉葛Pueraria thomsoni i Benth.的干燥根、五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥細(xì)支根或須根。

丹酚酸B（sa1viano1ic acid B）、葛根素（Puerarin）、人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98％。

2方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 按照課題組提供的方法制備樣品［1］。取復(fù)方粉末0.2 g，加甲醇5 mL超聲溶解，離心（3 000 r/min）10 min，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜備用。單味藥、復(fù)方陰性的處理方法同復(fù)方，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取上述對(duì)照品適量，甲醇超聲溶解，合并至同一量瓶中，甲醇定容，即得。

2.3 色譜條件 Inertsi1 ODS-SP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05％甲酸水（B）；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；漂移管溫度50℃；載氣流量2.5 L/min；增益值1；線性梯度洗脫（0～10 min，1％～10％A；10～15 min，10％～16％A；15～27 min，16％～23％A；27～50 min，23％～39％A；50～60 min，39％～50％ A；60～65 min，50％～70％ A；65～70 min，70％～100％A）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（S1），在“2.3”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果，在各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD中，DAD檢測(cè)器小于1％，ELSD檢測(cè)器小于3％；在各共有峰的相對(duì)峰面積RSD中，DAD檢測(cè)器小于1％，ELSD檢測(cè)器小于3％，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（S1），在“2.3”項(xiàng)色譜條件下，于0、3、6、12、18、24 h進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果，在各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD中，DAD檢測(cè)器小于2％，ELSD檢測(cè)器小于5％；在各共有峰的相對(duì)峰面積RSD中，DAD檢測(cè)器小于1％，ELSD檢測(cè)器小于3％，說(shuō)明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（S1）6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果，在各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD中，DAD檢測(cè)器小于2％，ELSD檢測(cè)器小于5％；在各共有峰的相對(duì)峰面積RSD中，DAD檢測(cè)器小于3％，ELSD檢測(cè)器小于5％，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.5 HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜的建立及特征峰的標(biāo)定 取10批樣品（來(lái)源見(jiàn)表1），按“2.1”和“2.3”項(xiàng)下方法操作，根據(jù)供試品溶液HPLC譜的相關(guān)系數(shù)來(lái)比較供試品譜圖。結(jié)果，DAD檢測(cè)器中有23個(gè)峰是各批供試品所共有的，ELSD檢測(cè)器中有12個(gè)峰是各供試品所共有的，因此確定這35個(gè)峰為共有指紋峰，色譜圖見(jiàn)圖1～2。其中，8號(hào)峰為葛根素（參照峰），20號(hào)峰為丹酚酸B，5'號(hào)峰為人參皂苷Rg1，9'號(hào)峰為人參皂苷Rb1（參照峰）。

表1　1 0批樣品的來(lái)源Tab.1 Sources of ten batches of samples

圖1　補(bǔ)腎活血方HP LC-DAD對(duì)照指紋圖譜Flg.1 HPLC-DAD reference flngerprlnt of Bushen Huoxue prescrlptlon

圖2　補(bǔ)腎活血方HPLC-ELSD對(duì)照指紋圖譜Flg.2 HPLC-ELSD reference flngerprlnt of Bushen Huoxue prescrlptlon

2.6 指紋圖譜相似度分析 應(yīng)用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”軟件，以10批樣品的指紋生成對(duì)照指紋圖譜R，并評(píng)價(jià)其相似度。指紋圖譜見(jiàn)圖3～4。相似度結(jié)果見(jiàn)表2～3。

圖3　補(bǔ)腎活血方HPLC-DAD指紋圖譜Flg.3 HPLC-DAD flngerp rlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon

圖4　補(bǔ)腎活血方HPLC-ELSD指紋圖譜Flg.4 HPLC-ELSD flngerprlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon

表2　DAD檢測(cè)器中1 0批樣品相似度Tab.2 Slm llarltles of ten batches of sam p les ln DAD detector

表3　E LSD檢測(cè)器中1 0批樣品相似度Tab.3 Slm llarltles of ten batches of samples ln ELSD detector

2.7 復(fù)方與藥材指紋圖譜相關(guān)性分析 采用HPLC-DAD-ELSD法，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下操作，得到復(fù)方、藥材、復(fù)方陰性供試品的指紋圖譜，以色譜峰保留時(shí)間和紫外光譜特征為指標(biāo)，考察相關(guān)性，對(duì)復(fù)方化學(xué)指紋圖譜的峰歸屬進(jìn)行分析。結(jié)果，有10個(gè)色譜峰來(lái)自丹參（圖5），9個(gè)來(lái)自葛根（圖6），9個(gè)來(lái)自人參（圖7），地黃對(duì)復(fù)方共有峰的貢獻(xiàn)不明顯。另外，1個(gè)色譜峰為丹參和葛根共有，6個(gè)色譜峰不能明確其來(lái)源。

圖5　復(fù)方與丹參藥材HPLC-DAD圖譜Flg.5 HPLC-DAD chromatogram s of p rescrlptlon and Salvia m iltiorrhiza Bge.

圖6　復(fù)方與葛根藥材HPLC-DAD圖譜Flg.6 HPLC-DAD chromatogram s of prescrlptlon and Pueraria thomsoni l Benth.

圖7　復(fù)方與人參藥材HPLC-ELSD圖譜Flg.7 HPLC-ELSD chromatograms of prescrlptlon and Panax ginseng C.A.M ey.

3 討論

3.1 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)中10批補(bǔ)腎活血方由不同來(lái)源的單味藥材隨機(jī)組合而成。HPLCDAD建立的指紋圖譜主要反映復(fù)方中丹參和葛根藥材所含的化學(xué)成分，其相似度較高（均大于0.8），說(shuō)明不同產(chǎn)地兩者化學(xué)成分的差異較小；HPLC-ELSD建立的指紋圖譜主要反映復(fù)方中人參的化學(xué)成分，其相似度相對(duì)偏低，說(shuō)明不同產(chǎn)地和貯存時(shí)間下，人參的成分有一定差異。

3.2 檢測(cè)方式的選擇 將DAD與ELSD檢測(cè)器聯(lián)用，同時(shí)檢測(cè)到有紫外吸收、紫外末端吸收以及無(wú)紫外吸收的成分，得到一次進(jìn)樣后同時(shí)測(cè)定不同成分的指紋圖譜，省時(shí)方便。

3.3 洗脫條件的考察 補(bǔ)腎活血方成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.05％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.5％冰乙酸水、甲醇-0.05％甲酸水等流動(dòng)相的等度及梯度洗脫條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.05％甲酸水梯度洗脫時(shí)，各色譜峰基本分離。3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 對(duì)DAD檢測(cè)器所得的指紋圖譜進(jìn)行了190～400 nm的全波長(zhǎng)掃描，重點(diǎn)考察了250、254、270、286 nm幾個(gè)波長(zhǎng)下的峰數(shù)目和峰形。結(jié)果表明，在250 nm波長(zhǎng)下，指紋圖譜色譜峰的數(shù)目最多，峰形較優(yōu)。

3.5 ELSD檢測(cè)器參數(shù)的考察 分別對(duì)漂移管溫度（45、50℃）及載氣流量（1.5、2.0、2.5 L/min）等參數(shù)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，漂移管溫度為50℃，載氣流量為2.5 L/min時(shí)，色譜圖基線信噪比最優(yōu)，色譜峰分離良好。

3.6 復(fù)方與組方藥材相關(guān)性分析 比較復(fù)方與組方藥材的色譜圖發(fā)現(xiàn)，組方藥材對(duì)共有峰的貢獻(xiàn)為丹參（5、10、15～21、23）、葛根（6～9、11～14、22）、人參（3'～5'、7'～12'），而且1號(hào)峰為丹參和葛根共有。丹參和葛根的大部分色譜峰都能與復(fù)方對(duì)應(yīng)，有良好的相關(guān)性，但人參60 min后的色譜峰在復(fù)方中沒(méi)有體現(xiàn)，可能是由于復(fù)方在煎煮過(guò)程中，成分之間相互發(fā)生作用，某些成分轉(zhuǎn)化或損失而導(dǎo)致。2～4、1'、2'、6'號(hào)峰來(lái)源不清，是否是組方藥材共煎時(shí)產(chǎn)生的新成分暫不能確定。綜上所述，復(fù)方與組方藥材的成分存在差異，兩者之間并非簡(jiǎn)單的加和關(guān)系。

同時(shí)，采用DAD檢測(cè)器在203 nm波長(zhǎng)下，對(duì)復(fù)方與地黃的相關(guān)性進(jìn)行研究，但地黃對(duì)復(fù)方共有峰的貢獻(xiàn)不明顯。究其原因，復(fù)方中環(huán)烯醚萜類(lèi)、酚酸類(lèi)及異黃酮類(lèi)成分的極性均較大，酚酸類(lèi)及異黃酮類(lèi)成分的峰面積遠(yuǎn)大于環(huán)烯醚萜類(lèi)，而且末端檢測(cè)基線不平穩(wěn)，環(huán)烯醚萜類(lèi)成分受到較強(qiáng)干擾。因此，在兼顧復(fù)方各類(lèi)成分分析時(shí)，沒(méi)能體現(xiàn)該類(lèi)成分對(duì)復(fù)方的貢獻(xiàn)，有待于作進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方成分的來(lái)源歸屬作了初步研究，為闡明補(bǔ)腎活血方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)于復(fù)方各成分的結(jié)構(gòu)確定，還需結(jié)合HPLCDAD-MS、UPLC-Q-TOF/MS及UPLC-Q-TOF-MS/ MS等手段進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn):

［1］ 謝學(xué)軍，張 梅，王明芳.一種中藥組合物及其制備方法:中國(guó)，200910308470.3［P］.2010-03-03.

［2］ 萬(wàn) 李，謝學(xué)軍，馬 榮.補(bǔ)腎活血中藥血清對(duì)缺氧條件下純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制［J］.中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2014，32（3）: 211-215.

［3］ 馬殿偉，謝學(xué)軍，張 梅，等.補(bǔ)腎活血?jiǎng)?duì)高糖和（或）缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力及谷氨酰胺合成酶活性的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2014，34（6）: 510-513.

［4］ 姚紅娥，張 梅，徐 秒，等.人參皂苷對(duì)糖基化終末產(chǎn)物條件下視網(wǎng)膜Mü11er細(xì)胞活力的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（9）: 157-161.

［5］ 馬殿偉，謝學(xué)軍，張 梅，等.補(bǔ)腎活血?jiǎng)?duì)TGF-β2干預(yù)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜Mü11er細(xì)胞谷氨酸代謝的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2013，33（9）: 804-807.

［6］ 宋明霞，謝學(xué)軍，萬(wàn) 李，等.高糖及糖基化終末產(chǎn)物對(duì)視網(wǎng)膜Mü11er細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)缺氧信號(hào)通路的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2013，33（12）: 1106-1110.

［7］ 徐 秒，張 梅，姚紅娥，等.丹參脂溶性成分對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Mü11er細(xì)胞的毒性作用研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2013，28（5）: 453-455.

［8］ 詹丹丹.淺談中藥指紋圖譜研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2013，26（3）: 439-441.

［9］ 馮素香，王淑美，梁生旺，等.復(fù)方腦脈通有效部位與藥材指紋圖譜相關(guān)性研究［J］.中成藥，2010，32（5）: 701-704.

［10］ 黃春躍，楊義芳，唐博雅，等.白頭翁湯顆粒劑指紋圖譜與組方藥材及其提取物的相關(guān)性［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（2）: 175-179.

［11］ 于 艷，徐 晶，修麗麗，等.三黃滴丸的HPLC-DAD指紋圖譜及其與組方藥材的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，13（48）: 1057-1060.

［12］ 黃春躍，楊義芳，唐博雅，等.梔子厚樸湯顆粒指紋圖譜與組方藥材及其提取物的相關(guān)性研究［J］.中成藥，2013，35（8）: 1720-1723.

［13］ 楊小秋，羅文匯，董玉娟，等.厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜及其與組方藥材的相關(guān)性研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（13）: 14-19.

Relatlonshlp between the flngerprlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon and lts relevant herbs

WANG Zi-yan1， ZHANG Mei1*， LIChun-qin1， LIU Mei-1in1， DONG Jia-yue1， MU Min-jie1，XIE Xue-jun2*
（1.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicinesof Ministry of Education；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，DeveloPment and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，China；2.School of Clinical Medicine，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine，Chengdu 610075，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLC-DAD-ELSD fingerPrint of Bushen Huoxue PrescriPtion（Rehmannia glutinosa Libosch.，Salvia miltiorrhiza Bge.，Pueraria thomsoni i Benth.and Panax ginseng C.A.Mey.）and study the re1ationshiP between the fingerPrints of this PrescriPtion and its re1evantherbs.METH0DS The finger-Prints of Bushen Huoxue PrescriPtion and its re1evant herbs were estab1ished by HPLC-DAD-ELSD.The retention time and UV sPectra1information of chromatograPhic Peakswere taken as indices.RESULTS Thirty-five common Peakswere demarcated in the HPLC-DAD-ELSD fingerPrint of Bushen Huoxue PrescriPtion.Among them，tenbook=342,ebook=120Peaks came from S.miltiorrhiza，nine Peaks came from P.thomsonii，nine Peaks came from P.ginseng，and R. glutinosa did notmake a great contribution to the common Peaks.In addition，one Peak came from S.miltiorrhiza and P.Ginseng，whi1e another six Peaks cou1d not be identified.C0NCLUSI0N HPLC-DAD fingerPrint ref1ects the high simi1arities（＞0.8）of chemica1 constituents in S.Miltiorrhiza and P.Thomsonii，whi1e HPLCELSD fingerPrint revea1s the 1ow simi1arities of those in P.Ginseng.

*通信作者:張 梅（1963—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。Te1:（028）61800231，E-mai1: zhangmei63@126.com謝學(xué)軍（1963—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治眼底病的基礎(chǔ)與臨床研究。Te1:（028）87767332，E-mai1: xxj8848@163.com

作者簡(jiǎn)介:王紫燕（1991—），女（回族），碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治?。Te1: 18384257028，E-mai1: 462207970@qq.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473735）

收稿日期:2015-05-12

中圖分類(lèi)號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0341-05