甘草中5種三萜皂苷的同時(shí)測(cè)定及主成分分析

方詩(shī)琦， 瞿其揚(yáng)， 仲歡歡， 李存玉，2， 彭國(guó)平，2， 鄭云楓，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

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甘草中5種三萜皂苷的同時(shí)測(cè)定及主成分分析

方詩(shī)琦1， 瞿其揚(yáng)1， 仲歡歡1， 李存玉1，2， 彭國(guó)平1，2， 鄭云楓1，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

摘要:目的 建立HPLC法同時(shí)測(cè)定產(chǎn)于中國(guó)內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和烏茲別克斯坦的甘草中甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的含有量。方法 甘草60％乙醇提取物的分析采用Hedera ODS-2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈-0.2％甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30℃。然后，主成分分析（PCA）法對(duì)11批甘草中的三萜皂苷類成分進(jìn)行分類。結(jié)果 這5個(gè)成分均顯示出良好的線性關(guān)系（r≥0.999 8），平均加樣回收率為97.7％～100.5％。而且，甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B對(duì)其質(zhì)量有顯著影響。另外，可將內(nèi)蒙古、新疆、甘肅產(chǎn)區(qū)的烏拉爾甘草與烏茲別克斯坦產(chǎn)區(qū)進(jìn)行區(qū)分，但不能明顯表征這3個(gè)中國(guó)產(chǎn)區(qū)的差異。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定準(zhǔn)確，可為甘草的鑒定和質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞:甘草；三萜皂苷；主成分分析；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.023

KEY W 0RDS: 1icorice；triterPenoid saPonins；PrinciPa1 comPonent ana1ysis（PCA）；HPLC

甘草為豆科蝶形花亞科多年生草本植物，全國(guó)均有分布，主產(chǎn)于亞洲及歐洲。我國(guó)地處甘草資源中心地帶，也是世界上甘草使用量及出口量最大的國(guó)家，以新疆、內(nèi)蒙古和甘肅為主產(chǎn)地。其中，作為法定的藥用甘草有烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖［1］。

作為多品種來(lái)源的中藥，甘草的質(zhì)量評(píng)價(jià)一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［2-7］，但總體而言，其成分分析主要集中在黃酮類成分的定性或定量檢測(cè)，對(duì)皂苷類成分的研究并不深入。有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草中除了甘草酸外，還含有一系列皂苷類活性成分［8-12］，它們?cè)诓煌贩N及產(chǎn)地的甘草中是否存在差異，對(duì)該植物的品質(zhì)是否有影響，都是值得關(guān)注的問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)以5個(gè)皂苷類成分（甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸、烏拉爾甘草皂苷B）為指標(biāo)，建立HPLC法同時(shí)測(cè)定甘草中這5個(gè)成分，并對(duì)產(chǎn)自內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地區(qū)的甘草進(jìn)行主成分分析，為進(jìn)一步完善其質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)，也將為該資源的綜合利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ag1ient 1100高效液相色譜儀，包括G1314A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、G1314A二元泵、Agi1ent 1100色譜工作站（美國(guó)Agi1ent公司）；JCS-1000電子天平（凱豐集團(tuán)有限公司）；BT125D分析天平（十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；KH-250B超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 甘草酸對(duì)照品（g1ycyrrhizin，純度≥98％，批號(hào)MUST-13083101，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院、北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；甘草皂苷M3（1icorice-saPonin M3）、22β-乙酰甘草酸（22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin）、甘草皂苷G2（1icoricesaPonin G2）、烏拉爾甘草皂苷B（ura1saPonin B）對(duì)照品（自制，純度均≥98％）；乙腈為色譜純（批號(hào)4B2935，美國(guó)Roe公司）；甲酸為分析純（批號(hào)12050210705，南京化學(xué)試劑有限公司）；甲醇為色譜純（批號(hào)20140616103，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司）。

甘草藥材為豆科植物烏拉爾甘草G.uralensis、光果甘草G.glabra和脹果甘草G.inflate的干燥根及根莖，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定，符合《中國(guó)藥典》2010年版項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。不同產(chǎn)地甘草的來(lái)源見(jiàn)表1。

表1　樣品來(lái)源Tab.1 0 rlglns of sam ples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hedera ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；乙腈（A）-0.2％甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～5 min，28％～30％A；5～50 min，30％～40％A）；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.甘草皂苷M32.22β-乙酰甘草酸 3.甘草皂苷G24.甘草酸 5.烏拉爾甘草皂苷B1.1icorice-saPonin M32.22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin 3.1icoricesaPonin G24.g1ycyrrhizin 5.ura1saPonin B圖1　對(duì)照品和樣品的HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成5種對(duì)照品溶液。取上述溶液適量，置于同一量瓶中，制得甘草混合對(duì)照品溶液。其中，甘草皂苷M30.110 7 mg/mL、22β-乙酰甘草酸0.140 4 mg/mL、甘草皂苷G20.115 3 mg/mL、甘草酸1.839 6 mg/mL、烏拉爾甘草皂苷B 0.378 0 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取甘草藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.50 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60％乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，靜置至室溫，密塞，再稱定質(zhì)量，60％乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 含有量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋法稀釋后配成系列對(duì)照品溶液，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各對(duì)照品回歸方程及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，5種成分在各自線性范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

表2　5個(gè)三萜皂苷類成分的線性關(guān)系Tab.2 Llnear relatlonshlps of flve trlterpenold saponlns

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各對(duì)照品峰面積。結(jié)果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的峰面積RSD分別為1.0％、0.96％、1.2％、0.63％和1.3％，表明儀器精密度較好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定。結(jié)果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的峰面積RSD分別為1.7％、1.9％、2.1％、1.0％和1.4％，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、16 h進(jìn)樣10 μL測(cè)定。結(jié)果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的峰面積RSD分別為1.4％、1.8％、1.5％、0.78％和0.96％，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的甘草藥材粉末（樣品1）0.25 g（甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的含有量分別為0.93、1.86、2.64、55.47、8.94 mg/g），共6份，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液適量（相當(dāng)于藥材中各對(duì)照品原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80％、100％、120％），每個(gè)質(zhì)量濃度取2份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

續(xù)表3　

2.4.6 樣品測(cè)定 取11批不同品種及產(chǎn)地的甘草藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算不同地區(qū)甘草藥材中各成分的含有量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　5個(gè)三萜皂苷類成分的含有量（mg/g）Tab.4 Contents of flve trlterpenold saponlns（mg/g）

2.5 主成分分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件，將11批甘草藥材中5種三萜皂苷類成分的峰面積與藥材取樣量之比（即單位質(zhì)量藥材峰面積）進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1者為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到3個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到91.86％。其中，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率最大，為41.00％，包含的信息最多，第二主成分為29.66％，第三主成分為21.20％。由圖2可知，樣品能被明顯分成兩類，分界較明顯，樣品1～4（光果和脹果甘草）集中分布在左側(cè)，而樣品6～10（烏拉爾甘草）集中分布在右下側(cè)，但樣品5和11離群較遠(yuǎn)，可能與三萜皂苷類成分的含有量有關(guān)。

圖2　主成分得分圖Flg.2 Score plot of prlnclpal components

因子負(fù)荷能反映各變量與主成分的相關(guān)性，其大小可表明各變量的影響程度。表5提供了5個(gè)色譜峰對(duì)于分類貢獻(xiàn)的信息，其中峰4、5在第一主成分中起決定性作用，顯著影響樣品的分類；峰2、3在第二主成分中有明顯的正相負(fù)荷；峰1對(duì)第三主成分影響較大。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 考察了甲醇-0.2％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水、甲醇/乙腈（2∶1）-0.2％甲酸水等不同比例的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.2％甲酸水系統(tǒng)分離度最好，各峰的保留時(shí)間適中。為保證各指標(biāo)性成分得到良好分離，還對(duì)Hedera ODS-2 （4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo Scientific ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同色譜柱進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Hedera ODS-2色譜柱得到的各指標(biāo)性成分峰形最好，分離效果最為理想。

表5　因子負(fù)荷矩陣Tab.5 Factor load lng matrlx

3.2 含有量測(cè)定分析與主成分分析 采用本實(shí)驗(yàn)建立的色譜方法，對(duì)11個(gè)不同來(lái)源的甘草藥材進(jìn)行了含有量測(cè)定。結(jié)果表明，同一品種不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同品種的5個(gè)指標(biāo)性成分之間含有量差異很大，這可能與當(dāng)?shù)貧夂?、地理位置等生態(tài)環(huán)境，或種苗等遺傳因素相關(guān)［13］。其中，甘草皂苷M3受產(chǎn)地的影響最大，產(chǎn)自烏茲別克斯坦的樣品3、11及甘肅的樣品9、10均不含有該成分。因此，推測(cè)烏茲別克斯坦和甘肅產(chǎn)區(qū)可能不具備產(chǎn)生甘草皂苷M3的有利條件。

然后，將數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同產(chǎn)地的甘草藥材具有一定的相似性和差異性。樣品1～4為光果甘草和脹果甘草，集中分布在圖2的左側(cè)，而樣品6～10均為烏拉爾甘草，集中分布在右下側(cè)，可推斷光果甘草與脹果甘草在兩個(gè)主成分上具有一定的相似性，而烏拉爾甘草與上述其他兩種甘草具有差異性。此外，樣品6～10產(chǎn)于我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古及甘肅，在圖2的分布較集中，而樣品11產(chǎn)自烏茲別克斯坦，離群較遠(yuǎn)，故可用于烏拉爾甘草的中國(guó)與烏茲別克斯坦道地產(chǎn)區(qū)的區(qū)分。由表4可知，5和11號(hào)產(chǎn)地樣品與其他產(chǎn)地差異較大，可能是土壤環(huán)境、遺傳因素對(duì)植物中三萜皂苷類成分的影響較大，使得5號(hào)樣品中該類成分的含有量普遍偏低，而11號(hào)樣品偏高，這與主成分分析結(jié)果一致。

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版，甘草以甘草酸為指標(biāo)性成分，并規(guī)定了含有量范圍。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，上述11個(gè)來(lái)源的甘草藥材中甘草酸含有量幾乎都明顯高于藥典規(guī)定（不得少于2％），說(shuō)明現(xiàn)行藥典在甘草酸含有量限定上存在偏低情況，未能真實(shí)反映出藥材本身質(zhì)量的優(yōu)劣差異，故建議下版藥典能對(duì)其含有量限定項(xiàng)進(jìn)行相應(yīng)修訂，使之更能客觀地反映藥材的質(zhì)量現(xiàn)狀。另外，不同品種及產(chǎn)地的甘草藥材中均含有22β-乙酰甘草酸、甘草酸、甘草皂苷G2，但三者含有量差別較大，結(jié)合因子負(fù)荷矩陣可知，甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的含有量對(duì)甘草質(zhì)量影響顯著，而且22β-乙酰甘草酸和甘草皂苷G2也可產(chǎn)生一定的影響，故可將22β-乙酰甘草酸和甘草皂苷G2作為質(zhì)量控制的另一指標(biāo)。

三萜皂苷為甘草藥材中的主要活性成分，其種類雖單一，但含有量差異較大。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)其含有量進(jìn)行測(cè)定，可為初步區(qū)分我國(guó)各道地產(chǎn)區(qū)及控制從烏茲別克斯坦等中亞地區(qū)進(jìn)口的甘草藥材質(zhì)量提供參考價(jià)值。該方法簡(jiǎn)便可靠，但由于三萜皂苷類成分對(duì)照品匱乏，藥材的來(lái)源不夠豐富，指標(biāo)性成分的選擇不夠完善，故未能全面考察甘草藥材中三萜皂苷類成分的含有量。若采用一測(cè)多評(píng)法，實(shí)現(xiàn)以甘草酸為對(duì)照的多個(gè)成分進(jìn)行同步測(cè)定，可為甘草中各有效成分含有量測(cè)定提供對(duì)比依據(jù)，為不同地區(qū)該植物的規(guī)范化種植、品種保護(hù)及質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

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Slmultaneous determ lnatlon and prlnclpal com ponent analysls of flve trlterpenold saponlns ln llcorlce

FANG Shi-qi1， QU Qi-yang1， ZHONG Huan-huan1， LICun-yu1，2， PENG Guo-Ping1，2，ZHENG Yun-feng1，2 *
（1.School of Pharmacy，Nanjing University of ChineseMedicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Provincial Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing 210023，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of 1icorice-saPonin M3，22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin，1icorice-saPonin G2，g1ycyrrhizin and ura1saPonin B in 1icorice from Inner Mongo-1ia，Xinjiang，Gansu（China）and Uzbekistan.METH0DS The ana1ysis of 1icorice 60％ ethano1ic extractwas Performed on a Hedera ODS-2 co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm）in a gradiente1ution manner，mobi1e Phasewas acetonitri1e-0.2％ formic acid aqueous so1ution，f1ow rate was 1.0 mL/min，detection wave1ength was set at 254 nm，and co1umn temPeraturewasmaintained at30℃.Then PrinciPa1comPonentana1ysis（PCA）was used for the c1assification of triterPenoid saPonins in e1even batches of 1icorice.RESULTS These five constituents showed good 1inear re1ationshiPs（r≥0.999 8），whose arerage recoverieswere 97.7％ -100.5％.In addition，g1ycyrrhizin and ura1saPonin B had significant inf1uences on the qua1ity of 1icorice.Moreover，G.uralensis from Inner Mongo-1ia，Xinjiang and Gansu were different from Uzbekistan，but no c1ear distinction was characterized among these three Chinese growing areas.C0NCLUSI0N Thismethod is simP1e，raPid，stab1e and accurate，which can be aPP1ied to the qua1ity contro1of 1icorice.

*通信作者:鄭云楓（1979—），男，博士，副研究員，從事中藥化學(xué)成分研究與開(kāi)發(fā)工作。Te1:（025）86798186；E-mai1: zyunfeng88@126.com

作者簡(jiǎn)介:方詩(shī)琦（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幊煞址蛛x與分析。Te1:（025）86798186，E-mai1: fangsq8866@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202881）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（ysxk-2013）；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心課題（ZDXM-2-8）

收稿日期:2015-08-07

中圖分類號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0336-06