L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的藥代動(dòng)力學(xué)和口服生物利用度

李 闊， 何忠梅*， 陳紅巖， 祝洪艷， 趙 巖， 郜玉鋼， 楊 鶴， 張連學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省人參工程技術(shù)創(chuàng)新中心，吉林長(zhǎng)春130118）

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L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的藥代動(dòng)力學(xué)和口服生物利用度

李 闊1，2， 何忠梅1，2*， 陳紅巖1， 祝洪艷1，2， 趙 巖1，2， 郜玉鋼1，2， 楊 鶴1，2， 張連學(xué)1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省人參工程技術(shù)創(chuàng)新中心，吉林長(zhǎng)春130118）

摘要:目的 研究新化合物L(fēng)-纈氨酸薯蕷皂苷元酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和口服生物利用度。方法 建立RPHPLC法檢測(cè)大鼠血漿中的L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯，考察經(jīng)灌胃和靜脈給予40 mg/kg該成分后血藥濃度的變化。采用DAS 2.0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和口服生物利用度。結(jié)果 灌胃組大鼠的Cmax為（9.8±0.5）μg/mL，Tmax為（32.9±5.7）min，T1/2為（60.1±10.2）min，AUC為（1.5±0.4）×103μg·min/mL；靜脈注射組的T1/2為（74.6±16.5）min，AUC為（1.2±0.3）×104μg·min/mL。結(jié)論 L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的口服生物利用度為12.5％，高于文獻(xiàn)報(bào)道4.3％。

關(guān)鍵詞:L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯；藥代動(dòng)力學(xué)；口服生物利用度；RP-HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.011

KEY W 0RDS: L-va1ine diosgenin ester；Pharmacokinetics；ora1bioavai1abi1ity；RP-HPLC

薯蕷皂苷元（diosgenin）是一種重要的甾體皂苷元，廣泛存在于薯蕷屬、閉鞘姜屬和葫蘆巴屬等植物中［1］，具有抗腫瘤［2-3］、降血糖［4］、降血脂［5］、抗炎［6-7］等藥理活性，特別是它的抗腫瘤作用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。薯蕷皂苷元抗腫瘤機(jī)制研究已見于很多報(bào)道，最近發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元是通過抑制人源蛋白Vav2活性來抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性［8］。然而，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，薯蕷皂苷元由于具有強(qiáng)的疏水性，口服給藥在消化液中的溶出度非常差，生物利用度極低［9］，這就在很大程度上限制了薯蕷皂苷元制劑在臨床上的應(yīng)用。因此，如何提高薯蕷皂苷元口服給藥的溶出度和生物利用度成為其開發(fā)和利用的關(guān)鍵所在。

氨基酸作為一種兩親性化合物被引入到難溶性藥物分子結(jié)構(gòu)中，一方面可改善藥物在水中的溶解度；另一方面，氨基酸類化合物（寡肽）在小腸的吸收過程中可以充當(dāng)載體（PeP T1）［10-11］，增強(qiáng)藥物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)小腸對(duì)藥物的吸收，改善難溶性藥物的口服生物利用度?；诖讼敕ǎ菊n題組前期以含有羥基基團(tuán)的薯蕷皂苷元為前藥，與L-纈氨酸進(jìn)行化學(xué)合成反應(yīng)，首次成功制備了L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯［12］（圖1）。同時(shí)，對(duì)溶解性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元易溶于三氯甲烷、二氯甲烷等親脂性溶劑中，微溶于乙醚、四氫呋喃等有機(jī)溶劑中，在乙醇、甲醇中幾乎不能溶解；L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯易溶于三氯甲烷、二氯甲烷中，在乙醚、四氫呋喃中能夠溶解，而在無水乙醇及甲醇中略溶或不溶。所以，L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的溶解性與薯蕷皂苷元比較，有所增加。

圖1　L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯分子結(jié)構(gòu)Flg.1 M olecular structure of L-vallne dlosgenln ester

本實(shí)驗(yàn)以L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯為原料，測(cè)定兩種給藥途徑（灌胃、靜脈）在大鼠血漿中的濃度，以此研究其藥代動(dòng)力學(xué)過程，計(jì)算口服生物利用度，確定氨基酸酯類衍生化是否能提高薯蕷皂苷元的口服生物利用度。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試藥及動(dòng)物

1.1 儀器 Agi1ent 1260高效液相色譜儀，包括G1311C高壓輸液泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314B紫外檢測(cè)器、M8301AA色譜工作站；5810R臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；BSA224S分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；HHS-21-6水浴恒溫振蕩器（常州諾基儀器有限公司）。

1.2 試藥 L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯（實(shí)驗(yàn)室自制，純度98％）；丹參酮ⅡA（內(nèi)標(biāo)，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.3 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠12只，體質(zhì)量（200±20）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（吉）-2011-0004。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 ZORBAX Ec1iPse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；XDB-C18保護(hù)柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（95∶5）；柱溫35℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2.2 藥液的配置 灌胃給藥: 5％DMSO-植物油溶解，配制成40 mg/kg混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。靜脈給藥: 10％ DMSO-生理鹽水溶解，配制成40 mg/kg澄清液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 給藥方案 將12只Wistar大鼠隨機(jī)分成2組，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，給藥前禁食不禁水12 h，給藥后2 h內(nèi)禁食禁水。按40 mg/kg等劑量灌胃和尾靜脈注射，給藥后于5、10、20、30、40、60、90、150、210、270、390、570 min從尾靜脈取血（給藥后2 h內(nèi)，每0.5 h往腹腔注射補(bǔ)充與取血量等同的生理鹽水，2 h后允許自由飲水），分離血漿，密封后置于-80℃冰箱保存，備用。

2.4 溶液的配制 精密稱取L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯對(duì)照品5 mg，置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至5 mL，得到1 mg/mL對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱中備用。臨用前，配制所需濃度的溶液。

2.5 血漿樣品的處理 血樣離心后取0.5 mL，加入2.0 μg/mL丹參酮ⅡA（內(nèi)標(biāo)）甲醇溶液0.5 mL，旋渦振蕩30 s，靜置10 min后3 500 r/min離心10 min，除去蛋白，取上清液，加入含25 mg氯化鈉的4 mL離心管中，3 500 r/min漩渦混合10 min，再離心10 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣分析。

2.6 數(shù)據(jù)分析 采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。根據(jù)F/％ =［（AUC口服給藥·D靜脈注射）/ （AUC靜脈注射·D口服給藥）］×100％的公式，計(jì)算其口服生物利用度。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 取空白血漿、L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯血漿對(duì)照品以及大鼠用藥后血漿樣品適量，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見圖2。由圖可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯與內(nèi)標(biāo)能完全分離，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾兩者的檢測(cè)，前者保留時(shí)間為3.16 min，而后者為5.45 min。

1.L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯 2.內(nèi)標(biāo)樣品1.L-va1ine diosgenin ester 2.interna1standards圖2　HPLC色譜圖Flg.2 Im ages for HPLC chrom atogram s

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密量取L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯0.5 mg，加入甲醇溶液，配置成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。取血漿0.5 mL，分別加入到100 μL各質(zhì)量濃度系列的溶液中，配置成0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、200.00 μg/mL血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定相應(yīng)峰面積。以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），血漿中樣品物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.002X+0.203 （r2=0.999），表明血漿樣品中檢測(cè)質(zhì)量濃度的定量下限為0.5 μg/mL。

3.3 精密度試驗(yàn) 取中質(zhì)量濃度（10.00 μg/mL）L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯血漿，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，計(jì)算樣品RSD為（1.51±0.17）％（n =6）。

再取L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯貯備液及大鼠空白血漿，按倍數(shù)稀釋法制成低、中、高3種不同質(zhì)量濃度（0.50、10.00、50.00 μg/mL）的樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理。取上清液分析，測(cè)定血漿中L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的含有量，考察其日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度下樣品的日內(nèi)精密度分別為低（7.56±0.63）％、中（2.33±0.35）％、高（1.51±0.12）％（n =6）；日間精密度分別為低（8.42±0.69）％、中（6.17±0.57）％、高（3.31±0.39）％（n =5）。

3.4 回收率試驗(yàn)

3.4.1 相對(duì)回收率試驗(yàn) 配制低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.50、10.00、50.00 μg/mL）的L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯血漿對(duì)照品溶液，每種質(zhì)量濃度6份，再按“2.5”項(xiàng)下方法處理后檢測(cè)。結(jié)果，3種質(zhì)量濃度溶液的相對(duì)回收率分別為（98.28± 4.32）％、（102.72±3.87）％、（99.37±1.01）％ （n =5）。

3.4.2 絕對(duì)回收率試驗(yàn) 配制低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.50、10.00、50.00 μg/mL）的L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯對(duì)照品溶液，每種質(zhì)量濃度6份，直接進(jìn)樣，得對(duì)照品色譜峰面積（A1）。再取對(duì)照品溶液適量，用空白血漿配制成質(zhì)量濃度為5.00、100.00、500.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿系列溶液，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后檢測(cè)，得到提取后色譜峰面積（A2）。以（A2/A1）×100％計(jì)算，測(cè)得3種質(zhì)量濃度血漿樣品的絕對(duì)回收率分別為（76.74± 3.7）％、（77.32±0.79）％、（78.28±0.41）％ （n =5）。

3.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和絕對(duì)生物利用度 灌胃和靜注給藥后，大鼠血漿中L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后計(jì)算分析，結(jié)果見表1。測(cè)得L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的口服生物利用度為12.5％。

圖3　大鼠血漿中L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的血藥濃度-時(shí)間曲線Flg.3 Plasma concentratlon-tlme curves of L-vallne dlosgenln ester ln rat p lasm a

表1　兩組L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（x± s，n=6）Tab.1 Pharmacok lnetlc parameters of L-vallne d losgenln ester ln two groups（±s，n=6）

表1　兩組L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（x± s，n=6）Tab.1 Pharmacok lnetlc parameters of L-vallne d losgenln ester ln two groups（±s，n=6）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)　　單位　　灌胃給藥　　靜脈注射給藥Cmax　μg·mL-1　9.8±0.5—Tmax　min　32.9±5.7　　—T1/2　min　60.1±10.2　 74.6±16.5 V L·kg-1　4.6±0.5　0.6±0.1 MRT0 -∞　min　 133.4±21.2　 18.7±7.5 AUC　 μg·min·mL-1?。?.5±0.4）×103（1.2±0.3）×104CL　 mL·（min·kg）-1162.5±12.5　 14.1±3.6

4 討論

L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯是在薯蕷皂苷元結(jié)構(gòu)改造中發(fā)現(xiàn)的新活性化合物，在藥效和制劑研制中，需進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠體內(nèi)L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯血藥濃度的RPHPLC測(cè)定方法，并對(duì)不同給藥途徑下藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可為L(zhǎng)-纈氨酸薯蕷皂苷元酯在不同給藥途徑下的藥效學(xué)研究提供給藥劑量的參考。口服L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯的生物利用度達(dá)12.5％，而文獻(xiàn)［13］報(bào)道薯蕷皂苷元大鼠口服的生物利用度為4.3％，可見有較大提高。同時(shí)，所建立的L-纈氨酸薯蕷皂苷元酯血藥濃度測(cè)定方法簡(jiǎn)單、靈敏、專一，能夠滿足血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)研究的需要。

中藥的有效成分多為難溶性成分，分子結(jié)構(gòu)中大多含有羥基，生物溶解度小，難以被機(jī)體吸收，體內(nèi)消除速度較快，口服制劑生物利用度低，嚴(yán)重影響了藥物的臨床療效，制約了植物藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)可為提高其他植物藥中含有羥基有效成分口服生物利用度提高藥理作用提供方法借鑒。

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Pharmacoklnetlcs and oral bloavallablllty of L-vallne d losgenln ester

LIKuo1，2， HE Zhong-mei1，2 *， CHEN Hong-yan1， ZHU Hong-yan1，2， ZHAO Yan1，2， GAO Yugang1，2， YANG He1，2， ZHANG Lian-xue1，2
（1.College of Traditional Chinese Materia Medica，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Innovation Center for Engineering & Technology of Jilin Ginseng，Changchun 130118，China）

ABSTRACT:AIM To study the in vivo Pharmacokinetics and ora1bioavai1abi1ity of a new comPound，L-va1ine diosgenin ester，in rats.METH0DS An RP-HPLCmethod was estab1ished to determine L-va1ine diosgenin ester in rat P1asma，and the P1asma concentration change after intragastric or intravenous administration of 40 mg/kg L-va1ine diosgenin ester.The DAS 2.0 software was aPP1ied to ca1cu1ating the Pharmacokinetic Parameters for the assessment of ora1bioavai1abi1ity.RESULTS In the intragastric grouP，Cmax，Tmax，T1/2and AUC were（9.8± 0.5）μg/mL，（32.9±5.7）min，（60.1±10.2）min and（1.5±0.4）×103μg·min/mL，resPective1y. Whi1e in the intravenous grouP，T1/2and AUCwere（74.6±16.5）min and（1.2±0.3）×104μg·min/mL，resPective1y.C0NCLUSI0N The ora1bioavai1abi1ity of L-va1ine diosgenin ester is 12.5％，which is higher than that of diosgenin（4.3％）.

*通信作者:何忠梅，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事植物藥有效成分及其作用機(jī)理研究工作。Te1: 13331662387，E-mai1: 435398002@qq.com

作者簡(jiǎn)介:李 闊（1990—），男，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮滤幍难芯颗c開發(fā)。Te1: 15043082698，E-mai1: 383175370@qq.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100250）；吉林省教育廳十二五科技項(xiàng)目（2014第42號(hào)）

收稿日期:2015-05-28

中圖分類號(hào):R969.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0284-05