系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者樹(shù)突狀細(xì)胞CD200R下調(diào)之意義

陳　洋，李　揚(yáng)，張　烜

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 風(fēng)濕免疫疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制涉及遺傳和環(huán)境等多方面因素。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)包括髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cell，mDC)和漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)，在外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中數(shù)量較少，但作為主要的抗原提呈細(xì)胞在SLE免疫耐受失衡中起到重要的作用[1-2]。CD200/CD200R是重要的免疫調(diào)節(jié)通路，受體相對(duì)局限分布于髓系來(lái)源的細(xì)胞如DC，其中最主要的是CD200R1，發(fā)揮著免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用；但其在人類(lèi)DC的功能調(diào)節(jié)及SLE發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。本研究著眼于CD200R分布的主要細(xì)胞群，選擇在免疫啟動(dòng)和調(diào)節(jié)方面具有重要作用的DC為研究對(duì)象，分析SLE患者DC表面CD200R表達(dá)，并通過(guò)建立體外PBMC來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(monocytes derived dendritic cells，MoDC)培養(yǎng)模型，研究脂多糖(lipopolysaceharide,LPS)對(duì)SLE患者M(jìn)oDC活化及CD200R表達(dá)的影響，初步探討該通路在疾病發(fā)生發(fā)展中的意義。

資料與方法

研究對(duì)象

收集北京協(xié)和醫(yī)院確診的SLE患者共22例，平均年齡(26.0±8.5)歲；健康對(duì)照(healthy control,HC)共22例，平均年齡(28.2±4.9)歲。所有患者均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，研究開(kāi)始前均獲得知情同意。

主要材料

流式熒光抗體CD11c-FITC、CD123-PE-Cy7、CD200R-PE、HLA-DR-PE、CD83-PerCP/CY5.5、CD86-APC購(gòu)自eBioscience和Biolegend公司，IL- 6及IL-10 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒均購(gòu)自eBioscience公司，CD14 Micro Beads購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司，重組人IL- 4及GM-CSF購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Cell TraceTMCFSE cell proliferation kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

方法

清晨空腹采集靜脈血20 ml，按照Ficoll密度梯度離心法分離PBMC并計(jì)數(shù)。第一部分：PBMC中加入熒光標(biāo)記抗體CD11c-FITC、CD123-PE-Cy7、CD200R-PE，并設(shè)同型對(duì)照，圈出非淋巴細(xì)胞門(mén)，以CD11c+CD123dim代表mDC，CD11c-CD123bright代表pDC。Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)。第二部分：免疫磁珠分選CD14+單核細(xì)胞，于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，給予GM-CSF(100 ng/ml)和IL- 4(100 ng/ml)誘導(dǎo)。分為培養(yǎng)基組(M)、LPS(1 μg/ml)組，培養(yǎng)7 d后收獲各組MoDC及培養(yǎng)上清液。

各組MoDC中分別標(biāo)記CD11c-FITC、CD200R-PE、HLA-DR-PE、CD83-PerCP/CY5.5、CD86-APC,進(jìn)行BD FACS AriaⅡTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)；ELISA法檢測(cè)各組MoDC培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素- 6(interleukin- 6,IL- 6)和IL-10的濃度；MoDC與異體健康對(duì)照混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocytes reaction,MLR)，通過(guò)染色CFSE檢測(cè)CD4+淋巴細(xì)胞增殖情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

SLE患者外周血DC表面CD200R的表達(dá)

SLE患者mDC及pDC表面CD200R表達(dá)均較健康對(duì)照顯著降低[mDC：(20.51±2.87)%vs.(27.95±2.00)%，P=0.046；pDC：(47.97±5.50)%vs.(65.14±4.72)%，P=0.027]。SLE患者mDC表面CD200R的表達(dá)與紅細(xì)胞沉降率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.552，P=0.041)，但與C3、C4、抗dsDNA抗體滴度及SLEDAI評(píng)分無(wú)相關(guān)性(圖1、2)。

SLE患者與健康對(duì)照組LPS誘導(dǎo)MoDC活化情況比較

流式細(xì)胞術(shù)分析MoDC表面活化標(biāo)志HLA-DR、CD83、CD86的改變：經(jīng)LPS活化后SLE(n=8)及健康對(duì)照組(n=6)MoDC表面標(biāo)志表達(dá)均顯著上調(diào)。SLE與健康對(duì)照組間比較差異無(wú)顯著性意義(圖3、4)。

ELISA檢測(cè)各組MoDC培養(yǎng)上清中IL- 6和IL-10的濃度變化：LPS刺激活化后健康對(duì)照(n=7)及SLE(n=7)組IL- 6、IL-10水平均顯著升高，兩者比較差異無(wú)顯著意義(圖5、6)。

單向MLR檢測(cè)各組MoDC刺激CD4+淋巴細(xì)胞增殖的能力：健康對(duì)照組和SLE組LPS活化的MoDC使CD4+淋巴細(xì)胞增殖比例顯著增加(表1)。

LPS誘導(dǎo)MoDC活化成熟后其表面CD200R表達(dá)

SLE及健康對(duì)照組，經(jīng)LPS活化后MoDC表面CD200R均顯著下調(diào)(HC：P<0.001；SLE：P=0.023)。無(wú)論是否經(jīng)LPS活化SLE組MoDC表面CD200R表達(dá)均較對(duì)照組下降，但差異無(wú)顯著意義(表2，圖3,4)。

圖2SLE患者mDC表面CD200R表達(dá)與紅細(xì)胞沉降率的相關(guān)性

Fig2Correlation between CD200R expression on mDC of SLE and ESR

SLE:系統(tǒng)性紅斑狼瘡；mCD:髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞;ESR:紅細(xì)胞沉降率

圖3健康對(duì)照M組、LPS組 MoDC表面活化標(biāo)志表達(dá)

Fig3HLA-DR,CD83 and CD86 expression change on MoDC after LPS activation in healthy control

LPS:脂多糖；MoDCl:單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞

圖4SLE患者M(jìn)組、LPS組 MoDC表面活化標(biāo)志表達(dá)的變化

Fig4HLA-DR,CD83 and CD86 expression change on MoDC after LPS activation in SLE

LPS:脂多糖；MoDCl:單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞;SLE:系統(tǒng)性紅斑狼瘡

圖5健康對(duì)照MoDC培養(yǎng)上清中各組IL- 6及IL-10分泌情況

Fig5Secretion of IL- 6 and IL-10 in culture supernatant MoDC of different groups in healthy control

MoDCl:單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞;IL-6:白細(xì)胞介素6;IL-10:白細(xì)胞介素10

圖6SLE患者M(jìn)oDC培養(yǎng)上清中各組IL- 6及IL-10分泌情況

Fig6Secretion of IL- 6 and IL-10 in culture supernatant MoDC of different groups in SLE

MoDCl:單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞;IL-6:白細(xì)胞介素6;IL-10:白細(xì)胞介素10;SLE:系統(tǒng)性紅斑狼瘡

分組HC(n=5)SLE(n=6)M(未活化MoDC)9.7±1.78.4±2.1*LPS(活化MoDC)14.4±2.310.7±1.9**P值0.0110.031

HC:健康對(duì)照；SLE:系統(tǒng)性紅斑狼瘡;LPS:脂多糖;MoDC:單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞;*HC與SLE相比，M組MoDC使CD4+細(xì)胞增殖比例無(wú)顯著性差異(P=0.638)；**HC與SLE相比，LPS組MoDC使CD4+細(xì)胞增殖比例無(wú)顯著性差異(P=0.239)

分組CD200R+CD11c+∕CD11c+HC(n=9)SLE(n=7)M(未活化MoDC)62.09±5.1852.33±8.18*LPS(活化MoDC)53.54±4.7445.10±7.53**P值<0.0010.023

HC:健康對(duì)照；SLE:系統(tǒng)性紅斑狼瘡;LPS:脂多糖;MoDC:單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞;*SLE與HC相比，M組MoDC表面CD200R表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)顯著意義(P=0.311)；**SLE與HC相比，LPS組MoDC表面CD200R表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)顯著意義(P=0.339)

討　　論

CD200是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，表達(dá)于多種細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、DC、神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞等[3-5]，其胞內(nèi)段短，缺乏信號(hào)序列，需要通過(guò)受體發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)的CD200的受體包括CD200R1～5[6-7]，其中最主要的是CD200R1，親和力最高，表達(dá)相對(duì)局限于髓系來(lái)源的細(xì)胞，如DC、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，胞內(nèi)帶有酪氨酸殘基被磷酸化后向下游傳導(dǎo)負(fù)向免疫調(diào)節(jié)信號(hào)[8-10]。SLE患者該通路存在異常[11]，本研究分析SLE患者PBMC中DC表面CD200R表達(dá)及LPS刺激MoDC活化后其表面CD200R改變。

結(jié)果顯示，SLE患者mDC及pDC表面CD200R表達(dá)均顯著低于健康對(duì)照。CD200/CD200R調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在過(guò)敏、自身免疫性疾病、移植排斥等免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。關(guān)于小鼠肥大細(xì)胞的研究顯示，CD200R被募集交聯(lián)后其胞內(nèi)的NPXY基序介導(dǎo)迅速發(fā)生酪氨酸磷酸化，募集Dok1和Dok2蛋白結(jié)合于RasGAP和SHIP，進(jìn)而抑制下游ERK、JNK和p38MAPK的活化，傳導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)信號(hào)[12-13]，這一通路已知的功能包括抑制肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞脫顆粒[14]、負(fù)向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能[9]、誘導(dǎo)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)抗炎介質(zhì)IL-10和TGF-β的產(chǎn)生[5]。敲除CD200的小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身反應(yīng)性腦脊髓炎和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎易感性增強(qiáng)[9，15]，阻斷CD200可使小鼠出現(xiàn)早發(fā)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎[16]。該通路還可影響細(xì)胞因子平衡，減少Ⅰ型細(xì)胞因子而促進(jìn)Ⅱ型細(xì)胞因子合成，參與移植耐受機(jī)制[17]。故SLE患者外周血DC表面CD200R表達(dá)下降可能導(dǎo)致自身免疫耐受降低，在其致病機(jī)制中具有一定的意義。且mDC表面CD200R表達(dá)陽(yáng)性率與ESR呈負(fù)相關(guān)，提示其與疾病炎癥反應(yīng)水平關(guān)系密切。

mDC攝取、加工、提呈抗原，聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫，啟動(dòng)并調(diào)整免疫應(yīng)答極性[18-19]。該過(guò)程主要涉及3種信號(hào)傳遞：與MHC分子結(jié)合的抗原多肽、共刺激分子CD80/CD86和DC分泌的細(xì)胞因子[20]。由于該DC在外周血含量較少，直至20世紀(jì)90年代出現(xiàn)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的方法后，才建立對(duì)其進(jìn)一步深入研究的平臺(tái)[21-23]。本實(shí)驗(yàn)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)MoDC，然后利用LPS刺激其活化[24-25]，研究該過(guò)程中CD200R表達(dá)及上述信號(hào)分子的改變。結(jié)果表明：LPS刺激后健康對(duì)照和SLE患者M(jìn)oDC均顯著活化，且表面CD200R均顯著下調(diào)，兩者之間差異無(wú)顯著性。此前亦有研究表明鼠小膠質(zhì)細(xì)胞在促炎介質(zhì)(如LPS)作用下，通過(guò)C/EBPβ介導(dǎo)，可導(dǎo)致CD200R1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)[26]。本研究培養(yǎng)體系不同于體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及DC起源于共同的髓系祖細(xì)胞即巨噬-DC祖細(xì)胞，炎癥狀態(tài)下可以分化成炎癥性DC或巨噬細(xì)胞，發(fā)揮抗原處理和提呈功能，然而在穩(wěn)態(tài)下雖然可能發(fā)生上述轉(zhuǎn)化，但效率較低[19，27-29]。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的MoDC模擬了炎癥性DC的情況，加入的刺激活化物是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分LPS，這就進(jìn)一步模擬了機(jī)體的炎癥感染狀態(tài)。在這種情況下，免疫系統(tǒng)功能從免疫耐受向免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化，即促進(jìn)炎癥反應(yīng)清除感染源。LPS作用后具有免疫負(fù)調(diào)功能的CD200R顯著下調(diào)，提示下調(diào)免疫耐受、促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)，與此正好相符。此前也有研究顯示CD200R激動(dòng)劑不能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化，提示在感染狀態(tài)下，免疫平衡將被重新調(diào)整[30]。

綜上，推測(cè)SLE患者多種免疫耐受機(jī)制異常，存在針對(duì)自身抗原的免疫炎癥反應(yīng)，具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的CD200/CD200R在炎癥狀態(tài)下下調(diào)受體，可能導(dǎo)致其自身免疫耐受進(jìn)一步下降，形成惡性循環(huán)，參與SLE發(fā)病過(guò)程。亦有研究表明多種病原微生物通過(guò)利用CD200/CD200R1通路，上調(diào)CD200和(或)CD200R1表達(dá)，抑制機(jī)體免疫防御反應(yīng)，誘導(dǎo)病原免疫耐受[10]。故需進(jìn)一步深入探索該通路可能的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在自身免疫性疾病中的作用，以便為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)[31]。

(本文圖1見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ)

[1]Mackern-Oberti JP，Llanos C，Riedel CA，et al.Contribution of dendritic cells to the autoimmune pathology of systemic lupus erythematosus[J].Immunology，2015，146：497-507.

[2]Son M，Kim SJ，Diamond B.SLE-associated risk factors affect DC function[J].Immunol Rev，2016，269：100-117.

[3]Webb M，Barclay AN.Localisation of the MRC OX-2 glycoprotein on the surfaces of neurones[J].J Neurochem，1984，43：1061-1067.

[4]Barclay AN.Different reticular elements in rat lymphoid tissue identified by localization of Ia，Thy-1 and MRC OX 2 antigens[J].Immunology，1981，44：727-736.

[5]Holmannova D，Kolackova M，Kondelkova K，et al.CD200CD200R paired potent inhibitory molecules regulating immune and inflammatory responses；Part Ⅰ：CD200CD200R structure，activation，and function[J].Acta Medica (Hradec Kralove)，2012，55：12-17.

[6]Hatherley D，Cherwinski HM，Moshref M，et al.Recombinant CD200 protein does not bind activating proteins closely related to CD200 receptor[J].J Immunol，2005，175：2469-2474.

[7]Gorczynski R，Khatri I，Lee L，et al.An interaction between CD200 and monoclonal antibody agonists to CD200R2 in development of dendritic cells that preferentially induce populations of CD4+CD25+T regulatory cells[J].J Immunol，2008，180：5946-5955.

[8]Wright GJ，Jones M，Puklavec MJ，et al.The unusual distribution of the neuronallymphoid cell surface CD200 (OX2) glycoprotein is conserved in humans[J].Immunology，2001，102：173-179.

[9]Hoek RM，Ruuls SR，Murphy CA，et al.Down-regulation of the macrophage lineage through interaction with OX2 (CD200)[J].Science，2000，290：1768-1771.

[10] Vaine CA，Soberman RJ.The CD200-CD200R1 inhibitory signaling pathway：immune regulation and host-pathogen interactions[J].Adv Immunol，2014，121：191-211.

[11] Li Y，Zhao LD，Tong LS，et al.Aberrant CD200CD200R1 expression and function in systemic lupus erythematosus contributes to abnormal T-cell responsiveness and dendritic cell activity[J].Arthritis Res Ther，2012，14：R123.

[12] Mihrshahi R，Barclay AN，Brown MH.Essential roles for Dok2 and RasGAP in CD200 receptor-mediated regulation of human myeloid cells[J].J Immunol，2009，183：4879- 4886.

[13] Zhang S，Cherwinski H，Sedgwick JD，et al.Molecular mechanisms of CD200 inhibition of mast cell activation[J].J Immunol，2004，173：6786- 6793.

[14] Cherwinski HM，Murphy CA，Joyce BL，et al.The CD200 receptor is a novel and potent regulator of murine and human mast cell function[J].J Immunol，2005，174：1348-1356.

[15] Gorczynski RM，Chen Z，Yu K，et al.CD200 immunoadhesin suppresses collagen-induced arthritis in mice[J].Clin Immunol，2001，101：328-334.

[16] Banerjee D，Dick AD.Blocking CD200-CD200 receptor axis augments NOS-2 expression and aggravates experimental autoimmune uveoretinitis in Lewis rats[J].Ocul Immunol Inflamm，2004，12：115-125.

[17] Gorczynski RM，Cattral MS，Chen Z，et al.An immunoadhesin incorporating the molecule OX-2 is a potent immunosuppressant that prolongs allo- and xenograft survival[J].J Immunol，1999，163：1654-1660.

[18] Bell D，Young JW，Banchereau J.Dendritic cells[J].Adv Immunol，1999，72：255-324.

[19] Lopez-Bravo M，Ardavin C.Invivoinduction of immune responses to pathogens by conventional dendritic cells[J].Immunity，2008，29：343-351.

[20] Sabatte J，Maggini J，Nahmod K，et al.Interplay of pathogens，cytokines and other stress signals in the regulation of dendritic cell function[J].Cytokine Growth Factor Rev，2007，18：5-17.

[21] Sallusto F，Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocytemacrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha[J].J Exp Med，1994，179：1109-1118.

[22] Bender A，Sapp M，Schuler G，et al.Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood[J].J Immunol Methods，1996，196：121-135.

[23] Romani N，Reider D，Heuer M，et al.Generation of mature dendritic cells from human blood.An improved method with special regard to clinical applicability[J].J Immunol Methods，1996，196：137-151.

[24] Han TH，Jin P，Ren J，et al.Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma[J].J Immunother，2009，32：399- 407.

[25] Langenkamp A，Messi M，Lanzavecchia A，et al.Kinetics of dendritic cell activation：impact on priming of TH1，TH2 and nonpolarized T cells[J].Nat Immunol，2000，1：311-316.

[26] Dentesano G，Straccia M，Ejarque-Ortiz A，et al.Inhibition of CD200R1 expression by CEBP beta in reactive microglial cells[J].J Neuroinflammat，2012，9：165.

[27] Shortman K，Naik SH.Steady-state and inflammatory dendritic-cell development[J].Nat Rev Immunol，2007，7：19-30.

[28] Liu K，Nussenzweig MC.Origin and development of dendritic cells[J].Immunol Rev，2010，234：45-54.

[29] Geissmann F，Manz MG，Jung S，et al.Development of monocytes，macrophages，and dendritic cells[J].Science，2010，327：656- 661.

[30] Jenmalm MC，Cherwinski H，Bowman EP，et al.Regulation of myeloid cell function through the CD200 receptor[J].J Immunol，2006，176：191-199.

[31] Holmannova D，Kolackova M，Kondelkova K，et al.CD200CD200R paired potent inhibitory molecules regulating immune and inflammatory responses；Part Ⅱ：CD200CD200R potential clinical applications[J].Acta Medica (Hradec Kralove)，2012，55：59- 65.