一株芽孢桿菌溶磷動(dòng)力學(xué)研究

劉　冬，陶　濤，李　萍，高智謀，畢璋友，姜曉斌，葉　明

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，安徽 合肥230036；

3.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

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一株芽孢桿菌溶磷動(dòng)力學(xué)研究

劉冬1,2，陶濤3，李萍1，高智謀2，畢璋友1，姜曉斌1，葉明3

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，安徽 合肥230036；

3.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

摘要：將1株具有溶磷能力的芽孢桿菌P8接種于以磷酸鈣為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中，對(duì)其降解磷酸鈣效果及動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該菌株具有穩(wěn)定的溶磷活力，芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動(dòng)力學(xué)方程遵循零級(jí)反應(yīng)。提高培養(yǎng)基中葡萄糖或磷酸鈣的初始濃度，均能提高芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的速率。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；溶磷；動(dòng)力學(xué)

磷是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)元素，磷營(yíng)養(yǎng)不足會(huì)導(dǎo)致作物減少產(chǎn)量[1]。目前，在生產(chǎn)中多施用高水溶性磷肥，然而磷肥施入土壤后易形成難溶性的磷酸鹽并迅速被土壤礦物吸附固定，而且大量長(zhǎng)期使用化肥，還會(huì)造成諸如土壤板塊等環(huán)境問題[2]。因此，在這種情況下迫切需要尋找一種更環(huán)保、更有效的方法解決由磷酸鹽導(dǎo)致的土壤板塊問題。

解磷微生物能將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化可溶性磷。土壤中難溶性磷可分為兩類，一類是磷酸鹽或結(jié)構(gòu)復(fù)雜的磷灰石等無機(jī)磷酸鹽，另一類是核酸、磷脂和植素等含磷有機(jī)物。對(duì)于前者，解磷微生物主要通過代謝活動(dòng)產(chǎn)生有機(jī)酸促使磷酸鹽溶解[3]。對(duì)于后者，解磷微生物主要通過分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶將其分解[4]。芽孢桿菌屬中某些細(xì)菌具有較強(qiáng)的解磷能力[5]，本研究以一株具有較強(qiáng)解磷能力的芽孢桿菌P8為研究對(duì)象，對(duì)其降解磷酸鈣動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行研究。

1材料與儀器

1.1材料

供試菌株為芽孢桿菌P8(Bacillus.sp P8)，由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏。培養(yǎng)基a：Ca3(PO4)2 4 g，葡萄糖 10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO41 mL(0.004 g·L-1)，F(xiàn)eSO4(Fe·EDTA)0.1 mL(0.002 g·L-1)，蒸餾水1000 mL，pH 7.0±0.2。培養(yǎng)基b：磷酸鈣濃度為10 g·L-1，其他條件同培養(yǎng)基a。培養(yǎng)基c：葡萄糖濃度為15 g·L-1，其他條件同培養(yǎng)基a。試驗(yàn)中如無特殊說明，均使用培養(yǎng)基a進(jìn)行相關(guān)研究。

1.2主要試驗(yàn)儀器

KQ118超聲波細(xì)胞破碎儀；SW-CJ-1F雙面無菌操作臺(tái)；TGL-16C飛鴿離心機(jī)；DZF-6021真空干燥箱；分析天平；SHY-2A水浴恒溫振蕩器等。

2方法

2.1 搖瓶培養(yǎng)

在盛有30 mL培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，接種1 mL菌體懸浮液(將在牛肉膏蛋白胨上培養(yǎng)24 h的細(xì)菌刮入無菌水中，制備成菌體懸浮液，菌數(shù)約為106cfu·mL-1)，同時(shí)做空白對(duì)照(在未接種培養(yǎng)基中加入1mL無菌水)，在30℃，140r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔24 h取出2瓶測(cè)定(含對(duì)照)，共測(cè)定9次。

2.2磷酸鈣濃度及降解率測(cè)定

將培養(yǎng)液(培養(yǎng)基初始磷酸鈣濃度記為c)搖勻，吸取1 mL渾濁液于1.5 mL離心管(已稱重，記為m1)，在10000 r·min-1條件下，離心15 min，并將沉淀離心洗滌(加1 mL蒸餾水)2次，放入30℃真空干燥箱，真空干燥24 h，稱重(記為m2)，則磷酸鈣降解率η為：

2.3葡萄糖、可溶性磷和生物量的測(cè)定

以DNS法[6]測(cè)定葡萄糖量，采用稀釋平板涂布法[7]測(cè)定生物量；磷含量用鉬銻抗比色法[8]測(cè)定，以上試驗(yàn)均做3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Orgin 7.5和SAS 9.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3結(jié)果與分析

3.1降解率與溶磷量的關(guān)系

由圖1可知，對(duì)溶磷量與降解率進(jìn)行線性擬合，得R=0.8633，p=0.0027<0.01，故溶磷量與降解率相關(guān)性顯著。而發(fā)酵液中的溶磷量雖與降解率均呈上升趨勢(shì)，但24 h、48 h時(shí)其溶磷量分別為-11.61 mg·L-1、-6.23 mg·L-1，這可能是因?yàn)榧?xì)菌在生長(zhǎng)繁殖時(shí)，不僅分解難溶性的磷化合物，而且還同化一部分分解出來的磷，當(dāng)后者作用大于前者時(shí)，使得有效磷含量低于對(duì)照值，反之則高于對(duì)照值，故菌株溶磷活力是穩(wěn)定的。

圖1　降解率與溶磷量的相關(guān)性分析

3.2降解率與生物量、葡萄糖的關(guān)系

由圖2可知，在菌體快速增殖期(發(fā)酵前4 d)，葡萄糖濃度迅速降低，磷酸鈣降解率迅速提高，在此階段，磷酸鈣降解率達(dá)到38.12%。

圖2　降解率與生物量、葡萄糖的關(guān)系

4 d后，由于葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期，菌體數(shù)目逐漸減少，但降解率依然呈上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榫w在快速增殖期，分泌出的大量有機(jī)酸[3,5]與鈣等離子結(jié)合，使磷酸鹽中的磷酸根釋放出來，快速降解磷酸鈣；而在衰退期，隨著菌體數(shù)目的減少，有機(jī)酸類物質(zhì)亦減少，降解磷酸鈣速度降低。

以降解率為橫坐標(biāo)，生物量、葡萄糖濃度分別為縱坐標(biāo)，進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn)，葡萄糖濃度與降解率關(guān)系顯著，其相關(guān)系數(shù)R值為-0.9161，P<0.01，而生物量與降解率的相關(guān)系數(shù)R為-0.1950，p=0.6151>0.05，生物量與降解率關(guān)系不顯著。故以下試驗(yàn)考察不同初始葡萄糖、磷酸鈣濃度條件下該菌株對(duì)磷酸鈣的降解作用。

3.3磷酸鈣降解動(dòng)力學(xué)

對(duì)于一般生化反應(yīng)速率可用式(1)表示[9]。

(1)

式(1)中，V為反應(yīng)速率，Vm為最大反應(yīng)速率，C為底物濃度，K為半飽和速率常數(shù)。當(dāng)C<

(2)

V=Vm(3)圖4芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動(dòng)力學(xué)曲線

降解過程為零級(jí)反應(yīng)，速率常數(shù)為k0=Vm根據(jù)式(2)和(3)分別求得底物與時(shí)間的關(guān)系式，lnC=a+k1t (一級(jí)反應(yīng)) ；C=b+k0t(零級(jí)反應(yīng)) 。

表1　芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動(dòng)力學(xué)方程

由圖4及表1可知，將芽孢桿菌在培養(yǎng)基a、b、c中培養(yǎng)，其對(duì)磷酸鈣的降解均能較好地用零級(jí)反應(yīng)形式表示，即磷酸鈣以恒定的反應(yīng)速率降解，式(3)表示的動(dòng)力學(xué)表達(dá)式應(yīng)與初始濃度無關(guān)。而試驗(yàn)中，其降解速率常數(shù)卻受初始磷酸鈣濃度、葡萄糖濃度的影響。當(dāng)磷酸鈣初始濃度由4 g·L-1升高到10 g·L-1時(shí)(初始葡萄糖濃度不變)，磷酸鈣的降解速率約提高一倍，可能是由于磷酸鈣釋放的有效磷量隨其濃度提高而增加，這在一定程度上減弱了磷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的限制，使細(xì)菌快速生長(zhǎng)并在代謝過程中迅速將難溶性磷轉(zhuǎn)化為有效磷，同時(shí)葡萄糖為芽孢桿菌P8生長(zhǎng)所必需的碳源和能量，故當(dāng)葡萄糖初始濃度由10 g·L-1升高到15 g·L-1時(shí)(初始磷酸鈣濃度不變)，磷酸鈣的降解速率亦有提高。

將D值定義為芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的降解率為90%時(shí)所需時(shí)間[10]，芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的效果采用類比分析方法并以D值大小來比較。

表2　芽孢桿菌P8降解磷酸鈣D值

注：X和Sx分別表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，a表示在p<0.01時(shí)各處理間差異顯著。

由表2可知，在相同培養(yǎng)條件下，提高葡萄糖或磷酸鈣的初始濃度(限于試驗(yàn)濃度范圍)，均能提高芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的效率。

4結(jié)論

芽孢桿菌P8具有穩(wěn)定的溶磷活力，其降解率與生物量之間無顯著關(guān)系。在培養(yǎng)基a、b、c中，芽孢桿菌P8降解磷酸鈣動(dòng)力學(xué)方程遵循零級(jí)反應(yīng)。在相同培養(yǎng)條件下，提高葡萄糖或磷酸鈣的初始濃度(限于試驗(yàn)濃度范圍)，均能提高芽孢桿菌P8降解磷酸鈣的速率。

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(編輯：嚴(yán)佩峰)

The Study on Phosphate Solubilizing Kinetics of a Bacillus

LIU Dong1,2, TAO Tao3, LI Ping1, GAO Zhi-mou2,BI Zhang-you1, JIANG Xiao-bin1, YE Ming3

(1.Department of Landscape and Horticulture, Anqing Vocational&Technical College, Anqing 246003, China;2.School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；3.College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract：One strain of Bacillus sp.P8 with phosphate-solubilizing ability was inoculated in the liquid mediums using calcium phosphate as the sole phosphate source. The effect and kinetics of calcium phosphate degradation (CPD) by Bacillus sp.P8 was studied. Results showed that the phosphate-dissolving activity of Bacillus sp. P8 was stable. The CPD followed the zero-order model. When the initial calcium phosphate or glucose concentration increased, the CPD rate increased.

Keywords：Bacillus sp；phosphate-solubilizing；kinetics

中圖分類號(hào)：S154.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-8978(2016)01-0096-04

作者簡(jiǎn)介：劉冬(1982—)，男，安徽淮北人，講師，在讀博士，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物.

基金項(xiàng)目：安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A148，KJ2015A368)；安徽省重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(2015zdjy181)；安徽省教壇新秀(2015jtxx157)

收稿日期：2015-11-28