兩種方法測(cè)定茶葉中游離氨基酸含量的比較研究

陳　義，張秀清,李玉霞，郭紅萍

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)系，信陽(yáng)市茶產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000；

2. 光山縣凈居寺茶場(chǎng)，河南 信陽(yáng) 464000；3. 光山縣凈居寺名勝管理區(qū)，河南 信陽(yáng) 464000)

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農(nóng)業(yè)科學(xué)

兩種方法測(cè)定茶葉中游離氨基酸含量的比較研究

陳義1，張秀清2,李玉霞2，郭紅萍3

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)系，信陽(yáng)市茶產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000；

2. 光山縣凈居寺茶場(chǎng)，河南 信陽(yáng) 464000；3. 光山縣凈居寺名勝管理區(qū)，河南 信陽(yáng) 464000)

摘要：本研究從標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收、精密度等方面對(duì)GB/T8314-2002和GB/T8314-2013進(jìn)行比較。結(jié)果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相關(guān)系數(shù)要高、加標(biāo)回收更準(zhǔn)確，精密度兩者相當(dāng)，測(cè)得茶葉中氨基酸要低15%左右。

關(guān)鍵詞：茶葉游離氨基酸；分光光度法；茚三酮比色法；標(biāo)準(zhǔn)曲線

茶葉作為一種飲用產(chǎn)品，其滋味和香氣直接影響產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)品價(jià)格，茶葉中氨基酸是形成茶葉鮮爽滋味的重要物質(zhì)，同時(shí)也是參與香氣的形成重要物質(zhì)之一[1]，與茶葉品質(zhì)顯著正相關(guān)，所以其含量的測(cè)定準(zhǔn)確與否顯得尤為重要。

茶葉中氨基酸總量的測(cè)定國(guó)標(biāo)一直采用茚三酮比色法，方法的原理是：氨基酸在pH8.0的條件下與茚三酮反應(yīng)，形成紫色絡(luò)合物，利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)570nm測(cè)定其吸光度，氨基酸濃度與吸光度成正比[2-3]。該標(biāo)準(zhǔn)最早由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所牽頭起草制定GB/T8314-1987，先后修訂2次，即GB/T8314-2002、GB/T8314-2013，筆者主要針對(duì)GB/T8314-2002和GB/T8314-2013的差異從標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收、精密度等方面進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相關(guān)系數(shù)要高、加標(biāo)回收更準(zhǔn)確，精密度兩者相當(dāng)，測(cè)得茶葉中氨基酸要低15%左右。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋，F(xiàn)A2104型分析天平(感量0.0001g)，微型植物試樣磨碎機(jī)，GF-2型鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱，SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)茶樣與試劑

茶樣：信陽(yáng)毛尖、信陽(yáng)紅由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院茶葉研究所提供，鐵觀音從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

實(shí)驗(yàn)試劑：磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，水合茚三酮，氯化亞錫，蒸餾水，谷氨酸。

1.3兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

國(guó)標(biāo)GB/T8314-2002：分別吸取濃度為0.1mg/ml氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml與一組25ml容量瓶中，各加水4ml、緩沖溶液0.5ml、和茚三酮溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度(A)。

國(guó)標(biāo)GB/T8314-2013：分別吸取1ml濃度梯度為0mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液與一組25ml容量瓶中，各加入茚三酮溶液0.5ml、和緩沖溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度(A)。

1.4兩種標(biāo)準(zhǔn)方法回收率[4]

稱取信陽(yáng)毛尖樣品3g用450ml沸蒸餾水沸水浴45min過(guò)濾，并用蒸餾水沖洗數(shù)次，冷卻后定容到500ml，吸取過(guò)濾液1.0ml于一組25ml容量瓶中，每個(gè)樣品中加入100ug/ml谷氨酸母液1ml，在依次加入茚三酮溶液0.5ml、和緩沖溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度(A)，5次平行實(shí)驗(yàn)，按兩種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.5兩種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品氨基酸含量精密度實(shí)驗(yàn)[5]

稱取茶葉樣品3g用450ml沸蒸餾水沸水浴45min過(guò)濾，并用蒸餾水沖洗數(shù)次，冷卻后定容到500ml，吸取過(guò)濾液1.0ml于一組25ml容量瓶中，依次加入茚三酮溶液0.5ml、和緩沖溶液0.5ml，在沸水中加熱15min，冷卻后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度(A)，4次平行實(shí)驗(yàn)，按兩種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.6結(jié)果計(jì)算

1.6.1樣品中氨基酸含量的計(jì)算

式中：C——根據(jù)樣品吸光度“E”值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查得每毫升被測(cè)液中含氨基酸的毫克數(shù)除以1000，即得克量；V——樣品總體積的毫升數(shù)。V1——被測(cè)樣毫升數(shù)。

1.6.2 回收率的計(jì)算

式中：C1——根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)母液樣品的吸光度“E”值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查得的每毫升被測(cè)液中含氨基酸的毫克量；C——根據(jù)未加入標(biāo)準(zhǔn)母液樣品吸光度“E”值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查得的每毫升被測(cè)液中含氨基酸的毫克量。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果

新舊標(biāo)準(zhǔn)主要區(qū)別由1.3可見(jiàn)主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：首先是標(biāo)準(zhǔn)液中氨基酸濃度與梯度都不一樣，舊標(biāo)準(zhǔn)分別是0mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg，新標(biāo)準(zhǔn)分別是0mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg，由此可見(jiàn)新標(biāo)準(zhǔn)比舊標(biāo)準(zhǔn)氨基酸濃度梯度更大；其次，舊標(biāo)準(zhǔn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，加入4ml的水，而新標(biāo)準(zhǔn)不加水，與樣品處理一致更合理。

表1　兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果一覽表

按1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，相關(guān)系數(shù)R2表示氨基酸的濃度與吸光度之間的線性關(guān)系，R2越接近1表明兩者相關(guān)性越高；通常R2大于0.90時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)變量有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出R2均大于0.90，即兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法氨基酸的濃度與吸光度兩個(gè)變量之間都有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。且相關(guān)系數(shù)R2新標(biāo)準(zhǔn)>舊標(biāo)準(zhǔn)。但由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可見(jiàn)，對(duì)同一樣品，即同一吸光度，測(cè)得的氨基酸含量不同，而且相差較大，使氨基酸含量結(jié)果不可靠。

2.2兩種標(biāo)準(zhǔn)回收率實(shí)驗(yàn)

表2　兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率計(jì)算

按1.4對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，回收率指在樣品中加入已知濃度體積的標(biāo)樣之后，測(cè)出的總含量減去原樣品中的含量除以已知標(biāo)樣的含量就是回收率，回收率主要反應(yīng)該方法的準(zhǔn)確性，回收率越接近1，實(shí)驗(yàn)越準(zhǔn)確，該實(shí)驗(yàn)中不同標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的回收率不同[4]，GB/T8314-2002計(jì)算氨基酸加標(biāo)回收率是1.17，與實(shí)際相差甚遠(yuǎn)，說(shuō)明按GB/T8314-2002所測(cè)得氨基酸比實(shí)際高，相比之下GB/T8314-2013氨基酸加標(biāo)回收率是1.004，GB/T8314-2002所測(cè)得氨基酸與實(shí)際氨基酸含量相當(dāng)，新標(biāo)準(zhǔn)比舊標(biāo)準(zhǔn)更合理。

2.3兩種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品精密度

表3　精密度分析結(jié)果

按1.5 方法精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3，精密度是指多次重復(fù)測(cè)定同一樣品時(shí)各測(cè)定值之間彼此相符合的程度，表征測(cè)定過(guò)程中隨機(jī)誤差的大小。同時(shí)表示測(cè)量的再現(xiàn)性，是保證準(zhǔn)確度的先決條件，但是高的精密度不一定能保證高的準(zhǔn)確度。好的精密度是保證獲得良好準(zhǔn)確度的先決條件，一般說(shuō)來(lái)，測(cè)量精密度不好，就不可能有良好的準(zhǔn)確度。反之，測(cè)量精密度好，準(zhǔn)確度不一定好，這種情況表明測(cè)定中隨機(jī)誤差小，一般相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)在0～5之間，表示該處理樣品的方法隨機(jī)誤差小，可以給保證獲得良好準(zhǔn)確度的結(jié)果提供了先決條件[6]，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，兩種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品氨基酸平行實(shí)驗(yàn)RSD(%)均較低，即精密度均較高，由此可見(jiàn)，兩種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品氨基酸含量精密度均較高。

3結(jié)論

茶葉中氨基酸含量的測(cè)定主要有自動(dòng)分析儀法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法以及茚三酮比色法等方法，其中前三種方法重現(xiàn)性好，儀器穩(wěn)定，結(jié)果可靠，但前處理復(fù)雜，成本高，所以目前茶葉中氨基酸測(cè)定國(guó)標(biāo)法仍然采用茚三酮比色法。劉曉霞、周?chē)?guó)蘭[7]等人對(duì)GB/T8314-2002測(cè)定方法進(jìn)行了探討，黃本芬、呂小艇[8]等人對(duì)GB/T8314-2002中存在的問(wèn)題提出了自己的觀點(diǎn)，筆者主要針對(duì)新舊標(biāo)準(zhǔn)的差異即新標(biāo)準(zhǔn)中在標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是與樣品處理一致，反應(yīng)體系一開(kāi)始沒(méi)有加4ml水，而舊標(biāo)準(zhǔn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)反應(yīng)體系加入4ml水，從標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收、精密度等方面進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相關(guān)系數(shù)要高、加標(biāo)回收更準(zhǔn)確，精密度兩者相當(dāng)，測(cè)得茶葉中氨基酸要低15%左右。

參考文獻(xiàn)：

[1]宛曉春,黃繼軫,龔正禮.茶葉生物化學(xué)[M].3版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2003.

[2]全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB 8314-2002茶 游離氨基酸總量測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002．

[3]全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB 8314-2013茶 游離氨基酸總量測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013．

[4]吳樹(shù)宏,周春華.加標(biāo)回收率的計(jì)算方法的探討[J].甘肅環(huán)境研究與監(jiān)測(cè).2000,13(3):179-183.

[5]蓋鈞益.試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1985：44-46.

[6]南京大學(xué)編寫(xiě)組.無(wú)機(jī)及分析化學(xué) [M].3版.北京：高等教育出版社，1996:262-265．

[7]劉曉霞，周?chē)?guó)蘭，何萍，等. 茶葉中游離氨基酸及其總量的國(guó)標(biāo)法測(cè)定探討[J].貴州茶葉，2008,1(133):13-17.

[8]黃本芬，呂小艇，何正秀. 改進(jìn)茶葉中游離氨基酸總量測(cè)定方法[J].食品與發(fā)酵科技，2012,2(48):94-96.

(編輯：嚴(yán)佩峰)

Comparative Study of Determination of Amino Acid Content in Tea by Two Different Methods

CHEN Yi1, ZHANG Xiu-qing2，LI Yu-xia2, GUO Hong-ping3

(1.Tea Department of Xinyang College of Agriculture and Forestry, Key Laboratory of Basic Research in Xinyang Tea Industry,Xinyang 464000, China； 2. Tea Plantation of Jingju Temple in Guangshan County, Xinyang 464000, China；3. Scenic Spots Management Area of Jingju Temple in Guangshan County, Xinyang 464000, China)

Abstract：In this study, the GB/T8314-2002 and GB/T8314-2013 were compared in terms of standard curve correlation coefficient, adding standard recovery and precision of method. The results showed that the correlation coefficient of GB/T8314-2013 was higher than that of GB/T8314-2002, at the same time the recovery and the precision of the former was more accurate, and the amino acid content in the same sample was lower 15% .

Keywords：dissociated amino acids in tea;Spectrophotometry;Ninhydrin colorimetry;standard curve

中圖分類號(hào)：TS272.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-8978(2016)01-0093-03

作者簡(jiǎn)介：陳義(1980—)，男，安徽舒城人，講師，碩士，主要研究茶葉化學(xué)與茶葉加工.

基金項(xiàng)目：2015年度河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15B210009).

收稿日期：2015-09-20