石墨烯-殼聚糖復(fù)合材料修飾電極檢測己烯雌酚

黃生權(quán), 付 萌, 張 潔, 李文治, 張 芹, 邵科峰, 趙 波,*

(1.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510030;2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

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石墨烯-殼聚糖復(fù)合材料修飾電極檢測己烯雌酚

黃生權(quán)1, 付 萌1, 張 潔2, 李文治1, 張 芹2, 邵科峰2, 趙 波2,*

(1.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510030;2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

摘 要:制備了石墨烯-殼聚糖復(fù)合材料修飾電極,采用循環(huán)伏安法研究復(fù)合材料對電極導(dǎo)電性能的影響,并利用己烯雌酚抗體與己烯雌酚之間的特異性反應(yīng),以K3Fe(CN)6為探針,采用差分脈沖伏安法進行食品中己烯雌酚殘留量的檢測研究。在優(yōu)化條件下,ρ(己烯雌酚)在1～2 500 μg/L內(nèi)與電流差值呈線性關(guān)系,線性回歸方程ΔI=25.036 8+0.003 42ρ(R=0.991 24),檢出限為0.1 μg/L。對豬肉、牛肉、鴨肉及奶粉樣品進行加標檢測,回收率93.2%～106.8%。

關(guān)鍵詞:己烯雌酚;石墨烯;殼聚糖;差分脈沖伏安法

HUANG Shengquan,FU Meng,ZHANG Jie,et al.Electrochemical immunosensor for diethylstilbestrol determination based on graphene-chitosan composite modified glassy carbon electrode[J].Journal of Food Science and Technology,2016,34(1):66-71.

*趙 波,男,教授,博士,主要從事食品安全檢測與預(yù)警方面的研究。通信作者。

己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)是一種人工合成的1,2-二苯乙烯類物質(zhì),結(jié)構(gòu)式見圖1,具有促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和減少脂肪合成等作用,曾被獲準用作動物促生長劑,在20世紀六七十年代廣泛用于動物養(yǎng)殖業(yè)[1]。己烯雌酚可通過食物鏈進入人體,產(chǎn)生激素分泌異常、乳腺癌和胚胎畸形等嚴重后果,因此在我國和歐美等國家和地區(qū)已被明令禁止用于動物養(yǎng)殖[2]。

圖1　己烯雌酚結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of diethylstilbestrol(DES)

目前用于DES殘留檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫法[3-4]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-8]、高效液相色譜法[9-11]等。但這些方法都具有前處理復(fù)雜,價格昂貴以及攜帶不方便等缺點。

石墨烯材料由于具有超高的比表面積[12]和優(yōu)異的電子傳導(dǎo)能力[13]等優(yōu)點,常用于制備高性能的納米復(fù)合材料[14-17]。殼聚糖是一種含有大量羥基和氨基的天然高分子聚合物,對許多離子、生物大分子、有機物小分子都具有較強的吸附能力,并且價廉無毒,還有很好的滲透性和成膜性[18-19],被廣泛用于各種傳感器的制備[20-22]。石墨烯-殼聚糖復(fù)合物因同時具有良好的導(dǎo)電性和成膜性,常被用于電極的修飾,在食品和環(huán)境污染物的分析檢測中得到了廣泛應(yīng)用[23-25]。

本文將納米技術(shù)和免疫分析方法有機結(jié)合,構(gòu)建了一種基于石墨烯-殼聚糖-己烯雌酚復(fù)合物修飾電極的免疫傳感器,具有高靈敏、高選擇性、低成本等優(yōu)點,并將其運用于實際樣品中己烯雌酚的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

殼聚糖和己烯雌酚,Sigma-Aldrich公司；己烯雌酚抗體,北京勤邦生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白(BSA),上?；鄯f生物科技有限公司。

磷酸緩沖溶液(PBS,pH值7.4)由0.1 mol/L 的KH2PO4和Na2HPO4按一定比例配制得到；提取液由乙腈與丙酮以體積比4：1的比例混合得到。其他試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

CHI-660D型電化學(xué)工作站,上海辰華儀器有限公司。

1.2 石墨烯-殼聚糖分散液的制備

1.2.1 氧化石墨的制備

將6 g石墨粉緩慢地加入到25 mL濃H2SO4、5 g K2S2O8與5 g P2O5的混合物中,室溫反應(yīng)過夜。將上述混合物在冰水浴冷卻下加入到250 mL冷的濃H2SO4中,在攪拌下緩慢加入30 g KMnO4,并將溫度控制在20℃以下。攪拌反應(yīng)3 h后緩慢加入500 mL蒸餾水,保持溫度在50℃以下,再攪拌反應(yīng)2 h。然后加入25 mL濃H2O2溶液和1.5 L水,再攪拌反應(yīng)24 h。離心分離,將產(chǎn)物依次用2.5 L的HCl溶液(3 mol/L)和2.5 L水洗至洗液呈中性。

1.2.2 石墨烯的制備

將0.1 g新制備的氧化石墨加入到200 mL的NaOH溶液(1 mmol/L)中,超聲分散90 min；在4000 r/min下離心3 min,除去下層沉淀物后向上清液中加入0.2 mL水合肼,加熱至90℃反應(yīng)2 h,得到石墨烯分散液。

1.2.3 石墨烯-殼聚糖分散液的制備

將1.0 g殼聚糖加入到500 mL的HCl溶液(0.05 mol/L)中,攪拌并加熱至90℃使其完全溶解,待冷卻后用NaOH溶液(0.1 mol/L)將pH值調(diào)節(jié)至7,并用蒸餾水定容到1 L。取5.0 mg新制備的石墨烯加入到2 mL殼聚糖溶液中,超聲分散1 h,得到石墨烯-殼聚糖分散液。

1.3 修飾電極的制備

將φ=3 mm的玻碳電極(glassy carbon electrode,GCE)用Al2O3拋光粉(φ=0.3 μm)拋光至鏡面,用蒸餾水、無水乙醇、蒸餾水依次超聲清洗3 min,最后用蒸餾水沖洗干凈,置于室溫下晾干待用。將2 μL己烯雌酚溶液(質(zhì)量濃度為0.2 g/L)與4 μL石墨烯-殼聚糖分散液混合均勻,滴涂于玻碳電極表面,置于37℃下烘干30 min。最后將電極置于牛血清白蛋白溶液(ω=5%)中浸泡30 min,用以封閉剩余的活性位點。

1.4 樣品前處理

1.4.1 豬肉、牛肉及鴨肉樣品的前處理

將(1±0.005)g豬肉、牛肉及鴨肉樣品絞碎后分別置于10 mL的樣品管中,加入己烯雌酚標準溶液,和3 mL乙腈-丙酮提取液(V(乙腈)：V(丙酮) =4：1),超聲分散30 min。在2000 r/mim下離心10 min,吸取上清液,于50℃下氮氣吹干,加入1 mL的磷酸緩沖溶液(pH值=7.4),溶解后用于電化學(xué)測試。

1.4.2 奶粉樣品的前處理

將0.300 g奶粉置于10 mL的樣品管中,加入己烯雌酚標準溶液和2 mL正己烷,超聲分散30 min。在2 000 r/min下離心10 min,吸取上清液,于50℃下氮氣吹干,加入1 mL的磷酸緩沖溶液(pH值= 7.4),溶解后用于電化學(xué)測試。

1.5 電化學(xué)測試

利用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry,CV)和差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)研究了修飾電極的電化學(xué)行為和優(yōu)化的工作條件,并在優(yōu)化實驗條件下進行了實際樣品中加標己烯雌酚含量的測定。其中,CV掃描電位為-0.2～0.8 V,掃描速率為100 mV/s；DPV掃描電位在-0.2～0.5 V,脈沖幅度為50 mV,脈沖寬度為50 ms。

所有電化學(xué)實驗均采用三電極系統(tǒng)在CHI-660D電化學(xué)工作站上完成。其中工作電極為石墨烯-殼聚糖-己烯雌酚修飾的玻碳電極,參比電極為Ag/AgCl電極,輔助電極為鉑絲電極。所有電化學(xué)測試均在K3Fe(CN)6的磷酸緩沖溶液中(pH值= 7.4)于室溫下進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

采用己烯雌酚抗體與己烯雌酚的特異性結(jié)合反應(yīng)的競爭模式實現(xiàn)對樣品中己烯雌酚含量的檢測,其工作原理如圖2。1)當待測樣品溶液中含有游離己烯雌酚時,修飾在電極上的己烯雌酚和游離己烯雌酚與樣品溶液中加入的己烯雌酚抗體發(fā)生競爭反應(yīng),生成己烯雌酚-抗體復(fù)合物,從而使己烯雌酚抗體被吸附到電極上；2)電極表面形成的己烯雌酚-抗體復(fù)合物阻礙K3Fe(CN)6離子到達電極表面,導(dǎo)致電流下降；3)待測樣品溶液中含有的己烯雌酚濃度不同,對電極電化學(xué)信號的影響即有差異,以此建立電化學(xué)信號與己烯雌酚濃度的響應(yīng)關(guān)系,實現(xiàn)對樣品溶液中己烯雌酚的檢測。

2.2 修飾電極的循環(huán)伏安分析

采用循環(huán)伏安法對不同修飾電極的電化學(xué)行為進行了研究,其結(jié)果如圖3。圖3中曲線a為裸電極在K3Fe(CN)6溶液(2 mmol/L)中的CV曲線,其氧化峰電流值為24.9 μA；曲線b為石墨烯-殼聚糖-己烯雌酚修飾電極在K3Fe(CN)6溶液中的CV曲線,其氧化峰電流由24.9 μA增大到44.8 μA,表明電子傳遞作用得到了增強,這是由于石墨烯具有優(yōu)異的導(dǎo)電性；曲線c為將以上修飾電極置于含有己烯雌酚抗體的孵育液中孵育后,再放入K3Fe(CN)6溶液中進行電化學(xué)掃描所得的CV曲線。其氧化峰電流下降為28.2 μA,這說明電子傳遞受到了一定程度的阻礙,這是由于己烯雌酚抗體與電極上修飾的己烯雌酚結(jié)合,形成己烯雌酚-抗體復(fù)合物,增加了對電子傳遞的阻礙,也說明己烯雌酚分子已有效地修飾到了電極上。

圖2　己烯雌酚電化學(xué)免疫傳感器的檢測原理Fig.2 Principle of electrochemical immunosensor for DES detection

圖3　電極在2 mmol/L的K3Fe(CN)6的PBS溶液中的CV曲線Fig.3 CV recorded in PBS solution containing 2 mmol/L K3Fe(CN)6

2.3 實驗條件優(yōu)化

采用差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)對檢測條件的影響進行了研究,包括孵育時間和抗體使用量。掃描電位在0.2～0.5 V,脈沖幅度為50 mV,脈沖寬度為50 ms。

2.3.1 免疫反應(yīng)時間

首先將使用的抗體體積固定在20 μL,對免疫反應(yīng)時間進行了優(yōu)化,結(jié)果如圖4。

圖4　孵育時間對DPV峰電流的影響Fig.4 Influences of incubation time on DPV response

由圖4可知,DPV峰電流在0～5 min內(nèi)迅速下降,在5～15 min繼續(xù)下降,但趨于平緩,15～20 min反而有所增加,因此選擇15 min作為免疫反應(yīng)的孵育時間。

2.3.2 抗體使用量

在實驗確定的優(yōu)化孵育時間(15 min)下,對所用己烯雌酚抗體的體積進行了優(yōu)化,結(jié)果如圖5。

圖5　抗體使用量的影響Fig.5 Influences of antibody volume on DPV response

由圖5可知,DPV峰電流在抗體用量為1 μL時即發(fā)生較大程度變化(降低約30%),在抗體用量為1～10 μL時繼續(xù)下降,但趨勢放緩(降低約22%),超過10 μL之后電流基本不再降低,說明抗體已基本和電極上修飾的己烯雌酚完全結(jié)合,因此選擇10 μL作為免疫反應(yīng)中使用的抗體量。

2.4 己烯雌酚的檢測

將修飾電極放在含有10 μL抗體的磷酸緩沖溶液中孵育后的DPV峰電流定義為I0,在含有己烯雌酚和相同濃度抗體的緩沖溶液中孵育后的DPV峰電流定義為Ix,則電流的增加值ΔI=Ix-I0。在上述實驗確定的優(yōu)化條件下,測定了修飾電極在緩沖溶液和含有不同濃度的己烯雌酚和相同濃度己烯雌酚抗體的孵育液中孵育后,在2 mmol/L的K3Fe(CN)6的PBS溶液中的DPV曲線,見圖6(圖6中曲線a為空白緩沖溶液,曲線b～h分別為含有相同濃度的己烯雌酚抗體和己烯雌酚濃度依次為2 500 μg/L,1 500 μg/L,1 000 μg/L,500 μg/L,100 μg/L,1 μg/L和0的孵育液)。

圖6　修飾電極在緩沖溶液和含有相同濃度的己烯雌酚抗體與不同濃度的己烯雌酚中的DPV曲線Fig.6 DPV curves of modified immunosensor after incubating with blank solution and various concentrations of DES combined with same concentration of DES antibody in buffer solution

當溶液中游離己烯雌酚濃度逐漸增加時,抗體與游離己烯雌酚結(jié)合的部分隨之增加,而與電極上修飾的己烯雌酚結(jié)合的部分相應(yīng)減少,對電極導(dǎo)電能力的阻礙隨之減小,因此DPV峰電流的增加值ΔI逐漸增大。結(jié)果表明,ΔI與溶液中己烯雌酚密度在1～2 500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為ΔI=25.036 8+0.003 42ρ,R=0.991 24,式中ΔI,μA；ρ,μg/L,最低檢測限為0.1 μg/L。

2.5 免疫傳感器的重復(fù)性、穩(wěn)定性與再生

對石墨烯-殼聚糖-己烯雌酚修飾電極重復(fù)進行10次DPV掃描,峰電流值變化小于5%,說明本實驗具有較好的可重復(fù)性。將2支修飾電極分別存放在磷酸緩沖溶液(pH值=7.4)和空氣中,每天進行DPV掃描,峰電流值在5 d內(nèi)降低值不超過10%,說明制備的修飾電極具有較好的穩(wěn)定性。

將孵育過的修飾電極置于0.1 mol/L的甘氨酸-HCl緩沖溶液(pH值=2.8)中浸泡20 min,可以洗去吸附在電極表面的己烯雌酚抗體。

2.6 實際樣品的分析

對豬肉、牛肉、鴨肉及奶粉4種實際樣品以實驗步驟1.4中所述方法進行前處理,然后用優(yōu)化的實驗條件進行測定,每個添加濃度測定3次,統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1　樣品加標處理測試己烯雌酚實驗結(jié)果Tab.1 Recoveries of diethylstilbestrol from spiked samples

從表1中可以看出,豬肉樣品中添加己烯雌酚的回收率在93.2%～98.5%,鴨肉樣品添加己烯雌酚的回收率在99.0%～106.6%,牛肉樣品的回收率在86.1%～105.4%,牛奶樣品的回收率在100.6%～106.8%。

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了一種基于石墨烯-殼聚糖-己烯雌酚修飾電極的電化學(xué)免疫傳感器,結(jié)合了石墨烯高比表面積、高導(dǎo)電性能,以及殼聚糖的優(yōu)良成膜性能。采用競爭法檢測己烯雌酚時,線性范圍為1～2 500 μg/L,檢測限為0.1 μg/L,完全能滿足國家對于雌酚類獸藥殘留規(guī)定的檢測要求[2]。將此免疫傳感器用于豬肉、鴨肉、牛肉及奶粉實際樣品中己烯雌酚的檢測,回收率在93.2%～106.8%。

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(責任編輯:李 寧)

Electrochemical Immunosensor for Diethylstilbestrol Determination Based on Graphene-Chitosan Composite Modified Glassy Carbon Electrode

HUANG Shengquan1, FU Meng1, ZHANG Jie2, LI Wenzhi1, ZHANG Qin2, SHAO Kefeng2, ZHAO Bo2,*
(1.Infinitus(China)Co Ltd,Guangzhou 510030,China；2.School of Chemistry and Materials Science,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China)

Abstract:A graphene-chitosan modified glassy carbon electrode was prepared.Electrical conductivity of the modified glassy carbon electrode(GCE)was investigated by cyclic voltammetry(CV).Competitiveelectrochemical immunoassay was performed to detect diethylstilbestrol by differential pulse voltammetry (DPV).Under the optimized conditions,the Δ-value of oxidation peak current was proportional to diethylstilbestrol concentration in the range between 1 and 2 500 μg/L.The linear equation was ΔI= 25.036 8+0.003 42ρ(R=0.991 24),and the detection limit was 0.1 μg/L.A good recovery of diethylstilbestrol in the range of 93.2%-106.8%was obtained in pork,beef,duck,and milk powder.

Key words:diethylstilbestrol；graphene；chitosan；differential pulse voltammetry

作者簡介:黃生權(quán),男,博士后,主要從事食品加工技術(shù)與應(yīng)用方面的研究；

基金項目:江蘇省科技支撐計劃項目-社會發(fā)展(BE2014720)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(14)2127)。

收稿日期:2015-01-01

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2016.01.010

文章編號:2095-6002(2016)01-0066-06

中圖分類號:TS207.3

文獻標志碼:A

引用格式:黃生權(quán),付萌,張潔,等.石墨烯-殼聚糖復(fù)合材料修飾電極檢測己烯雌酚[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報,2016,34(1):66-71.