青蒿琥酯抑制肝星狀細胞m icroRNA-154/β-catenin治療肝纖維化的機制研究

張　英　　張　洪　　彭　銳　　魏丹蕓武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北武漢　430060

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青蒿琥酯抑制肝星狀細胞m icroRNA-154/β-catenin治療肝纖維化的機制研究

張英張洪彭銳魏丹蕓
武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北武漢430060

[摘要]目的探討青蒿琥酯抑制肝星狀細胞microRNA-154/β-catenin治療肝纖維化的機制。方法培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞，用不同濃度（0、5、10、20、30、40μg/mL）青蒿琥酯作用于大鼠肝星狀細胞，采用免疫印跡法（Western blot）檢測青蒿琥酯作用后細胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達；實時定量RT-PCR檢測青蒿琥酯作用后細胞內(nèi)的miR-154和β-cateninmRNA的相對表達。結果0～40μg/mL青蒿琥酯作用細胞24 h后，免疫印跡法結果顯示，βcatenin蛋白量逐漸降低，并呈劑量相關性（P＜0.05）；實時熒光定量PCR結果顯示青蒿琥酯作用后，β-catenin mRNA表達量及miR-154表達量逐漸降低，并呈劑量相關性（P＜0.05）。結論青蒿琥酯可能是通過抑制microRNA-154表達作用于Wnt/β-catenin信號通路及來抑制肝纖維化的發(fā)生，microRNA-154與Wnt/β-catenin信號通路可能存在一定的相關性。

[關鍵詞]青蒿琥酯曰肝星狀細胞曰miR-154曰W nt/β-catenin信號通路曰肝纖維化

肝纖維化是所有慢性肝病發(fā)展成肝硬化的共同病理基礎與必經(jīng)途徑，是“慢性肝炎-肝纖維化-肝癌”的中心環(huán)節(jié)，并且具有可逆性[1-2]。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是導致肝纖維化發(fā)生的主要發(fā)病機制，肝損傷后導致HSC大量活化增殖，從而合成分泌大量的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），ECM的大量沉積導致肝纖維化的發(fā)生[3]。因此促進活化的HSC凋亡可能成為治療肝纖維化的有效方法。

Wnt/β-catenin信號通路是促肝纖維化細胞凋亡的主要轉(zhuǎn)導通路之一，通路活化后，β-catenin移位至細胞核，與核內(nèi)T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）結合誘導靶基因轉(zhuǎn)錄，促進肝纖維化的發(fā)生[4-5]。micoRNA（miRNA）是一類細胞內(nèi)源性小片段RNA分子，由20～25個核苷酸組成[6]。可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)控靶基因的表達而影響細胞的增殖、分化、凋亡及個體的生長發(fā)育等生命過程[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了多種疾病的病理過程，是重要的疾病候選診斷標志物及潛在治療靶點[9]。本課題組發(fā)現(xiàn)miR-154在大鼠HSC中表達具有較大程度的上調(diào)，抑制miR-154的表達可有效地促進細胞凋亡。

青蒿琥酯（Artesunate）是青蒿素的衍生物，前期研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以促進肝星狀細胞的凋亡[10]，本實驗深入探討了青蒿琥酯作用后HSC中Wnt/βcatenin信號通路中的蛋白表達含量及microRNA-154的表達量變化，研究兩者在促進HSC凋亡過程中的相關性。為探討青蒿琥酯抗肝纖維化的作用機制提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株大鼠HSC（HSC-T6）購于上海艾研生物有限公司，由美國ATCC細胞庫引進，為SV40轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細胞，其表現(xiàn)型為活化的HSC細胞。

1.1.2試藥注射用青蒿琥酯（桂林南藥股份有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（上海吉諾公司）；胎牛血清（美國Gibico公司）；胰蛋白-EDTA消化液（美國Gibico公司）；DMSO（美國Sigma公司）；96、6孔板（美國Corning公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢谷歌生物有限公司）；β-catenin一抗（美國Cell Signaling Technology公司）；二抗羊抗兔IgG（美國LI-COR Biosciences公司）；RNA提取試劑Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司設計并合成。

1.1.3儀器超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司）；CB150 CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；HeraeusFresco21低溫微量離心機（德國Thermo公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）；NanoDrop 2000c紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；普通RT-PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；熒光定量PCR管（美國ABI公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)取大鼠HSC（HSC-T6）用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）培養(yǎng)，于37℃、5%CO2飽和度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待細胞生長密度大約為90%時，倒掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）平衡鹽溶液輕輕洗滌細胞

2次，棄去PBS，用0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，待細胞收縮變圓并開始滑落，立即加入培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打混懸細胞，1000 r/min離心5min，棄上清，用培養(yǎng)基將細胞吹散混懸，進行傳代或種板。以3×105個細胞/孔將細胞接種于6孔板，待細胞生長密度至60%～70%時，分別換成用含5、10、20、30、40μg/mL青蒿琥酯的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并設一孔加等量不含藥培養(yǎng)基作為對照組，培養(yǎng)24 h后，提取蛋白質(zhì)和RNA。

1.2.2細胞總RNA的提取青蒿琥酯作用24 h后收集細胞，按照Trizol RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA。加入1mLTrizol反復吹打使細胞充分裂解，靜置15min，加入0.2mL氯仿（Trizol∶氯仿=5∶1），劇烈振蕩顛倒30 s，室溫靜置15min。4℃，12 000 r/min離心15min。移上清液至無酶離心管中，加入等體積異丙醇，靜置10min；4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1 mL預冷的75%乙醇，洗滌RNA。4℃下7500 r/min離心10min，重復1次。晾干至半透明，加入適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，紫外分光光度計測定濃度及純度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3免疫印跡法（Wes t ern b l ot）測定青蒿琥酯作用后細胞內(nèi)β-catenin蛋白表達變化青蒿琥酯作用24 h后收集各孔細胞，PBS輕輕洗滌2次，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定提取的蛋白濃度。加上樣緩沖液，100℃加熱煮沸7min。每組取20μg總蛋白上樣，利用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各組細胞蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜用5%BSA封閉液封閉1h，用封閉液稀釋相應的一抗，一抗β-catenin兔抗鼠（1∶500）和GAPDH兔抗鼠4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入羊抗兔二抗，室溫搖床上慢速孵育1 h，TBST洗膜3次，利用Odyssey成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描分析，檢測各組細胞的β-catenin與GAPDH蛋白條帶的灰度值，計算兩者比值作為其相對蛋白表達量。

1.2.4Rea l-t ime PCR測定青蒿琥酯作用后細胞內(nèi)β-cat enin mRNA及miR-154表達變化取合格的RNA樣品，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mixture試劑盒檢測β-catenin mRNA、miR-154在各組細胞中的表達情況。β-catenin mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miR-154以U6為反應內(nèi)參，β-catenin、GAPDH、U6和miR-154的逆轉(zhuǎn)錄引物及RT-PCR反應引物由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司設計并合成，引物序列見表1。RT-PCR反應條件為：95°C，30 s，1個循環(huán)；95°C，5 s，60°C，40 s，共40個循環(huán)；95°C，30 s，60°C，1min，95°C，15 s。反應在96孔板中進行，每個反應設3個復孔，共包含20μL的反應體系。反應結束后得到各組的目的基因和內(nèi)參的Ct值，以內(nèi)參進行標準化處理，使用ΔΔCT法分析RT-PCR所得數(shù)據(jù)，根據(jù)公式2-ΔΔCT，（ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參，ΔΔCT=ΔCTArt組-ΔCT對照組），計算分別得到目的基因β-catenin和miR-154的相對表達量，并進行統(tǒng)計學分析并做圖。

表1　RT-PCR中各引物序列

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，相對實時定量PCR測定結果和蛋白表達測定結果處理采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1青蒿琥酯對大鼠肝星狀細胞內(nèi)β-catenin蛋白表達水平的影響

與空白對照組比較，隨著青蒿琥酯藥物濃度的不斷升高，肝星狀細胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達量逐漸降低，并呈劑量依賴性，β-catenin蛋白的表達量與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同濃度組之間β-catenin蛋白的表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明青蒿琥酯作用于肝星狀細胞可能與Wnt/β-catenin信號通路有關，結果見圖1。

圖1　青蒿琥酯對大鼠肝星狀細胞β-c a t e n i n蛋白的影響

2.2青蒿琥酯對肝星狀細胞內(nèi)β-catenin mRNA及m iR-154表達水平的影響

與空白對照組比較，隨著青蒿琥酯藥物濃度的不斷增加，肝星狀細胞內(nèi)β-cateninmRNA的表達量及miR-154的表達量逐漸降低，并呈劑量依賴性，βcateninmRNA及miR-154的表達量與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同濃度組之間的β-catenin mRNA及miR-154的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果見圖2。說明青蒿琥酯抑制肝星狀細胞的增殖可能與β-catenin及miR-154有關，miR-154與Wnt/β-catenin信號通路間可能存在一定相關性。

圖2　青蒿琥酯對大鼠肝星狀細胞β-c a t e n i n m RNA 及m iR-154表達的影響

3　討論

肝纖維化是指由各種致病因子所致的肝內(nèi)結締組織異常增生，導致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程[11]。許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，而肝纖維化是各種慢性疾病發(fā)展成肝硬化的中心環(huán)節(jié)，抑制肝纖維化的發(fā)生對預防肝硬化和肝癌的發(fā)生至關重要[12-13]。HSC是肝纖維化發(fā)生過程中的關鍵細胞，HSC被激活后大量增殖分化，在肝內(nèi)表達過量的細胞外基質(zhì)，最終引起肝纖維化的發(fā)生[14]。因此抑制HSC的活化增殖是治療肝纖維化的有效方法。本實驗前期用青蒿琥酯作用于大鼠HSC發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以有效地促進HSC的凋亡[15]。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路是近年來提出的促HSC凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導通路之一[16]。該通路未活化時，β-catenin呈磷酸化狀態(tài)處于胞漿內(nèi)，該通路活化后，β-catenin去磷酸化并移位至細胞核內(nèi)，與T細胞因子/淋巴增強子因子結合，誘導Wnt調(diào)控的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進肝纖維化發(fā)生。有研究報道稱抑制Wnt通路可以有效地促進HSC的凋亡，抑制肝纖維化的發(fā)生[17-18]。

近年來，microRNA被發(fā)現(xiàn)參與許多疾病的病理過程，是疾病潛在的治療靶點和候選診斷標志物[19]?？梢詫虻谋磉_進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，影響細胞的分化、增殖、凋亡以及個體生長發(fā)育等多種生命活動[20]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-154在肺纖維化細胞中表達具有較大程度的上調(diào)，并且miR-154通過活化Wnt/βcatenin信號通路來促進肺纖維化細胞的增殖，促進肺纖維化的發(fā)生[21]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，活化的大鼠HSC 中miR-154較普通大鼠肝細胞也有較大程度的上調(diào)，同時Wnt/β-catenin信號通路在大鼠HSC中處于活化狀態(tài)，說明miR-154和Wnt/β-catenin信號通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中也可能起著重要作用。本實驗結果顯示，青蒿琥酯作用HSC后，細胞內(nèi)βcatenin蛋白含量及β-catenin mRNA表達量顯著下調(diào)，同時miR-154的表達量也明顯降低，并呈劑量依賴性，說明青蒿琥酯促進HSC的凋亡與Wnt/βcatenin信號通路及miR-154相關，可能是通過抑制miR-154對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控而發(fā)揮作用，抑制miR-154可以抑制其對β-catenin的活化作用，下調(diào)β-catenin介導的基因轉(zhuǎn)錄，進而促進HSC的凋亡，抑制肝纖維化的發(fā)生。本研究結果提示miR-154及Wnt/β-catenin信號通路在青蒿琥酯抑制肝纖維化發(fā)生過程中的起著重要作用，但是miR-154與肝纖維化發(fā)生的關系、miR-154與β-catenin蛋白之間的關系及miR-154是否是通過對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用來參與肝纖維化還有待我們進一步研究。下一步我們將在大鼠HSC中轉(zhuǎn)染miR-154模擬物及抑制物，觀察其對大鼠HSC的增殖、凋亡的影響，觀察其對Wnt/β-catenin信號通路中相關蛋白表達的影響，從而確定miR-154在大鼠肝纖維化發(fā)生過程中的關鍵作用，確定其可以作為治療肝纖維化的潛在靶點。

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M echanism research on Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibitingm iR-154/茁-catenin in hepatic stellate cell

ZHANG Ying ZHANG Hong PENG Rui WEIDanyun
Department of Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

[Abstract]Objective To investigate themechanism of Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibitingmiR-154/β-catenin in hepatic stellate cell.M ethods HSC-T6 cells were cultured in vitro with different concentrations(0, 5,10,20,30,40μg/mL)of Artesunate on rat hepatic stellate cells.Western blotwas used to detect the expression of β-catenin protein after drug administration.RT-PCR was used to detect the expression ofβ-catenin mRNA and microRNA-154 after drug administration.Results After treatment with artesunate for 24 h,the results of Western blot showed that the expression ofβ-catenin protein significantly decreased in a dose-dependentmanner(P＜0.05).The results of RT-PCR showed that the expression ofβ-catenin mRNA and microRNA significantly decreased in a dosedependentmanner(P＜0.05).Conclusion Artesunatemay suppress the occurrence of liver fibrosis through inhibiting the expression ofmicroRNA-154 on Wnt/β-catenin signaling pathway.Theremay exist a certain correlation between miR-154 and the wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words]Artesunate;Hepatic stellate cell;miR-154;Wnt/β-catenin signaling pathway;Liver fibrosis

收稿日期：（2015-07-22本文編輯：趙魯楓）

[通訊作者]張洪（1962.5-），男，碩士，教授，碩士生導師；研究方向：靶向制劑研究，藥物作用機制研究，抗腫瘤藥物的新劑型及個體化給藥研究。

[作者簡介]張英（1990.1-），女，武漢大學2013級藥劑學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：藥物作用機制研究。

[基金項目]湖北省自然科學基金項目（2011CDB491）。

[中圖分類號]R914.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0035-04