巴豆生物堿對肺腺癌細胞凋亡的影響及機制研究

武　曉　　劉鳳娟　　王鵬飛　　張春玲青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，山東青島　266042

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巴豆生物堿對肺腺癌細胞凋亡的影響及機制研究

武曉劉鳳娟王鵬飛張春玲
青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，山東青島266042

[摘要]目的研究巴豆生物堿（CA）對肺腺癌細胞（A549）增殖和凋亡的影響，推測其抗肺癌作用機制。方法體外培養(yǎng)肺腺癌細胞（A549）。用終濃度分別為0（對照組）、10、50、100μg/mL的CA組處理A549細胞24 h后，于相差顯微鏡下觀察細胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)、脫落情況等；MTT法檢測細胞的生長活性；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；酶聯(lián)免疫法（ELISA）和RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)蛋白及基因Bcl-2、Bax的表達。結(jié)果10、50、100μg/mL的CA均能抑制A549細胞增殖，其抑制率與作用劑量相關(guān)。流式細胞術(shù)檢測顯示不同劑量CA作用于A549細胞24 h后，100μg/mL的CA可引起細胞凋亡，其余劑量未見凋亡；100μg/mL的CA組細胞凋亡率為（45.940±0.031）%，對照組細胞凋亡率為（3.450±0.012）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA提示不同劑量CA作用于A549細胞24 h后，100μg/mL的CA組促凋亡蛋白Bax為8.940±0.211，較對照組（4.450±0.131）表達增加；抑凋亡蛋白Bcl-2為4.860±0.132，較對照組（7.390±0.181）表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RT-PCR顯示100μg/mL的CA組Bax mRNA為6.881±0.611，較對照組（3.417±0.461）表達增加；Bcl-2 mRNA為2.812±0.342，較對照組（4.243± 0.731）表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CA能抑制A549細胞的生長并促進其凋亡，其發(fā)生與Bax蛋白及基因的表達上調(diào)和Bcl-2蛋白及基因的表達下調(diào)有關(guān)。CA抗肺癌的作用機制可能通過Bax/Bcl-2途徑促進腫瘤細胞凋亡，從而為臨床治療肺癌提供新的思路和途徑。

[關(guān)鍵詞]巴豆生物堿；肺腺癌；凋亡；作用機制

近年來，大家開始對巴豆及其提取物的抗腫瘤作用進行研究。巴豆生物堿（crotonic alkaloids，CA）具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。巴豆是一種流傳于民間，用于抗癌的中草藥偏方，為大戟科植物巴豆的干燥成熟種子，可生用、炒焦用或制霜用。民間早已應(yīng)用巴豆的提取物治療惡性腫瘤，其提取物對胃癌、肝癌及甲狀腺癌等多種腫瘤均具有治療作用，其能緩解晚期胃癌患者的癥狀，減慢病程的進展，減少轉(zhuǎn)移。相關(guān)文獻資料關(guān)于CA抗癌作用機制的研究甚少，鮮有報道。查閱國內(nèi)外文獻，CA對于胃癌、卵巢癌、腸癌等均有抗癌作用，但尚未見有關(guān)抗肺癌作用的報道。本實驗采用體外肺癌細胞培養(yǎng)，研究CA對肺癌細胞（A549）增殖和凋亡的影響，初探CA對肺癌的治療作用及有效作用機制。

1　材料與方法

1.1試劑與耗材

肺腺癌細胞株（A549細胞）取自青島市中心醫(yī)院腫瘤生物治療中心。

DMEM培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；DMSO（美國Hyclone公司）；流式細胞術(shù)所需材料（中國森雄公司）；RNAiso Reagent（購自Takara公司）；瓊脂糖、DNA Marker 2000、氯仿、異丙醇（上海生物工程有限公司）；Loading Buffer（大連寶生物工程有限公司）；內(nèi)參GAPDH cDNA引物序列；Bax、Bcl-2引物序列（上海生物工程有限公司合成）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒（購自Fermentas中國公司）；巴豆生物堿。

Bax：GAGGAACTGGACAGTAACATGGAGCT；CGGCCCCAGTTGAAGTTGC。Bcl-2：GCCGGTTCAGGTACTCAGTCATC；GTCACCTTCACCGTTCCA。GAPDH：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.2試驗方法

體外培養(yǎng)肺腺癌細胞（A549）。用終濃度分別為0（對照組）、10、50、100μg/mL的CA組處理A549細胞24 h后，于相差顯微鏡下觀察細胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)、脫落情況等；MTT法檢測細胞的生長活性；流式細胞儀（AnnexinV-PI染色）檢測細胞凋亡率；酶聯(lián)免疫法（ELISA）和RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)蛋白及基因Bcl-2、Bax的表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測不同劑量CA對A549細胞活性的影響

不同劑量CA作用于A549細胞24 h后，對細胞活性均具有顯著抑制作用，隨著藥物濃度增加，細胞活性受抑制逐漸增加，表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。見表1。

表1　不同劑量CA對A 5 4 9細胞活性的影響（?s）

2.2倒置相差顯微鏡下A549細胞形態(tài)學(xué)觀察

對照組A549細胞生長狀態(tài)良好，漂浮細胞較少，胞漿豐富，胞核清晰可見，呈多角形，細胞排列不緊密，細胞間可見相互連接（圖1A）。CA組：10μg/mL的CA干預(yù)A549細胞24 h后，大部分貼壁細胞有完整的胞核和胞漿，小部分細胞皺縮成球（圖1B）；50μg/mL的CA干預(yù)A549細胞24 h后，可見許多漂浮細胞，貼壁細胞少見有完整的胞核和胞漿，大部分細胞呈齒輪形狀，并且部分細胞皺縮成球（圖1C）；100μg/mL的CA干預(yù)A549細胞24 h后，可見大量漂浮細胞，貼壁細胞幾乎無完整的胞核和胞漿，大部分細胞皺縮成球，已無正常細胞形態(tài)（圖1D）。

圖1　不同劑量CA干預(yù)A 5 4 9細胞的倒置相差顯微鏡下表現(xiàn)（1 0 0×）

2.3AnnexinV-PI染色檢測不同劑量CA對細胞凋亡的影響

100μg/mL的CA作用于A549細胞后24 h細胞凋亡率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

注：與對照組比較，*P＜0.05；CA：巴豆生物堿

與對照組比較，100μg/mL的CA組抑凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其余劑量CA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　不同劑量CA對A 5 4 9細胞Bc l-2、Ba x蛋白表達的影響（±s）

表3　不同劑量CA對A 5 4 9細胞Bc l-2、Ba x蛋白表達的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；CA：巴豆生物堿

組別　　劑量（μg/mL）　Bcl-2　Bax對照組CA組0 10 50 100 7.390±0.181 6.980±0.139 6.250±0.171 4.860±0.132*4.450±0.131 4.250±0.112 5.270±0.251 8.940±0.211*

2.5RT-PCR法檢測不同劑量CA對A549細胞Bcl-2、BaxmRNA表達的影響

與對照組比較，100μg/mL的CA組Bcl-2mRNA表達減少，Bax mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其余劑量CA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4　不同劑量CA對A5 4 9細胞Bc l-2、Ba xm RNA表達的影響（±s）

表4　不同劑量CA對A5 4 9細胞Bc l-2、Ba xm RNA表達的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；CA：巴豆生物堿

組別　　劑量（μg/mL）　Bcl-2mRNA　BaxmRNA對照組CA組0 10 100 4.243±0.731 4.152±0.671 2.812±0.342*3.417±0.461 4.215±0.422 6.881±0.611*

3　討論

肺癌在中醫(yī)古代文獻中屬于肺疾、肺癰。肺癌的主要發(fā)病機制是正氣不足和邪氣入侵，其次為痰瘀。若正氣不足和陰陽失衡將會引起病原體火癌癥毒素入人的肺部[1]。肺功能差將會導(dǎo)致肺氣阻塞、彌散損傷和彌散功能下降，血流停滯，干擾液體分布。體液累積導(dǎo)致的痰液凝固，從而導(dǎo)致氣血停滯和血瘀。氣滯血瘀和痰液、毒素積累逐漸導(dǎo)致肺功能損傷[2]。肺癌是一種全身性疾病。肺虛通常表現(xiàn)為氣虛、陰虛和氣血不足。

當西醫(yī)治療不能提供任何其他的治療方案時，中醫(yī)藥常作為緩解終末期腫瘤癥狀輔助治療手段[3]。然而，中醫(yī)藥能在腫瘤的整個過程中發(fā)揮重要的預(yù)防和治療作用。眾多研究資料表明，天然植物中存在具有治療價值的抗癌成分[4]，中藥復(fù)方阿膠漿可顯著提高小鼠在化療和放療后的造血功能[5]。八珍湯能降低惡性卵巢瘤患者接受化療后的胃腸道反應(yīng)、白細胞減少、腹膜炎等和肝腎功能的發(fā)生率[6]。四種中草藥植物（白花蛇舌草、黨參、地黃、黃芪）影響CYP3A4的活性和表達，其能夠有助于抗癌藥物的代謝[7]。臨床上，中藥可以提高放療患者的生存率并改善生活質(zhì)量，并能減少放療的毒性，如放射性炎癥、白細胞缺陷和免疫功能紊亂。近年來，中醫(yī)藥一直是一個公認有效的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)腫瘤患者的非特異性免疫功能，緩解化療或放療不良反應(yīng)[8]。一些中藥制劑，如華蟾素注射液、艾迪注射液及參芪扶正膠囊早已被證明作為輔助支持治療腫瘤具有良好的作用，其可以減弱放化療帶來的毒副作用，同時提高療效[9]。因此，中醫(yī)與現(xiàn)代相結(jié)合藥物化療和放療等每一個階段的治療可以明顯減輕臨床癥狀，改善生活質(zhì)量，延長預(yù)期壽命[10]。這種治療模式不僅較單獨使用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有顯著優(yōu)勢，也是多學(xué)科綜合療法的趨勢[11]。最近的研究基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，應(yīng)用中西醫(yī)綜合治療放化療引起的毒副作用。如何從天然植物中特別是傳統(tǒng)中藥中尋找和篩選出具有預(yù)防和治療腫瘤的活性藥物，已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點。

巴豆是一種流傳于民間，用于抗癌的中草藥偏方，為大戟科植物巴豆的干燥成熟種子?？缮谩⒊唇褂没蛑扑?。主產(chǎn)于南方地區(qū)如四川、廣東、云南等地。全世界共有800多種，廣泛分布于熱帶及亞熱帶等地區(qū)。其性味辛、熱，有大毒。入胃、大腸、肺經(jīng)。具有逐水退腫、瀉下寒積、祛痰、蝕瘡等多種功效。臨床常用于便秘腹痛，體質(zhì)壯實的水腫以及氣急喘促、痰壅咽喉和瘡膿熟而未破等證。該屬植物的主要成分包括巴豆油、巴豆樹脂、生物堿、毒性蛋白、巴豆苷等，民間早已應(yīng)用巴豆的提取物治療惡性腫瘤，其提取物對胃癌、肝癌及甲狀腺癌等多種腫瘤均具有治療作用[12-14]，其能緩解晚期胃癌患者的癥狀，減慢病程的進展，減少轉(zhuǎn)移。

CA抗癌機制如下：①CA對膜系統(tǒng)分子動力學(xué)影響；②誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[15-16]；③誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、逆轉(zhuǎn)[17]；④改變細胞胞漿結(jié)構(gòu)，破壞癌細胞微管[18-20]。本研究結(jié)果顯示，10、50、100μg/mL的CA均能抑制A549細胞增殖，其抑制率與作用濃度相關(guān)；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，不同劑量CA作用A549細胞24 h后，只有100μg/mL的CA可引起細胞凋亡，其余劑量未見凋亡，多為壞死細胞；100μg/mL的CA組的細胞凋亡率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ELISA結(jié)果提示，不同劑量（0、10、100μg/mL）CA作用A549細胞24 h后，與對照組比較，100μg/mL 的CA組促凋亡蛋白Bax表達增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余劑量CA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示，100μg/mL的CA組BaxmRNA表達增加，Bcl-2mRNA表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余劑量CA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；由結(jié)果推測CA能抑制A549細胞的生長并促進其凋亡，其發(fā)生與Bax蛋白及基因的表達上調(diào)和Bcl-2蛋白及基因的表達下調(diào)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CA能抑制肺腺癌（A549細胞）的生長并促進其凋亡，其發(fā)生與Bax蛋白及基因的表達上調(diào)和Bcl-2蛋白及基因的表達下調(diào)有關(guān)。CA抗肺癌的作用機制可能主要通過Bax/Bcl-2途徑促進腫瘤細胞凋亡，從而達到治療作用。那么CA作為一種中藥，可以治療肺癌，同時提示可能通過針對作用于Bcl-2家族蛋白，Bax/Bcl-2途徑作為靶向途徑，起到治療作用，為臨床治療肺癌提供了一種新的臨床思路。

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Influence and mechanism study of crotonic alkaloids on apoptosis of lung adenocarcinoma cell

WU Xiao LIU Fengjuan WANG Pengfei ZHANG Chunling
Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Shandong Province, Qingdao 266042,China

[Abstract]Objective To confer themechanism of action through researching the effect of the croton alkaloids(CA)on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma cells(A549).M ethods The A549 cells were exposed into CA at various doses(0,10,50,100μg/mL)for 24 h.Themorphology and growth feature of the A549 cellswere observed by the phase contrastmicroscope.The cell growth activity was detected through the MTTmethod.The cell apoptosis rate was detected by the flow cytometry instrument.The expression of gene Bcl-2 and Bax were detected through the ELISA and RT-PCR methods.Results The doses of 10,50,100μg/mL could inhibit the A549 cells proliferation,the inhibition ratio was correlated with concentration.Different doses CA on A549 cells after 24 h,the result of flow cytometry test showed that only CA group(100μg/mL)could induce cell apoptosis,the other dose was not apoptosis.The apoptosis rate of CA group(100μg/mL)was(45.940±0.031)%,the apoptosis rate of control group was(3.450±0.012)%,the difference between two groupswas significant(P＜0.05).Different doses of CA on A549 cells after 24 h,the result of ELISA showed that pro-apoptotic protein Bax of CA group(100μg/mL)was 8.940±0.211,express increased than that of control group(4.450±0.131);suppression of apoptosis protein Bcl-2 of CA group(100μg/mL)was 4.860±0.132,express decreased than that of control group(7.390±0.181),the differences between two groups were significant(P＜0.05).RT-PCR showed that Bax mRNA of CA group(100μg/mL)was 6.881±0.611,express increased than that of control group(3.417±0.461);Bcl-2 mRNA of CA group(100μg/mL)was 2.812±0.342,express decreased than that of control group(4.243±0.731),the differences between two groupswere significant(P＜0.05).Conclusion CA can inhibit the A549 cells growth and promote its apoptosis which through up-regulated the Bax gene and down-regulated the Bcl-2 gene.CA may through regulate the Bax/Bcl-2 gene induced apoptosis,which may provide new approaches for clinical treatment of lung cancer.

[Key words]Crotonic alkaloids;Lung adenocarcinoma;Apoptosis;Mechanism of action

收稿日期：（2015-07-20本文編輯：李亞聰）

[通訊作者]張春玲（1966.5-），女，主任醫(yī)師；研究方向：肺癌，哮喘，危重癥醫(yī)學(xué)。

[作者簡介]武曉（1980.12-），男，碩士；研究方向：肺癌，危重癥醫(yī)學(xué)。

[中圖分類號]R734.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0017-04