娜仁滿都拉, 白梅榮, 桂 榮, 烏日漢, 巴根那(內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院,內(nèi)蒙古通遼028000)
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紅花混懸液抗D-氨基半乳糖致大鼠肝細胞凋亡的機理研究
娜仁滿都拉, 白梅榮*, 桂 榮, 烏日漢, 巴根那
(內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院,內(nèi)蒙古通遼028000)
摘要:目的 初步探討紅花混懸液對D-氨基半乳糖(D-Ga1N)誘導的大鼠急性肝損傷的保護作用機理。方法 以D-Ga1N誘導建立大鼠急性肝損傷模型,觀察紅花混懸液對血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、肝細胞凋亡及肝組織病理作用變化。結果 紅花混懸液明顯降低急性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性,提高血清和肝組織GSH-Px含有量,降低細胞凋亡程度,有效減輕D-Ga1N所致的肝組織病理改變。結論 抑制肝細胞凋亡是紅花抗急性肝損傷的作用機制之一。
關鍵詞:紅花混懸液;D-氨基半乳糖;大鼠;細胞凋亡;肝損傷
紅花是菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花,是蒙醫(yī)臨床常用的藥材之一。在傳統(tǒng)蒙藥學理論指導下的紅花被譽為“肝臟之好”,在保肝作用的常用蒙藥復方古日古木-13、古日古木-7、額力根湯等十幾個蒙藥復方的配伍組成中扮演著“君藥”作用[1]。紅花被《中華本草·蒙藥卷》(2004年版)收載,性涼、味微苦、具有重、鈍、柔、和、固等性能;具有涼血、鎖脈、調(diào)經(jīng)、清肝、強身、止痛、消腫作用等功效。主要用于肝熱,月經(jīng)不調(diào),嘔血,鼻衄,外傷出血,血熱疼痛,心熱,血熱等病癥[2]。本實驗以建立大鼠D-氨基半乳糖(D-Ga1N)急性肝損傷模型,觀察紅花對血清和肝組織谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)含有量變化及防止急性肝損傷細胞凋亡的作用,初步探討其紅花混懸液抗急性損傷的作用機理。
1.1 動物 SD種雄性大鼠,體質(zhì)量為(200±10)g,由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,SCKK(吉)-2011-0004。
1.2 藥品與試劑 紅花由內(nèi)蒙古民族大學提供,護肝片(廣東康爾丹制藥有限公司,批號Z20054567);D-Ga1N購自北京拜迪生物有限公司;Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自國藥集團化學試劑有限公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(G0033)、PBS(ST476)、無毒環(huán)保HE染液(D006)均購自南京建成生物工程研究所。無水乙醇(天津市德恩化學試劑有限公司);二甲苯(天津市天力化學試劑有限公司)。
1.3 儀器 羅氏全自動生化分析儀(上海同舸醫(yī)療器械有限公司);TGL-20B型離心機(上海安亭科學儀器廠);BD Ca1ibur型流式細胞儀(北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司);CX31型顯微鏡成像系統(tǒng)(北京瑞科中儀科技有限公司);KD1508型輪轉(zhuǎn)式切片機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)。
2.1 紅花混懸液制備方法 紅花混懸液小劑量的制備方法為把人的每天口服劑量5 g(設人標準體質(zhì)量為70 kg)按體表面積的計算方法換算為大鼠的劑量0.43 g/kg。即稱取0.43 g紅花粉末,加0.5% CMC-Na溶液20 mL(每100 g體質(zhì)量大鼠灌胃2 mL溶液),配制成為0.021 5g/mL溶液;紅花混懸液大劑量的制備方法為根據(jù)預實驗結果,設大劑量為小劑量的9倍。即稱取3.87 g紅花粉末,加0.5% CMC-Na溶液20 mL,配制成為0.193 5 g/mL溶液。
2.2 實驗動物分組及處理 將50只大鼠按體質(zhì)量隨機分為5個組,即正常對照組、模型對照組、紅花混懸液大劑量組(3.87 g/kg)、紅花混懸液小劑量組(0.43 g/kg)、護肝片陽性對照組(0.36 mg/kg),每組10只。從實驗第1天開始,各給藥組灌胃相應的藥物溶液,每日灌胃1次,連續(xù)灌胃21 d,正常對照組和模型對照組灌胃給予等量CMC-Na溶液。末次給藥0.5 h后,除了正常對照組外,其余各組按照300 mg/kg劑量腹腔注射D-Ga1N生理鹽水溶液,建立急性肝損傷模型。禁食不禁水的條件下,20 h后用10%的水合氯醛麻醉動物,從腹主動脈取血,3 500 r/mim離心10 min分離血清,測定AST、ALT和GSH-Px值,取部分肝組織在10%甲醛中固定,按HE染色常規(guī)要求進行修塊、脫水、浸蠟、包埋,待觀察各組病理組織學變化;取部分肝組織-80℃凍存,待測定肝組織GSH-Px值,并觀察肝細胞凋亡變化。
2.3 流式細胞儀分析 取大鼠肝組織,分離肝細胞,用PBS洗滌細胞1次(1 000 r/min離心5 min)收集并調(diào)整細胞密度為1×106/mL的混懸液;Fa1con試管中加入100 μL細胞混懸液;依次加入500 μL結合液、5 μL Annexin V及5 μL核酸染料;輕輕混勻,室溫(20~25℃)避光處放置10 min。流式細胞儀檢測凋亡率。
2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,進行單因素方差分析及t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
3.1 紅花混懸液對血清ALT,AST水平的影響 與正常對照組比較,模型對照組大鼠血清AST和ALT活性均顯著升高,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明急性肝損傷模型復制成功。與模型對照組比較,陽性對照組大鼠血清AST和ALT活性均顯著降低,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較,紅花混懸液大劑量組和小劑量組大鼠血清AST和ALT活性均顯著降低,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見表1。
表1 紅花混懸液對大鼠血清ALT和AST水平的影響(±s,n=8)
表1 紅花混懸液對大鼠血清ALT和AST水平的影響(±s,n=8)
注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1)正常對照組 35.91±10.09** 94.31±15.00**模型對照組 627.51±282.81 622.43±257.12陽性對照組 295.17±85.52* 315.90±84.63*紅花混懸液小劑量組 292.46±161.53* 333.05±151.51*紅花混懸液大劑量組 285.52±155.86* 381.82±174.31*
3.2 紅花混懸液對血清和肝組織GSH-Px水平的影響 與正常對照組比較,模型對照組肝組織和血清GSH-Px活性明顯降低,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較,紅花混懸液小、大劑量組肝組織和血清GSHPx活性明顯升高,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)與模型對照組比較,陽性對照組血清GSH-Px明顯升高,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但肝組織GSH-Px有升高趨勢,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表2。
表2 紅花混懸液在小鼠血清和肝組織中GSH-Px的含有量變化(±s,n=8)
表2 紅花混懸液在小鼠血清和肝組織中GSH-Px的含有量變化(±s,n=8)
注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別 肝組織GSH-Px/ (U·mg-1)血清GSH-Px/ (U·mg-1)正常對照組 411.13±89.84* 4 586.40±1 839.39*模型對照組 339.43±84.50 2 286.00±1 186.89陽性對照組 403.24±114.52 3 834.51±1 808.48*紅花混懸液小劑量組 562.71±165.36*3 611.52±238.88*紅花混懸液大劑量組 582.14±112.78**4 928.91±1 212.73**
3.3 紅花混懸液對D-Ga1N所致大鼠急性肝損傷組織病理變化的影響 正常對照組肝小葉結構清晰,細胞索排列整齊,肝竇正常,肝細胞無明顯病變,核結構清晰。模型對照組肝小葉處肝細胞明顯壞死或變性,損傷較重的肝細胞壞死嚴重,在壞死細胞周圍見到炎性細胞浸潤,在肝小葉間及肝竇處見到腫脹血管。紅花大劑量肝小葉結構較完整,肝總管及肝竇處血管腫脹現(xiàn)象明顯緩解且炎細胞浸潤減少,見少量壞死肝細胞;紅花小劑量組肝小葉結構恢復不全面,肝小葉及肝總管周圍仍見到變性肝細胞、炎細胞及少量的壞死和腫脹肝細胞。陽性對照組肝小葉結構趨于正常,肝總管及肝竇處可見少量的腫脹血管及炎細胞,可見到新生雙核肝細胞。見圖1。
圖1 光學顯微鏡下檢測各組大鼠肝組織病理變化(HE染色,×100)
3.4 紅花混懸液對肝細胞凋亡的影響 與正常對照組比較,模型對照組的肝細胞凋亡數(shù)目顯著增多,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較,陽性對照組和小、大劑量紅花混懸液組細胞凋亡數(shù)目顯著降低,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示紅花混懸液具有抑制肝細胞凋亡作用。結果見表3、圖2。
表3 紅花混懸液對D-GalN誘導急性肝損傷細胞凋亡的影響(±s,n=8)
表3 紅花混懸液對D-GalN誘導急性肝損傷細胞凋亡的影響(±s,n=8)
注:與模型對照組比較,**P<0.01
組別 動物數(shù)/只 細胞凋亡指數(shù)正常對照組 8 0.22±0.03**模型對照組 8 3.03±0.94陽性對照組 8 0.18±0.02**紅花混懸液小劑量組 8 0.19±0.04**紅花混懸液大劑量組 8 0.17±0.05**
蒙醫(yī)學是以三根學說(赫依、希拉、巴達干,近似中醫(yī)的氣、熱、寒)解釋機體生理和病理現(xiàn)象,而蒙藥是蒙醫(yī)防治疾病的有力武器。大部分蒙藥材來源與中藥材相同。蒙藥主要以蒙醫(yī)基礎理論和蒙藥藥性理論為指導,在加工制作和用法上具備了蒙藥特色。即蒙藥以蒙藥的十七種效能來補偏救弊,調(diào)整機體內(nèi)部的“三根”的偏盛和偏衰,可達到防病、治病和健身的目的。紅花雖然是中蒙藥通用的藥材,但在蒙藥藥性理論和蒙醫(yī)基礎理論的指導下,在肝臟疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。因而被譽為“肝臟之好”[3]的美名。大量的臨床資料也均證實,紅花為君藥的蒙藥復方制劑是肝臟的急性和慢性疾病的首選藥物。
圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況
肝細胞的異常凋亡在急、慢性肝損傷的發(fā)病機制中起著重要作用[4-5],從肝細胞異常凋亡的角度觀察保肝藥物的作用及機制具有重要意義。在某些類型肝病中,肝細胞凋亡實際上引起了炎癥和壞死,肝臟中的嗜中性白細胞炎癥完全依賴于細胞凋亡的這一始發(fā)事件。因此阻止細胞凋亡可能是一個新的控制炎癥的治療途徑。
本實驗研究表明,紅花混懸液大、小劑量組均明顯抑制肝細胞凋亡數(shù)。說明抑制凋亡是紅花抗肝損傷、保護肝細胞的作用機理之一。本實驗可為紅花保肝作用的進一步系統(tǒng)研究提供科學依據(jù)。
紅花性涼、味微苦、具有重、鈍、柔、和、固等性能;具有涼血、清肝等功效。蒙醫(yī)臨床資料顯示,在蒙醫(yī)理論指導下的紅花可用于防治多種因素導致的肝臟疾病并效果較突出。
肝細胞的損傷是一種由多因素介導的復雜的生物學過程,損傷的結果是肝細胞可能發(fā)生凋亡或壞死[6-8]。細胞凋亡是細胞死亡的形式之一,亦稱程序性死亡[9],由于其特殊的生物學意義而逐步成為一個新的研究熱點。近年來的研究表明,細胞凋亡在肝細胞損傷中發(fā)揮著重要的作用。關于肝細胞死亡機制的研究將對肝臟疾病的預防和治療起重要的作用[10]。D-氨基半乳糖模型機制可耗竭肝細胞內(nèi)三磷酸尿嘧啶核苷,抑制INA合成[11-13]而達到肝細胞凋亡,近幾年的研究認為D-氨基半乳糖模型機制還與肝細胞膜的
完整性、過氧化損傷、谷胱甘肽耗竭[14]及腫瘤壞死因子[15]有關。機體存在阻止過氧化作用的防御體系,GSH-Px是細胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用的酶性保護系統(tǒng)的主要成分,可催化過氧化脂質(zhì)(LPO)分解生成相應的醇,防止LPO均裂和引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的鏈式支鏈反應,減少LPO的生成,從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。本實驗結果表明,造模劑D-G1aN可致大鼠肝細胞大量凋亡、同時顯著降低其GSH-Px水平。紅花混懸液大小劑量組均明顯抑制肝細胞凋亡,并明顯提高了血清和肝組織GSH-Px的含有量。因此,認為D-G1aN致急性肝損傷的機制可能通過對肝細胞的過氧化損傷而引發(fā)了肝細胞的大量凋亡。而通過恢復GSH-Px抗氧化功能其保護肝細胞膜結構和功能完整性為紅花抑制肝細胞凋亡而起到保肝作用的目的。
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*通信作者:白梅榮(1972—),女(蒙古族),教授,從事蒙藥藥理毒理學研究。Te1:15804758404
作者簡介:娜仁滿都拉(1990—),女(蒙古族),從事蒙藥物質(zhì)基礎研究。E-mai1:15247533325@163.com
基金項目:通遼市科技合作項目(SXYB2012030);內(nèi)蒙古民族大學校級研究生資助項目(NMDSS1436)
收稿日期:2015-03-17
doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.037
中圖分類號:I285.5
文獻標志碼:B
文章編號:1001-1528(2016)03-0655-04