益腎活血方聯(lián)合纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎組織RhoA/ROCK1表達的影響*

宋純東，張綠鳳，秦林芳，張相安△

(1．河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，鄭州 450008;2．河南中醫(yī)學院，鄭州 450000)

益腎活血方聯(lián)合纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎組織RhoA/ROCK1表達的影響*

宋純東1，張綠鳳1，秦林芳2，張相安1△

(1．河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，鄭州 450008;2．河南中醫(yī)學院，鄭州 450000)

目的:探討益腎活血方聯(lián)合纈沙坦對糖尿病腎病(DN)大鼠腎組織Rho/Rho激酶表達的影響。方法:SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、纈沙坦組、高劑量中藥加纈沙坦組和低劑量中藥加纈沙坦組。成模后空白組和模型組灌服生理鹽水，纈沙坦組給予纈沙坦，高、低劑量中藥加纈沙坦組分別按成人用藥量的12.5倍、6.25倍給予中藥，同時給予纈沙坦。8周后檢測24 h尿蛋白、血清白蛋白(ALB)等指標，過碘酸-雪夫氏(PAS)染色觀察腎臟病理，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測腎組織RhoA、ROCK1的濃度值。結(jié)果:中藥干預后尿蛋白明顯減少，ALB升高，RhoA、ROCK1表達下調(diào)，腎臟病理改善。結(jié)論:益腎活血方可能通過影響DN大鼠腎RhoA、ROCK1的表達而發(fā)揮上述治療作用。

糖尿病腎病;益腎活血方;RhoA/ROCK1;足細胞

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并發(fā)癥，其發(fā)病機制復雜。近年來，足細胞損傷的機制備受關(guān)注，尿蛋白是DN發(fā)生發(fā)展最主要的危險因素之一，足細胞是蛋白尿發(fā)生發(fā)展的主要參與者。RhoA(Ras homolog gene family，member A)是小G蛋白Rho家族(RhoA，RhoB，RhoC)的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，1型DM和2型DM腎臟皮質(zhì)中RhoA活性增高，影響足細胞突起的形成，RhoA通過激活下游的關(guān)鍵靶效應分子ROCK(Rho-associated kinases)，調(diào)節(jié)DN腎小球系膜細胞的多種生物學行為，使用此信號通路的選擇性抑制劑，可明顯抑制DN的發(fā)展［1］。既往研究發(fā)現(xiàn)，中藥“益腎活血方”可能通過影響TGF-β1/p38MAPK［2］、Smad2［3］等通路而發(fā)揮降低尿蛋白的作用。本研究旨在觀察該方對DN大鼠腎組織RhoA/ROCK1表達的影響，為臨床應用進一步提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑

益腎活血方組成:菟絲子30 g，生黃芪30 g，生地黃15 g，積雪草30 g，水蛭6 g，大黃6 g，均由四川新綠色藥業(yè)科技有限公司提供并加工為顆粒劑。纈沙坦(代文)膠囊80 mg，由北京諾華制藥公司提供(批 號 國藥準字 H20040217);鏈 脲佐 菌素(streptozocin，STZ)購于美國Sigma公司;ELISA檢測試劑盒由武漢博士德公司提供。

1.2 動物實驗及分組

清潔級SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量(200±20 g)，河南省實驗動物中心提供(許可證號SCXK(豫) 2010-0002)。按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、高劑量中藥加纈沙坦組、低劑量中藥加纈沙坦組、纈沙坦組。

1.3 造模

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，應用STZ 65 mg/kg一次性腹腔注射，3 d后連續(xù)測空腹血糖≥16.7 mmol/ L，為DM造模成功。此后正常喂養(yǎng)，3周后24 h尿蛋白定量≥30 mg者確定DN造模成功［4］。

1.4 給藥方法與劑量

空白組和模型組灌服生理鹽水1 ml/100 g，每日1次;纈沙坦組按成人纈沙坦(成人體質(zhì)量按60 kg計算)常規(guī)用藥量80 mg/(kg獉d)計算，折算出大鼠用藥量為1.67mg/(200 g獉d);低劑量中藥加纈沙坦組同時給予纈沙坦(劑量同纈沙坦組)和中藥，中藥為成人(成人體質(zhì)量按60 kg計算)用量的6.25倍，大鼠灌服中藥量約2.45 g/(200 g獉d)生藥量的濃縮藥液，中藥顆粒劑配制成1 g/ml溶液;高劑量中藥加纈沙坦組同時給予纈沙坦(劑量同纈沙坦組)和中藥，中藥為低劑量中藥加纈沙坦組用量的2倍，大鼠灌服中藥量約為4.9 g/(200 g獉d)，中藥顆粒劑配制成2 g/ml的溶液(每5 d稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量)。

1.5 觀察指標

灌藥8周后代謝籠留取24 h尿液，雙縮脲法測定24 h尿蛋白定量;第2天麻醉后股動脈取血3 ml，全自動生化分析儀檢測Scr(serum creatinine血肌酐)、BUN(blood urea nitrogen血尿素氮)、ALB (Serum albumin血清白蛋白)、ALT(aspartate aminotransferase天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶);麻醉后處死大鼠，迅速分離左側(cè)腎臟去除被膜，生理鹽水反復沖洗后稱重。蘇木素-伊紅(HE)染色，過碘酸-雪夫氏(PAS)染色，中性樹膠封固，光鏡觀察腎臟組織病理形態(tài)改變。酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測RhoA、ROCK1表達值，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，應用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生化檢測

表1顯示，24 h尿蛋白定量:治療各組較模型組均下降(P＜0.01)，高、低劑量中藥加纈沙坦組與纈沙坦組比較下降明顯(P＜0.01)，提示中藥干預后有增效作用;高劑量中藥加纈沙坦組較低劑量中藥加纈沙坦組明顯下降(P＜0.05)，提示中藥療效與劑量呈正相關(guān);ALB:高、低劑量中藥加纈沙坦組與纈沙坦組均較模型組升高(P＜0.01)，高、低劑量中藥加纈沙坦組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示中藥療效與劑量無關(guān);ALT、Scr:各組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 24 h尿蛋白、ALB、ALT、Scr的比較(±s)

表1 24 h尿蛋白、ALB、ALT、Scr的比較(±s)

注:與空白組比較:ΔΔP＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01;與纈沙坦組比較:##P＜0.01;與低劑量中藥加纈沙坦組比較:$P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 24 h尿蛋白(g/24 h) ALB(g/L) ALT(U/L) Scr(umol/L)空白組 11 0.0371±0.0166 24.10±1.75 87.36±16.43 41.79± 4.80模型組 10 0.1818±0.0372ΔΔ 16.99±0.69ΔΔ 105.10±29.24 43.91±10.81纈 沙 坦 組 9 0.0834±0.0167＊＊ 18.28±0.90＊＊ 86.00±31.62 42.18±11.00低劑量中藥加纈沙坦組 8 0.0802±0.0121## 20.81±0.99## 103.38±35.47 38.86± 7.41高劑量中藥加纈沙坦組 8 0.0553±0.0075##$ 21.80±1.16##85.00±30.93 39.46± 3.98

2.2 病理組織學變化

肉眼觀察空白組大鼠的腎臟形態(tài)正常，呈暗紅色，表面光滑，包膜無黏連;模型組大鼠的腎臟體積明顯增大，表面及皮質(zhì)略呈灰白色，髓質(zhì)顏色加深，包膜有黏連。PAS染色結(jié)果如圖1所示，纈沙坦組與高、低劑量中藥加纈沙坦組病理改變程度較模型組輕，以高劑量中藥加纈沙坦組明顯。

圖1 各組大鼠腎組織病理切片PAS染色結(jié)果(400)

2.3 大鼠腎組織RhoA、ROCK1的表達量

表2顯示，模型組較空白組明顯升高(P＜0.01);高、低劑量中藥加纈沙坦組與纈沙坦組均較模型組下降(P＜0.01)，高、低劑量中藥加纈沙坦組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明中藥干預后明顯降低RhoA、ROCK1的表達，與劑量無關(guān)。

表2 大鼠腎組織RhoA、ROCK1表達濃度值比較(±s)

表2 大鼠腎組織RhoA、ROCK1表達濃度值比較(±s)

注:與空白組比較:ΔΔP＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.01;與纈沙坦組比較:##P＜0.01

組別 鼠數(shù) RhoA(ng/ml) ROCK1(ng/ml)空 白 組11 15.73±2.16 32.37±3.82模 型 組 10 36.75±2.54ΔΔ 86.52±7.22ΔΔ纈 沙 坦 組 9 26.16±1.17＊＊ 50.54±3.84＊＊低劑量中藥加纈沙坦組 8 23.95±1.12## 40.56±2.27##高劑量中藥加纈沙坦組 8 19.82±1.99## 37.62±2.30##

3 討論

足細胞是DN蛋白尿形成和發(fā)展的主要影響因素。足細胞和足細胞伸出的足突及足突與足突之間的裂孔膜是腎小球濾過屏障的最外層，足細胞丟失必然伴隨蛋白尿。持續(xù)性調(diào)節(jié)足細胞的細胞骨架，是維持腎小球濾過屏障功能的關(guān)鍵。RhoA/ROCK信號通路對足細胞突起形成及微管和肌動蛋白絲的重組有重要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，Rho蛋白和完整的細胞骨架對成纖維細胞表達TGF-β、腎系膜細胞起決定性作用，高糖和糖基化終末產(chǎn)物能夠破壞DN腎組織足細胞骨架，ROCK通過控制細胞收縮和細胞骨架肌動蛋白的排列調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷徙、增殖和凋亡［6］。RhoA在細胞膜、細胞質(zhì)中都有表達，ROCK1在心臟、肺、腎臟的表達水平較高。因此，RhoA、ROCK1可以作為腎小球足細胞的標記。

DN病程遷延，多臟腑受損，并挾有瘀血、水濕、痰濁等實邪，基本病機為正虛邪實。益腎活血方依據(jù)中醫(yī)“久病必虛”、“久病必瘀”、“久病入絡”的理論，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，由生黃芪、生地黃、菟絲子、積雪草、大黃、水蛭組成。黃芪益氣，生地黃養(yǎng)陰，菟絲子補腎，積雪草、大黃、水蛭活血化瘀，諸藥成方共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之效，寒溫并用，補瀉兼施，氣行則血行，標本兼顧，而諸癥自愈。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、生地黃有改善腎功能等作用，菟絲子有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，積雪草、大黃能夠減少尿蛋白，水蛭有改善腎臟微循環(huán)、防止腎小球硬化等作用。

DN的主要病理特征是腎小球體積增大、基底膜增厚、系膜區(qū)增寬、腎小管肥大與分層等［7］。本研究結(jié)果顯示，模型組病理改變符合DN早期的病理變化，治療各組大鼠腎臟病理改變較輕，尤以高劑量中藥組明顯，說明益腎活血方有改善DN腎臟病理的作用;中藥組ALB明顯升高，尿蛋白明顯降低，腎組織 RhoA、ROCK1的表達量明顯減少;各組ALT、Scr、BUN比較差異無統(tǒng)計學意義，說明益腎活血方有保護DN大鼠足細胞、減少尿蛋白、升高ALB的作用，且具安全性。綜上所述，DN大鼠腎組織RhoA、ROCK1的表達與尿蛋白呈正相關(guān)，中藥組明顯下調(diào)RhoA、ROCK1的表達，此可能是益腎活血方聯(lián)合纈沙坦治療DN的有效機制之一。

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R285．5

B

1006-3250(2016) 02-0198-02

2015-06-22

河南省科技攻關(guān)項目(142102310284);河南省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)學科帶頭人培養(yǎng)項目(2013ZY02065);河南省教育廳資助項目(2010B360012)

宋純東(1967-)，男，河南民權(quán)人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，從事腎小球疾病的中西醫(yī)診治機制研究。

△通訊作者:張相安，男，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，Tel:18137890899，E-mail:zxa2105@163．com。