槲皮素對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖及TGF-β1/ Smads信號(hào)通路的影響*

吳素珍，李加林，陳水親△

(1．贛南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西贛州 341000; 2．贛南醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，江西贛州 341000)

槲皮素對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖及TGF-β1/ Smads信號(hào)通路的影響*

吳素珍1，李加林2，陳水親1△

(1．贛南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西贛州 341000; 2．贛南醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，江西贛州 341000)

目的:研究槲皮素在高糖環(huán)境下對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖槲皮素對(duì)照組及TGF-β1表達(dá)的影響。方法:將體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞分為正常組、高糖組、槲皮素對(duì)照組及槲皮素低、中、高劑量組6組，MTT法檢測槲皮素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響，Western-blot法檢測腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1、P-Smad2、FN的表達(dá)。結(jié)果:槲皮素能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖及TGF-β1、P-Smad2、FN表達(dá)。結(jié)論:槲皮素可通過降低TGF-β1水平抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖，并通過抑制Smad2磷酸化部分影響TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活，降低FN的表達(dá)，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

槲皮素;腎小球系膜細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;纖連蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的主要病理學(xué)表現(xiàn)為腎臟體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生、肥大及系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，特別是纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)進(jìn)行性積聚，并逐步發(fā)展為腎小球硬化。系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞的一種，在維持腎小球的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用，同時(shí)不可避免地參與DN的發(fā)病過程［1］。大量研究證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在糖尿病腎病中發(fā)揮著重要作用，是引起腎小球硬化的主要細(xì)胞因子，因此TGF-β1及其信號(hào)傳導(dǎo)通路成為研究各種原因所致腎臟病變的重要靶點(diǎn)［2］。槲皮素及其衍生物是具有多種活性的黃酮類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗氧化、抑制腫瘤、抗炎、降血脂等藥理作用。有研究認(rèn)為，槲皮素對(duì)糖尿病腎病(DN)具有保護(hù)作用，可延緩糖尿病患者腎小球硬化的進(jìn)程，減輕腎小球肥大程度及蛋白尿的程度［3］。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞，研究槲皮素對(duì)高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞增殖和TGF-β1表達(dá)的影響，以及槲皮素對(duì) TGF-β1/ Smads信號(hào)通路的影響，探討槲皮素抗糖尿病腎病作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素由贛南醫(yī)學(xué)院天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(純度大于95%)。胎牛血清(GIBCO公司);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司);噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司); CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司);MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司);小鼠抗大鼠β-Actin抗體(1∶1000，Santa Cruz)、小鼠抗大鼠TGF-β1抗體 (1∶1000，Santa Cruz);兔抗大鼠pSmad2抗體(1∶1000，Cell signaling)、小鼠抗大鼠FN抗體(1∶10000，BD Biosciences);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶10000，Santa Cruz)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠 IgG(1∶10000，Santa Cruz);顯影液、定影液(谷歌生物科技有限公司)，ECL發(fā)光液(Thermo公司)，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SD大鼠(購于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK鄂2008-0004)腎小球原代系膜細(xì)胞置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，2～3 d換1次液，細(xì)胞生長迅速，3～4 d傳1次代。本實(shí)驗(yàn)采用5～15代系膜細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測槲皮素對(duì)高糖刺激系膜細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期的系膜細(xì)胞配成濃度1.0×105/mL的細(xì)胞懸液，以每孔接種細(xì)胞懸液180 μL接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)分為正常組(NC組，5.5 mmol/ L葡萄糖)、槲皮素對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L槲皮素)、高糖組(HG組，30 mmol/L葡萄糖)、槲皮素低劑量組(LQ組，30 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L槲皮素)、槲皮素中劑量組(MQ組，50 mmol/L葡萄糖+50 μmol/l槲皮素)和槲皮素高劑量組(HQ組，100 mmol/l葡萄糖+100 μmol/L槲皮素)6組。每組設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，再培養(yǎng)4 h。小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，待完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定各孔吸光度。

1.2.3 Western Blot方法檢測細(xì)胞中TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的腎小球系膜細(xì)胞，用20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度1.0×105/mL，每孔2 mL，接種于直徑6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞80%融合時(shí)，換無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長同步化，分為正常對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、槲皮素對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖 +50 μmol/L槲皮素)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、槲皮素低劑量組(30 mmol/L葡萄糖+25 μmol/L槲皮素)、槲皮素中劑量組(30 mmol/L葡萄糖 +50 μmol/L槲皮素)，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后于冰上裂解15 min，離心半徑8 cm，12000 r/min，4℃離心10 min收集上清。采用SDS-PAGE分離樣品中的蛋白成分，各泳道蛋白上樣量為50 μg。再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到0.45 μm硝酸纖維素膜(NC膜)上，NC膜用脫脂奶粉進(jìn)行封閉，然后與一抗孵育4℃過夜，TBST洗滌后再與過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗滌，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)檢測免疫印跡信號(hào)，以X-膠片記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用灰度值表示蛋白表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)與對(duì)照組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

表1顯示，高糖組腎小球系膜細(xì)胞的OD值比正常組顯著增大(P＜0.01)，表明高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的增殖。槲皮素不同濃度組系膜細(xì)胞OD值與高糖組比較均有顯著降低 (P＜0.01)，槲皮素中劑量組的系膜細(xì)胞OD值比低劑量組的系膜細(xì)胞OD值顯著降低(P＜0.05)，高劑量組的系膜細(xì)胞OD值比槲皮素中劑量組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，槲皮素可明顯抑制體外高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞的增殖。

表1 槲皮素對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 槲皮素對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.01;與高糖組比較:2)P＜0.01;與槲皮素中劑量組比較:3)P＜0.05

組別 例數(shù) OD值正 常 組60.7200±0.046槲 皮 素 對(duì) 照 組 6 0.7832±0.081高 糖 組 6 1.3433±0.1401)槲皮素低劑量組 6 1.0317±0.1082)3)槲皮素中劑量組 6 0.9067±0.0912)槲皮素高劑量組 6 0.8833±0.0702)

2.2 槲皮素對(duì)高糖環(huán)境下TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達(dá)的影響

表2圖1顯示，與正常組比較，高糖組TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，而槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組系膜細(xì)胞的TGF-β1蛋白和高糖組比較，表達(dá)量顯著減少(P＜0.01)。與正常組比較，高糖組P-Smad2蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)。而槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組系膜細(xì)胞的P-Smad2蛋白和高糖組比較，表達(dá)量顯著減少(P＜0.01)，且隨槲皮素濃度的增加，P-Smad2蛋白的表達(dá)量降低。與正常組比較，高糖組FN蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)。而槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組系膜細(xì)胞的FN蛋白和高糖組比較，表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)。槲皮素對(duì)照組和正常對(duì)照比較，系膜細(xì)胞TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

糖尿病腎病的發(fā)生率在糖尿病病程20年后可達(dá)到30%～40%，其中有5%～10%的患者會(huì)惡化成終末期腎病，只有進(jìn)行血液透析或腎移植才能維持、挽救生命［4］。糖尿病腎病的主要病理特征是腎小球硬化，足細(xì)胞損傷，腎小球系膜細(xì)胞肥大［5-7］，并大量表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extra cellular matrix，ECM)，主要包括膠原蛋白(Collagen)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和層黏連蛋白(laminin，LN)，這些蛋白分泌到系膜細(xì)胞外并沉積在腎小球內(nèi)導(dǎo)致腎小球硬化［8-10］。因此，研究系膜細(xì)胞內(nèi)調(diào)控ECM表達(dá)的信號(hào)通路是防治糖尿病腎臟疾病的核心與焦點(diǎn)。

圖1 槲皮素對(duì)TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達(dá)的影響

表2 槲皮素對(duì)TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響(±s)

表2 槲皮素對(duì)TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.01;與高糖組比較:2)P＜0.01

組別 例數(shù) TGF-β1 P-Smad2 FN正 常 組3 1±0.18 1±0.13 1±0.220槲皮素對(duì)照組 3 1.08±0.21 0.97±0.19 1.18±0.280高 糖 組 3 3.11±0.401) 4.06±0.321) 2.1±0.1801)槲皮素低劑量組 3 0.99±0.152) 2.48±0.212)1.41±0.1702)槲皮素中劑量組 3 1.08±0.172) 2.16±0.202) 1.4±0.1822)

TGF-β/smads信號(hào)通路是TGF-β下游的一個(gè)特別的信號(hào)通路，在糖尿病腎病中被激活，導(dǎo)致胞外基質(zhì) (extracellularmatrix，ECM)如纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)進(jìn)行性積聚，并逐步發(fā)展為腎小球硬化［11］。多數(shù)研究表明，高血糖經(jīng)各種異常代謝途徑產(chǎn)生的產(chǎn)物能誘導(dǎo)TGF-β1蛋白表達(dá)增加，TGF-β1直接促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖、肥大，激活Smad信號(hào)通路，上調(diào)系膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖連蛋白(FN)等表達(dá)，抑制基質(zhì)蛋白降解酶合成，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解，最終導(dǎo)致腎小球細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過量堆積［12］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎小球系膜細(xì)胞經(jīng)30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖明顯，TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達(dá)增加，證實(shí)高糖可能通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路促進(jìn)腎小球硬化。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，它在蔬菜、水果等綠色植物中分布極廣。槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等多種生物活性。近年來研究表明，槲皮素有防治糖尿病腎病的藥理作用［13-14］。徐向進(jìn)等［15］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能明顯抑制糖尿病腎病大鼠TGF-β1的過度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)體外研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素低、中、高3個(gè)劑量組均能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖(P＜0.01)，但槲皮素中劑量組與槲皮素高劑量組之間比較抑制高糖環(huán)境下的系膜細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。因此，我們選擇槲皮素低劑量組和槲皮素中劑量組對(duì)高糖環(huán)境下 TGF-β1、PSmad2、FN蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果提示，槲皮素能抑制高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1蛋白的過度表達(dá)，同時(shí)對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子之一的smad2磷酸化有明顯的抑制作用，部分阻斷TGF-β/Smads信號(hào)通路，進(jìn)而抑制FN的表達(dá)，對(duì)腎臟起保護(hù)作用。槲皮素對(duì)照組對(duì)系膜細(xì)胞的增殖、TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達(dá)和正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。綜上所述，可以推斷槲皮素可能部分通過影響糖尿病腎病腎小球系膜細(xì)胞TGF-β/Smads的信號(hào)通路，最終發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的防治作用。

［1］Geoffroy K，Troncy L，Wiernsperger N，et al．Glomerular proliferation during early stages of diabetic nephropathy is associated with local increase of sphingosine-1-phosphate levels［J］．FEBS Lett，2005，579(5):1249-1254．

［2］Kim YS，Xu ZG，Reddy MA，et al．Novel interactions between TGF-β1 actions and the 12/15-lipoxygenase pathway in mesangial cells［J］．J．Am．Soc．Nephrol，2005，16(2):352-362．

［3］梅小斌，高從容，崔若蘭，等．槲皮素降低腎小球周期素激酶抑制劑p27水平改善糖尿病腎?。跩］．上海醫(yī)學(xué)，2003，26 (4):246-248．

［4］Mason，RM，Wahab，NA．Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy［J］．J．Am．Soc．Nephrol，2003，14: 1358-1373．

［5］Ogawa，S．，et al．，Identification of the stages of diabetic nephropathy at which angiotensin II receptor blockers most effectively suppress albuminuria［J］．Am J Hypertens，2013，26 (9):1064-1069．

［6］Assal，H．S．，et al．，Serum cystatin C and tubular urinary enzymes as biomarkers of renal dysfunction in type 2 diabetes mellitus［J］．Clin Med Insights Endocrinol Diabetes，2013，6: 7-13．

［7］Kim，S．S．，et al．，Urinary cystatin C and tubular proteinuria predict progression of diabetic nephropathy［J］．Diabetes Care，2013，36(3):656-661．

［8］Takamiya，Y．，et al．，Experimental diabetic nephropathy is accelerated in matrix metalloproteinase-2 knockout mice［J］．Nephrol Dial Transplant，2013，28(1):55-62．

［9］Akbar，D．H．，et al．，Comparison between the effect of glibenclamide and captopril on experimentally induced diabetic nephropathy in rats［J］．J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2013，14(2):103-115．

［10］向少偉，黃露，黃仁發(fā)，等．糖腎寶含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14(4):309-312．［11］Isono，M．，et al．，Smad pathway is activated in the diabetic mouse kidney and Smad3 mediates TGF-beta-induced fibronectin in mesangial cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2002，296(5):1356-1365．

［12］Li JH，Huang XR，Zhu HJ，et al．Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix production under high glucose conditions［J］．Kidney Int，2003，63:2010-2019．

［13］Tang Dao-quan，Wei Ya-qin Yin Xiao-xing，et al．In vitro suppression of quercetin on hypertrophy and extracellular matrix accumulation in rat glomerular mesangial cells cultured by high glucose［J］．Fitoterapia，2011，82(6):920-926．

［14］郝惠惠，邵珠民，杜倩，等．槲皮素對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及TGF-β1/CTGF的影響［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32 (13):1012-1016．

［15］徐向進(jìn)，吳玉水，馮修高，等．槲皮素對(duì)糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的影響［J］．中國糖尿病雜志，2001，9(1):44-48．

Effects of Quercetin on the Proliferation of Glomerular Mesangial Cells and the Signal Pathway of TGF-β1/Smads Induced by High Glucose

WU Su-zhen1，LI Jia-lin2，CHEN Shui-qin1△
(1．Teaching and Research Section of biochemistry and Molecular Biology，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China;2．Teaching and Research Section of Natural Pharmaceutical chemistry，Gannan Medical University，Jiangxi，Ganzhou 341000，China)

Objective To investigate the effect of quercetin on the proliferation and expression of TGF-β1 of mesangial cell cultured in high glucose condition．Method:Glomerular mesangial cells were divided into six groups:normal group，quercetin control group，high glucose group，low，medium and high doses of quercetin group．MTT colorimetric method was used to study the influence of quercetin on proliferation of glomerular mesangial cell．Western-blot was used to detect the express of TGF-β1 in glomerular mesangial cell．Result:Quercetin significantly inhibited the proliferation and expression of TGF-β1 of mesangial cell under the stimulation of high glucose．Conclusion:Quercetin could partially block the activation of P-Smad2 signaling pathway in glomerular mesangial cell，inhibit the expression of FN and proliferation of glomerular mesangial cell．

Quercetin;Mesangial cell;Transforming growth factor-β1; Fibronectin

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0195-03

2015-06-05

江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ09322)

吳素珍，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥抗糖尿病腎病的臨床與研究。

△通訊作者:陳水親，Tel:18970786182，E-mail:940479353@ qq．com。