冠心Ⅴ號合劑干預(yù)急性心肌梗死模型大鼠心室重構(gòu)及心肌TLR4 信號通路研究*

左可可，柯 峰，顧 寧

(1．南京市中醫(yī)院，南京 210001;2．南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南京 210001)

冠心Ⅴ號合劑干預(yù)急性心肌梗死模型大鼠心室重構(gòu)及心肌TLR4 信號通路研究*

左可可1，柯 峰1，顧 寧2△

(1．南京市中醫(yī)院，南京 210001;2．南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南京 210001)

目的:觀察冠心Ⅴ號合劑對急性心肌梗死(AMI)模型大鼠心室重構(gòu)及心肌TLR4信號通路的影響。方法:雄性SD大鼠56只，采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立急性心肌梗死模型，分別給予冠心Ⅴ號合劑小劑量(0.5 g/ml)、中劑量(1 g/ml)、大劑量(2 g/ml)及血脂康膠囊連續(xù)干預(yù)4周，以心臟彩超觀察心臟結(jié)構(gòu)及心功能，熒光定量PCR法檢測TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)。結(jié)果:模型組實(shí)驗(yàn)大鼠心功能明顯下降，梗死區(qū)心肌組織TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)上調(diào)，與空白組、假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;藥物干預(yù)組各組上述指標(biāo)均低于模型組;冠心Ⅴ號合劑大劑量組上述指標(biāo)低于余治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:冠心Ⅴ號合劑能夠抑制急性心肌梗死大鼠TLR4信號通路并改善心室重構(gòu)。

心肌梗死;心室重構(gòu);冠心Ⅴ號合劑;TLR4信號通路

Toll樣受體4(TLR4)是第一個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物TLR，是天然免疫系統(tǒng)的一種模式識別受體，參與急性心肌梗死(AMI)后心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。冠心Ⅴ號合劑是南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附院的院內(nèi)制劑，已在臨床應(yīng)用多年。本課題組前期研究表明，該藥可改善心梗后大鼠的血流動力學(xué)，促進(jìn)缺血心肌細(xì)胞的心肌收縮力恢復(fù)，改善心肌細(xì)胞的能量代謝，降低心肌部位的血管緊張素1受體和升高AT2受體，在一定程度上改善心梗后大鼠的心室重構(gòu)［1］。本研究進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度探討冠心Ⅴ號合劑通過抑制TLR4信號通路、干預(yù)心肌梗死后心室重構(gòu)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

健康雄性 SD大鼠56只，6～7周齡，體質(zhì)量(220±10)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號SUXK (浙)20080033)。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

冠心Ⅴ號合劑由黨參、麥冬、丹參、赤芍、制五味子、地黃組成，由南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科制備(蘇藥制字Z04000795)。血脂康膠囊由北大維信生物科技有限公司提供(批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z10950029)，引物由上海生工生物有限公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒、Trizol均由TaKaRa公司提供。主要儀器設(shè)備包括小動物呼吸機(jī)(ALC-V8)，上海奧爾科特生物科技有限公司;心電圖機(jī)，SHANGHAI KOHDEN Medical Electronic Instrument Corporation;小動物高頻彩色超聲儀(VisualSonics Vevo2100)，探頭MS-250，頻率21 MHz;7500 Real-Time PCR System，Applied Biosystems公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 分組與動物模型制備

56只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重，取14只隨機(jī)分為空白組與假手術(shù)組，剩余大鼠行左冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)造模。造模動物經(jīng)10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉后，四肢皮下連接心電圖機(jī)電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，經(jīng)口行氣管插管后接小動物呼吸機(jī)通氣，潮氣量7～8 ml，吸呼比3∶2，呼吸頻率90次/min。沿左胸第3～4肋間水平依次剪開皮膚，逐層分離皮下組織、肌肉，暴露心臟，撕開心包，用6-0號線于左心耳下緣2 mm縫扎左前降支;觀察到結(jié)扎線以下心肌變白，心肌運(yùn)動減弱(連接心電圖見Ⅱ?qū)?lián)ST段上抬0.2 mV)提示心肌梗死。逐層關(guān)閉胸腔(邊縫合邊擠壓胸腔內(nèi)的殘余氣體)。假手術(shù)組手術(shù)方法同前，但在該血管下穿線后不打結(jié)。空白對照組不作任何手術(shù)。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、冠心Ⅴ號合劑小劑量組、冠心Ⅴ號合劑中劑量組、冠心Ⅴ號合劑大劑量組、血脂康組。

2.2 給藥方法

除空白組外的6組大鼠于術(shù)后24 h開始灌胃，每只大鼠灌胃體積為1 ml/(100 g·d)。冠心Ⅴ號合劑小劑量組含生藥量0.5 g/ml，冠心Ⅴ號合劑中劑量組含生藥量1 g/ml，冠心Ⅴ號合劑大劑量組含生藥量2 g/ml，血脂康組將血脂康膠囊溶為12.5 mg/ ml灌胃，每日1次;模型組、假手術(shù)組均給予等容量生理鹽水灌胃，每日1次。連續(xù)灌胃28 d后，7組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉處死。

2.3 心臟超聲心動圖評價心功能

各組大鼠在造模第28天時行超聲心動圖檢查，使用超聲儀探頭頻率21 MHz。大鼠麻醉后固定于鼠板上，取胸骨旁左室長軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M型曲線測量EF值、FS值、左室質(zhì)量(LVmass)，計算大鼠體表面積 (BSA，m2)=0.09x［體質(zhì)量(kg)］2/3;左室心肌質(zhì)量指數(shù)(LVMI，g/m2)=實(shí)測LVM/BSA。

2.4 熒光定量PCR檢測

各組大鼠隨機(jī)取5只進(jìn)行檢測。稱取梗死區(qū)心肌組織50 mg，用Trizol法提取總RNA，并用紫外分光光度儀測定RNA濃度及A260/A280值，所測得樣品吸光度A260/A280為1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用熒光定量PCR法檢測TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)(引物見表1)。反應(yīng)條件依據(jù)Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System設(shè)定，退火溫度為58℃。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間多樣本均數(shù)比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)大鼠因呼吸暫停死亡8只，心臟驟停死亡9只，灌胃死亡1只。最終納入統(tǒng)計的動物數(shù)量為空白組7只，假手術(shù)組6只，模型組、冠心Ⅴ號合劑小劑量組、冠心Ⅴ號合劑中劑量組、冠心Ⅴ號合劑大劑量組、血脂康組各5只。

3.1 心臟彩超檢測結(jié)果

表1圖1顯示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組實(shí)驗(yàn)大鼠心功能指標(biāo)EF、FS值明顯下降，LVMI增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，各藥物干預(yù)組EF、FS增高，LVMI下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與血脂康組比較，冠心Ⅴ號大劑量組EF、FS增高，LVMI下降更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠治療28 d后心臟彩超比較(±s)

表1 各組大鼠治療28 d后心臟彩超比較(±s)

注:與空白組、假手術(shù)組比較:*P＜0.05;與模型組比較:△P＜0.05;與血脂康組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) EF(%) FS(%) LVMI(g/cm2)空白組773.911±1.023 43.488±0.521 0.134±0.005假 手 術(shù) 組 6 71.410±1.100 40.221±1.971 0.171±0.006模型組 5 52.041±1.839* 27.759±1.058* 0.240±0.013*血 脂 康 組 5 60.885±0.936△ 33.621±1.565△ 0.168±0.006△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 小 劑 量 組 5 59.130±1.329△ 31.874±1.129△ 0.179±0.006△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 中 劑 量 組 5 60.817±0.911△ 34.074±1.037△ 0.168±0.008△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 大 劑 量 組 5 62.672±1.404△▲ 35.258±0.807△▲ 0.157±0.006△▲

3.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

表2顯示，模型組大鼠梗死區(qū)心肌組織TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)上調(diào)，與空白組、假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);藥 物 干 預(yù) 組 各 組 TLR4mRNA、 Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);冠心Ⅴ號各劑量組TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)與藥物濃度成反比，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)藥物對AMI大鼠心肌組織TLR4、Myd88、NF-κB mRNA表達(dá)的影響(±s)

表2 實(shí)驗(yàn)藥物對AMI大鼠心肌組織TLR4、Myd88、NF-κB mRNA表達(dá)的影響(±s)

注:與正常組、假手術(shù)組比較:*P＜0.05;與模型組比較:△P＜0.05;與血脂康組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) TLR4mRNA Myd88mRNA NF-κBmRNA空白組50.5 0.5 0.5假 手 術(shù) 組 5 1.194±0.040 1.081±0.020 1.094±0.015模型組 5 2.078±0.129* 1.926±0.047* 1.986±0.098*血 脂 康 組 5 1.485±0.006△ 1.450±0.024△ 1.475±0.021△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 小 劑 量 組 5 1.729±0.133△ 1.682±0.087△ 1.667±0.054△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 中 劑 量 組 5 1.477±0.053△ 1.430±0.053△ 1.465±0.045△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 大 劑 量 組 5 1.292±0.033△▲ 1.317±0.029△▲ 1.357±0.048△▲

圖1 各組大鼠心臟彩超

4 討論

TLR4是天然免疫系統(tǒng)的一種模式識別受體，介導(dǎo)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)。TLR4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可分為髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴性和非依賴性2個途徑，MyD88途徑主要介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。TLR4與配體結(jié)合后使其本身二聚化，然后通過TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88羧基端相互作用，MyD88氨基端的結(jié)構(gòu)域與絲/蘇氨酸IRAK的氨基端相互作用，引起IRAK自身磷酸化，活化腫瘤壞死因子受體 6 (TRAF-6)?；罨蟮腡RAF-6通過適配體蛋白激活TGF-β活化激酶1，最終通過活化核因子抑制蛋白I-κB導(dǎo)致NF-κB的激活和轉(zhuǎn)位，NF-κB的激活可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的合成和釋放。研究表明，動脈粥樣硬化斑中TLR4的表達(dá)明顯增高，并進(jìn)一步激活NF-κB誘導(dǎo)與冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放［2］。TLR4基因缺乏的大鼠心肌梗死范圍及炎性反應(yīng)明顯減少［3］，抑制TLR下游信號通路分子，如MyD88、NF-κB也能減輕心肌缺血再灌注損傷，表明TLR/MyD88/NF-κB信號通路的激活參與缺血再灌注心肌損傷的發(fā)生和進(jìn)展［4-5］。TLR4可能成為干預(yù)心肌梗死后心室重構(gòu)炎癥反應(yīng)的目標(biāo)，干預(yù)TLR4信號可能抑制炎癥反應(yīng)，值得進(jìn)一步研究。

中醫(yī)藥在TLR4信號通路的治療中發(fā)揮著一定的作用。丹參酮是丹參的主要有效成分，已有研究［6］證實(shí)，丹參酮ⅡA可抑制 LPS誘導(dǎo)的EAhy926細(xì)胞TLR4表達(dá)，從而干預(yù)TLR4/NF-κB信號通路激活。張云［7］等研究表明，由丹參總酚酸、三七總苷和銀杏葉黃酮組成的活血安心方，通過抑制 TLR4-NFκB-TNFα通路激活來顯著改善AMI大鼠心肌缺血損傷導(dǎo)致的心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能異常。

中藥“冠心Ⅴ號合劑”是獲得江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的醫(yī)院院內(nèi)制劑(蘇藥制字Z04000795)，已在臨床應(yīng)用多年。方中黨參補(bǔ)中益氣、健脾益肺，麥冬養(yǎng)陰潤燥、清心除煩，五味子斂肺止汗、生津止渴、補(bǔ)腎寧心，赤芍行瘀止痛、涼血消腫，丹參活血祛瘀、安神寧心，生地清熱涼血、養(yǎng)陰生津，本方6味藥物合用，益氣、養(yǎng)陰、涼血、化瘀相得益彰?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參水溶液可調(diào)節(jié)心肌收縮力，增強(qiáng)心臟泵血功能，增加心輸出量，從而對缺血再灌注損傷后的心肌組織起到營養(yǎng)保護(hù)作用［8］。赤芍總苷可穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，清除自由基和抑制心肌細(xì)胞早期凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞［9］，而赤芍有效成分赤芍801可降低AMI大鼠血清炎癥因子TNF-α水平，抑制缺血心肌組織COX-2、ICAM-1表達(dá)，從而減輕AMI大鼠心肌損傷［10］。麥冬通過抑制p-Smad2/3和Smad2/3及TGF-β1蛋白表達(dá)，減少大鼠心肌纖維化［11］。丹參水溶性提取物具有增強(qiáng)冠狀動脈血流量、抗脂質(zhì)過氧化、抑制血小板聚集、血栓形成及改善微循環(huán)等作用［12-13］。前期研究表明，冠心Ⅴ號對心肌組織具有一定的保護(hù)作用，但未明確其作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，AMI大鼠心功能明顯下降，心梗死區(qū)心肌組織 TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)上調(diào)，治療后各組心功能顯著改善，基因表達(dá)明顯下降，治療效果與藥物濃度成反比，表明冠心Ⅴ號合劑能夠抑制 TLR4-Myd88-NF-κB信號通路，并改善心室重構(gòu)，以冠心Ⅴ號合劑大劑量組療效最優(yōu)。

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Guanxin V Mixture Intervention on the Ventricular Remodeling and Myocardial TLR4 Signal Pathway in Rat Model of Acute Myocardial Infarction

ZUO Ke-ke1，KE Feng1，GU Ning2△
(1．Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2．The Third Afficiated Hospital Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210001，China)

Objective:Observing the effect of Guanxin V mixture on ventricular remodeling and TLR4 signaling pathway in myocardial Tissue in rats with acute myocardial infarction．Methods:56 male SD rats，establishing the model of acute myocardial infarction by left anterior descending coronary artery ligation．All of them were treated with low Guanxin V mixture dose(0.5 g/ml)，medium dose(1 g/ml)，high dose(1 g/ml)and Xuezhikang Capsule for 4 weeks，To observe the cardiac structure and function by echocardiography，F(xiàn)luorescence quantitative PCR technique was used to detect the expression of TLR4mRNA，Myd88mRNA，NF-κBmRNA．Result:Compared with the normal group and sham operation group，the expression of TLR4mRNA，Myd88mRNA，NF-κBmRNA in model rats were up-regulation，the difference were statistically significant，Drug intervention group were lower than those in the model group，the difference were statistically significant．The mRNA expression of Guanxin V mixture groups are proportional to the concentration of each drug，the difference was statistically significant．Conclusion:Guanxin V mixture can inhibit TLR4 signal pathway，and improve ventricular remodeling．

Myocardial infarction;Ventricular remodeling;Guanxin V mixture; TLR4 signal pathway

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0181-03

2015-06-12

南京市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項目(201108005)-冠心Ⅴ號合劑改變劑型及干預(yù)心肌TLR4信號通路改善AMI后心室重構(gòu)機(jī)制研究;江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(CXZZ13_ 0611)-基于心肌TLR4信號通路冠心Ⅴ號干預(yù)AMI后心室重構(gòu)機(jī)制

左可可，女，河南人，從事中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:顧 寧，男，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，Tel:025-52276242，E-mail:guning@medmail．com．cn。