米曲霉優(yōu)良菌株的篩選及在制曲發(fā)酵西瓜黃豆醬中的應(yīng)用

孫笑寒，蔣雪薇,2,*，肖智予，歐德沖，李 開(kāi)，周 慧,2，方勤軍

（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；2.湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410600；3.加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600）

西瓜黃豆醬是我國(guó)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，起源于清朝后期豫魯?shù)貐^(qū)，是一種傳統(tǒng)調(diào)味品[1]。西瓜黃豆醬主要以黃豆、小麥面粉和西瓜為原料，經(jīng)霉菌（主要是米曲霉）、酵母菌和乳酸菌等微生物及其酶系共同作用而制成的具有獨(dú)特色、香、味的半固體黏稠狀調(diào)味品[2-3]。米曲霉是西瓜黃豆醬最重要的制曲菌種，其分泌的豐富酶系能有效降解淀粉及蛋白質(zhì)原料，為其他微生物的生長(zhǎng)代謝及黃豆醬特征風(fēng)味的形成奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，米曲霉蛋白酶活性是篩選此菌種的主要指標(biāo)，但對(duì)米曲霉淀粉酶活性研究卻較少，而淀粉酶活性對(duì)增香提味也具有重要作用[4]。與開(kāi)放式制曲發(fā)酵工藝相比，將蛋白酶活性?xún)?yōu)良米曲霉應(yīng)用于黃豆醬單一菌種制曲發(fā)酵，雖然能夠縮短發(fā)酵周期，保證產(chǎn)品穩(wěn)定性，但是由于淀粉酶活性較弱，使淀粉質(zhì)原料利用率低，黃豆醬鮮甜味不足[5-6]。

黃豆醬原料中大豆與小麥面粉比例多為7∶3或8∶2，淀粉質(zhì)原料過(guò)少導(dǎo)致其通過(guò)糖代謝反應(yīng)生成小分子糖類(lèi)物質(zhì)含量低，豆醬甜感較弱；同時(shí)，還原糖與氨基酸通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)和焦糖色也隨之較少，使黃豆醬出現(xiàn)香氣寡淡，米曲霉孢子霉味明顯，色澤暗淡、無(wú)光澤等問(wèn)題[7-8]。而在西瓜黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中，西瓜作為主要原料添加，其含有豐富的果糖和葡萄糖，不僅賦予黃豆醬調(diào)和的甜感，同時(shí)使酵母利用足夠充分的糖類(lèi)化合物產(chǎn)生醇類(lèi)物質(zhì)，再通過(guò)脫羧反應(yīng)生成酸類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)酯化反應(yīng)生成酯類(lèi)物質(zhì)，為提升黃豆醬的醇香、酯香風(fēng)味做出極大貢獻(xiàn)[9]。新鮮西瓜本身也含有不飽和C9醇和醛類(lèi)等氣味活性化合物，是西瓜黃豆醬具有獨(dú)特果香的主要原因[10]。但是，現(xiàn)階段我國(guó)西瓜黃豆醬多采用家庭手工作坊生產(chǎn)，生產(chǎn)效率低、發(fā)酵周期長(zhǎng)；天然制曲和日曬夜露發(fā)酵工藝具有菌種多樣、酶系豐富等特點(diǎn)，但在自然接種過(guò)程中易發(fā)生雜菌污染，造成豆醬質(zhì)量不穩(wěn)定[11]。針對(duì)以上問(wèn)題，可以從菌種、制曲方式2 個(gè)方面解決西瓜黃豆醬品質(zhì)不穩(wěn)定的問(wèn)題。

本研究從制醬用成品曲中分離篩選蛋白酶及淀粉酶活性?xún)?yōu)良的菌株，通過(guò)對(duì)比研究蛋白酶活性與淀粉酶活性?xún)?yōu)良菌的單一菌種制曲及混合菌種制曲后的西瓜黃豆醬發(fā)酵過(guò)程，考察其不同制曲方式對(duì)西瓜黃豆醬的理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及感官評(píng)分的影響，探索米曲霉不同酶活性?xún)?yōu)良菌與西瓜黃豆醬風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)系，以期從滋味、香氣、色澤、體態(tài)四方面提高豆醬品質(zhì)，為工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的西瓜黃豆醬奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 材料與試劑

成品曲（制醬用），采自湖南某調(diào)味品廠；商業(yè)米曲霉曲精 河北石家莊市鼎鑫釀造食品科學(xué)研究所；黃豆、小麥面粉、西瓜、馬鈴薯均為市售。

真菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；福林-酚 上海麥克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試有限公司；2-甲基-3-庚酮（內(nèi)標(biāo)物，99.5%，色譜純） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g去皮、塊狀馬鈴薯，添加1 000 mL水，煮沸30 min，多層紗布過(guò)濾取濾液，加水至1 000 mL，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；蛋白酶初篩上層平板培養(yǎng)基：脫脂牛奶4 mL/L，磷酸氫二鉀1.07 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.36 g/L，胰蛋白胨0.04 g/L，氯化鋅0.04 g/L，硫酸亞鐵0.02 g/L，氯化鈣0.002 g/L，氯化鈉0.16 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；淀粉酶初篩上層平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，蔗糖30 g/L，硝酸鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；下層平板瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；制曲培養(yǎng)基：蒸煮黃豆-炒面粉質(zhì)量比5∶1，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；VERITI聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；YRE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；436GC/EVOQ TQ/PAL氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)布魯克科技有限公司；DB-5MS色譜柱 安捷倫科技中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

圖1 菌種篩選及釀造西瓜黃豆醬的工藝流程Fig. 1 Flow chart of strain screening and manufacturing of fermented watermelon-soybean paste

工藝流程如圖1所示。從成品曲中分離篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的米曲霉，制備孢子懸液接種至蒸煮黃豆及焙炒小麥面粉的混合原料中，制備西瓜黃豆醬成品曲；成品曲與鹽和西瓜按比例混合，28 ℃恒溫發(fā)酵30 d，釀制得到西瓜黃豆醬。

1.3.2 米曲霉的分離純化

將成品曲樣品梯度稀釋后，吸取不同梯度稀釋液0.1 mL涂布于PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，28 ℃培養(yǎng)3 d，挑選具有米曲霉典型形態(tài)特征且生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行鏡檢，將初步鏡檢結(jié)果為米曲霉的菌株在PDA平板中進(jìn)一步分離純化獲得純培養(yǎng)菌株。

1.3.3 米曲霉的篩選

1.3.3.1 牛津杯法初篩產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶菌株

將純培養(yǎng)菌株接種至PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h，收集菌液，制成孢子數(shù)為1×108的孢子懸液。無(wú)菌條件下，取0.1 mL孢子懸液至蛋白酶初篩培養(yǎng)基的牛津杯中，28 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定蛋白酶水解圈直徑。按照上述方法，將等量孢子懸液接種至淀粉酶初篩培養(yǎng)基的牛津杯中，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，利用稀碘液噴灑至培養(yǎng)基中，顯色后，測(cè)量淀粉酶水解圈直徑。每株菌均重復(fù)3 次平行實(shí)驗(yàn)[12-13]。

1.3.3.2 制曲復(fù)篩產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶優(yōu)良菌株

取2 mL孢子數(shù)為108個(gè)/mL的孢子懸液接種于制曲培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h取樣測(cè)定蛋白酶、淀粉酶活性。

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 菌落及菌體形態(tài)鑒定

接種針沾取少許孢子點(diǎn)接于PDA平板培養(yǎng)基中央，30 ℃培養(yǎng)4 d，形成菌落培養(yǎng)物，拍照記錄菌落形態(tài)；接種環(huán)取少許孢子點(diǎn)接于載玻片上，滴加少量融化并冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基，待形成薄而圓的小瓊脂塊后進(jìn)行濕室培養(yǎng)[14]，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.3.4.2 ITS rRNA序列分析

利用真菌試劑盒提取所篩菌種模板DNA，以ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4 （5’-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3’）作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系（30 μL）：模板3 μL，上下游引物各3 μL，Taq聚合酶1 μL，dNTP 2.5 μL，MgCl22 μL，10×PCR Buffer 3 μL，ddH2O補(bǔ)齊30 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司完成，結(jié)果在NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，利用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.5 制曲及發(fā)酵

單一菌種制曲發(fā)酵：分別將5 mL孢子數(shù)為108個(gè)/mL的商業(yè)米曲霉菌株、篩選米曲霉菌種CS3.04、CS3.22的孢子懸液接種到300 g原料（蒸煮黃豆-炒面粉質(zhì)量比5∶1）中，32 ℃制曲72 h獲得成品曲，成品曲與西瓜以質(zhì)量比1∶1.5裝瓶發(fā)酵；28 ℃恒溫發(fā)酵30 d，每隔5 d取樣測(cè)定理化指標(biāo)，發(fā)酵結(jié)束后用GC-MS分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)并進(jìn)行感官評(píng)定；接種商業(yè)米曲霉、CS3.04、CS3.22孢子懸液的樣品分別為S0、S1、S2?；旌暇N制曲發(fā)酵：菌種CS3.04及CS3.22單一菌種制曲所獲得的成品曲以質(zhì)量比1∶1混合后，按上述條件發(fā)酵制得的混合菌種制曲發(fā)酵西瓜黃豆醬樣品為S3。

1.3.6 酶活性測(cè)定

蛋白酶活性參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[15]測(cè)定，以干基質(zhì)量計(jì)，計(jì)算如式（1）所示：

式中：A為在680 nm波長(zhǎng)處由樣品測(cè)得的吸光度；4為酶反應(yīng)總體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)稀釋倍數(shù)為400 倍；10為反應(yīng)時(shí)間（min）；W為成品曲的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)為55%。

淀粉酶活性參照3,5-二硝基水楊酸比色法[16]測(cè)定，以干基質(zhì)量計(jì)，計(jì)算如式（2）所示：

式中：N為稀釋倍數(shù)；180為葡萄糖摩爾質(zhì)量（g/mol）；20為反應(yīng)時(shí)間（min）；1 000為mmol到μmol單位換算；1為酶液體積（mL）；A為在540 nm波長(zhǎng)處由樣品測(cè)得的吸光度；K為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3.7 發(fā)酵黃豆醬還原糖、總酸、氨態(tài)氮測(cè)定

還原糖含量：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》[17]測(cè)定；氨態(tài)氮及總酸含量：參照GB 2718—2014《釀造醬》[18]測(cè)定。

1.3.8 發(fā)酵黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

液體進(jìn)樣樣品準(zhǔn)備：取樣品20 g，三氯甲烷萃取2 次，混合有機(jī)相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液剩余5 mL，無(wú)水硫酸鈉除水，0.22 μm膜過(guò)濾；樣品定量處理：向準(zhǔn)備好的樣品中添加20 μL 8.16 μg/μL的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)物，總體積為1.5 mL；GC條件：40 ℃維持2 min，以5 ℃/min升至120 ℃維持2 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，維持5 min，載氣（He）流速為1.0 mL/min，分流比為10∶1；MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～500[19]。揮發(fā)性化合物定量計(jì)算如式（3）所示：

式中：C1為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量/（mg/kg）；C2為內(nèi)標(biāo)物含量/（mg/kg）；A1為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰面積；A2為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.3.9 發(fā)酵黃豆醬感官評(píng)定

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，選擇11 位具有相關(guān)食品背景且經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容訓(xùn)練的專(zhuān)業(yè)人員對(duì)隨機(jī)編碼的4 種西瓜黃豆醬進(jìn)行感官評(píng)分。參考GB 2718—2014中對(duì)黃豆醬的感官要求，從滋味、香氣、體態(tài)、色澤4 項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)西瓜黃豆醬進(jìn)行感官評(píng)定[18,20-21]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[22]見(jiàn)表1。

表1 西瓜黃豆醬感官評(píng)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented watermelon-soybean paste

1.4 數(shù)據(jù)處理

牛津杯水解圈直徑、酶活性、理化指標(biāo)以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均3 次重復(fù)測(cè)定，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；利用Excel、Origin 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶優(yōu)良菌株的初篩

菌株初篩工作量較大，且霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中菌絲伸展生長(zhǎng)，不易測(cè)量直徑。采用牛津杯雙層平板法初篩菌種，不僅省去制曲過(guò)程，節(jié)省大量時(shí)間；也能解決霉菌水解圈與菌落直徑比存在較大誤差的問(wèn)題。從成品曲中分離米曲霉，在PDA平板上挑選生長(zhǎng)良好的單菌落進(jìn)行分離純化，篩選出38 株米曲霉，命名為CS3.01～CS3.38。將38 株菌株發(fā)酵液接種于牛津杯中，考察其分解上層平板中蛋白質(zhì)及淀粉能力大小，反映其蛋白酶及淀粉酶活性強(qiáng)弱。如圖2所示，比較牛津杯水解圈直徑大小，發(fā)現(xiàn)4 株菌株的2 種水解圈直徑均較大。其中蛋白酶初篩平板中直徑大小依次為CS3.22＞CS3.04＞CS3.31＞CS3.12；淀粉酶初篩平板中直徑大小依次為CS3.12＞CS3.04＞CS3.22＞CS3.31。因此，對(duì)這4 株菌株進(jìn)行制曲酶活性驗(yàn)證。

圖2 產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶菌株的初篩結(jié)果Fig. 2 Preliminary screening results of protease- and amylaseproducing strains

2.2 產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶優(yōu)良菌株的復(fù)篩

為測(cè)定所篩4 株菌株的酶活性隨時(shí)間變化情況，分別將菌種孢子懸液（1×108CFU/mL）接種到制曲培養(yǎng)基中，測(cè)定其蛋白酶活性和淀粉酶活性。從圖3可以看出，4 株菌株的蛋白酶活性均在制曲72 h達(dá)到最大，酶活性大小為CS3.22＞CS3.04＞CS3.31＞CS3.12，其中CS3.22蛋白酶活性最大，為3 132.16 U/g。淀粉酶活性在制曲60～72 h達(dá)到最大，酶活性大小為CS3.04＞CS3.22＞CS3.12＞CS3.31，其中CS3.04淀粉酶活性最大，為107.60 U/g。這與牛津杯法初篩的結(jié)果基本保持一致，說(shuō)明其結(jié)果具有真實(shí)性和可靠性。通過(guò)比較4 株菌蛋白酶和淀粉酶的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CS3.22和CS3.04分別是產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶優(yōu)良菌株，有利于降解原料中蛋白質(zhì)和糖類(lèi)等大分子物質(zhì)，提高氨態(tài)氮及還原糖含量，改善黃豆醬滋味，故對(duì)CS3.22和CS3.04進(jìn)行鑒定及后續(xù)發(fā)酵研究。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將CS3.04和CS3.22點(diǎn)接PDA培養(yǎng)基平板和濕室培養(yǎng)后，觀察其形態(tài)。如圖4所示，2 株菌的菌落均呈黃綠色，絲絨質(zhì)地，菌絲短且疏松。顯微鏡觀察菌體形態(tài)，CS3.04、CS3.22兩株菌具有分生孢子梗，底端有明顯的足細(xì)胞；頂端有球形頂囊，其表面長(zhǎng)出輻射狀小梗，分生孢子串生。根據(jù)菌落及菌體形態(tài)，初步判斷所篩選的2 株菌為米曲霉。

圖4 菌落及菌體形態(tài)Fig. 4 Colony and cell morphology

2.3.2 ITS rRNA序列分析

2 株菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如圖5a所示，CS3.04和CS3.22擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度約為600 bp，條帶清晰。將2 株菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ITS序列分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖5b所示，CS3.04和CS3.22 ITS序列相似度高，聚為一類(lèi)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定均為米曲霉（Aspergillus oryzae）。

圖5 菌種的鑒定結(jié)果Fig. 5 Identification of the strains

2.4 制曲發(fā)酵西瓜黃豆醬

2.4.1 不同制曲方式發(fā)酵西瓜黃豆醬過(guò)程中理化指標(biāo)的變化

以接種商業(yè)米曲霉發(fā)酵的西瓜黃豆醬S0作為對(duì)照組，單獨(dú)接種CS3.04制曲發(fā)酵的S1、單獨(dú)接種CS3.22制曲發(fā)酵的S2、以CS3.04和CS3.22質(zhì)量比1∶1混合菌種制曲發(fā)酵的S3作為實(shí)驗(yàn)組，考察4 組樣品在發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化。如圖6a所示，在0～30 d還原糖含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，由于西瓜中糖類(lèi)物質(zhì)含量較高，使得在發(fā)酵起始期就明顯高于傳統(tǒng)黃豆醬得還原糖含量。在10 d還原糖含量均達(dá)到最高值，大小依次為S3＞S1＞S2＞S0，其中S3為107.37 g/kg，比S0提升了11.02%。主要是由于CS3.04淀粉酶活性較高，有利于將原料中淀粉等大分子物質(zhì)分解為小分子糖類(lèi)物質(zhì)，使還原糖含量增加較快。隨著發(fā)酵體系中各種微生物生長(zhǎng)活動(dòng)逐漸旺盛，還原糖作為主要碳源被不斷利用，使還原糖含量逐漸下降。如圖6b所示，氨態(tài)氮含量逐漸增加，在25 d氨態(tài)氮含量大小依次為S3＞S2＞S1＞S0，S3在30 d達(dá)到6.76 g/kg，符合GB 2718—2014要求（氨態(tài)氮≥5.00 g/kg），比S0提升了5.56%。說(shuō)明具有較強(qiáng)中性蛋白酶活性的CS3.22，水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸的能力優(yōu)于CS3.04及市售米曲霉，有利于提高氨態(tài)氮含量。如圖6c所示，總酸含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，總酸含量大小依次為S0＞S1＞S2＞S3。在15 d，S0的總酸含量最高為3.77 g/kg，總酸含量過(guò)高，超過(guò)適口濃度，并不利于西瓜黃豆醬品質(zhì)提升。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化Fig. 6 Changes in physical and chemical indicators during fermentation

2.4.2 不同制曲方式發(fā)酵西瓜黃豆醬的香氣成分分析

西瓜黃豆醬的香氣物質(zhì)主要來(lái)源于制曲和發(fā)酵2個(gè)階段，原料、菌種、制曲方式、發(fā)酵工藝都對(duì)香氣組成有重要影響[23]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，分析4 種西瓜黃豆醬的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如表2所示。4 種不同制曲方式發(fā)酵的西瓜黃豆醬共檢測(cè)到54 種物質(zhì)，其中醇類(lèi)11 種、酯類(lèi)13 種、酸類(lèi)9 種、酚類(lèi)8 種、醛類(lèi)5 種、酮類(lèi)4 種、其他物質(zhì)4 種。不同制曲方式對(duì)西瓜黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)影響不顯著，但對(duì)其含量具有顯著影響。

醇類(lèi)物質(zhì)是發(fā)酵食品中一類(lèi)重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，S0～S3中醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)分別為7、9、10、11 種，S1、S2、S3較S0略有提升，但其含量相較于S0均有明顯提高，分別提升了61.31%、137.69%、168.98%。生成醇類(lèi)物質(zhì)的途徑主要有2 條，一條途徑是氨基酸與小分子糖類(lèi)通過(guò)氧化反應(yīng)生成，另一條途徑是由部分醛類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成醇類(lèi)[24]?；旌暇N制曲發(fā)酵菌株CS3.04與CS3.22所分泌的淀粉酶與蛋白酶發(fā)生協(xié)同作用，為生成醇類(lèi)物質(zhì)提供豐富的前體物質(zhì)。S3中醛類(lèi)物質(zhì)含量最高，說(shuō)明醛類(lèi)物質(zhì)的含量同醇類(lèi)物質(zhì)的含量呈正相關(guān)。其中苯乙醇在4 組樣品中均檢測(cè)到，S3含量最高，為3.36 mg/kg，分別比S0、S1、S2提高了160.46%、65.52%、12%，使S3具有更明顯的玫瑰花香；1-辛烯-3-醇在S1、S2、S3中均檢測(cè)到，其香味閾值較低，僅為1.5 μg/kg[25]，該物質(zhì)在西瓜黃豆醬中的香氣活性值均較高，賦予西瓜黃豆醬蘑菇及油脂香氣。

在發(fā)酵食品中，低濃度的醛、酮類(lèi)化合物會(huì)帶來(lái)清新愉悅的香氣，高濃度則會(huì)產(chǎn)生刺激性氣味[26]。黃豆醬中醛類(lèi)物質(zhì)大部分來(lái)源于氨基酸脫氨基、脫羧基而生成，如苯甲醛、苯乙醛是由苯丙氨酸降解產(chǎn)生；另外一部分來(lái)源于微生物利用不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)而生成[27-28]。樣品S0、S1、S2、S3中醛類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)分別為1、2、3、5 種，而其醛類(lèi)物質(zhì)含量則分別為0.25、0.52、0.62、1.57 mg/kg，推測(cè)是蛋白酶活性直接影響氨基酸及多肽生成，從而間接影響醛類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及含量。己醛在4 組樣品中均檢測(cè)到，具有典型的西瓜香氣[11]，是原料西瓜所賦予的獨(dú)特果香；乙縮醛在S3、S2中被檢測(cè)到，呈辛辣及芳草香；桃醛和苯甲醛僅在S3中檢測(cè)到，具有強(qiáng)烈的桃子香氣和苦杏仁氣味。

S0～S3中酮類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)分別為3、4、2、3 種，S1、S2、S3中酮類(lèi)物質(zhì)含量相較于S0分別提高63.41%、32.12%、164.25%。具有奶油香氣的3-羥基-2-丁酮在4 組樣品中均檢測(cè)到，S1、S2、S3中3-羥基-2-丁酮的含量是S0的3.86、2.30、1.57 倍。2-壬酮僅在S0和S1中檢測(cè)到，具有柔和的藥草香氣，是藥材姜黃的典型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為黃豆醬賦予醇厚感[29]。

酯類(lèi)物質(zhì)是西瓜黃豆醬中的主體香氣成分，S2和S3酯類(lèi)物質(zhì)含量相似，分別為3 305.36、3 129.72 mg/kg，高于S0與S1。其中棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯在4 組中占比較高，這3 種酯類(lèi)均是濃香型白酒中一種典型的高級(jí)脂肪酸酯，能夠增加后味，可能是由于原料黃豆中含有20%左右脂肪，米曲霉通過(guò)分泌脂肪酶將脂肪分解為脂肪酸及甘油后經(jīng)過(guò)復(fù)雜代謝反應(yīng)生成[30-31]；S3中異戊酸異戊酯、乙酸異戊酯、丁酸甲酯含量高于其他3 組，這些短鏈脂肪酸酯是黃豆醬的重要風(fēng)味物質(zhì)，具有清新的果香。

酸類(lèi)物質(zhì)主要作用是與其他香氣物質(zhì)相輔相成、調(diào)和助香。S1中酸類(lèi)物質(zhì)含量最高，與理化指標(biāo)中總酸含量吻合。S1的棕櫚酸、異戊酸、肉豆蔻酸含量均高于其他3 組，其中肉豆蔻酸具有乳脂和椰子油的香氣，而低濃度異戊酸具有甜潤(rùn)果香，高濃度異戊酸具有不良?xì)馕?，?duì)人類(lèi)食道和呼吸道具有一定刺激性[32]。

酚類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)源于小麥等碳水化合物原料中木質(zhì)素代謝有關(guān)，增加原料中小麥粉比例可提高酚類(lèi)物質(zhì)含量[24]。S1的酚類(lèi)物質(zhì)含量最高，比S0提高了28.57%，其中愈創(chuàng)木酚及4-乙基愈創(chuàng)木酚這2 類(lèi)酚類(lèi)物質(zhì)含量均高于其他3 組，它們是豆醬中典型的呈香物質(zhì)，具有煙熏香和焦香。說(shuō)明增強(qiáng)淀粉酶活性，提高淀粉質(zhì)原料降解率，可以提升愈創(chuàng)木酚及4-乙基愈創(chuàng)木酚等酚類(lèi)物質(zhì)的含量。

表2 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及含量Table 2 Changes in composition and content of volatile flavor compounds during fermentation

續(xù)表2

2.4.3 不同制曲方式發(fā)酵西瓜黃豆醬的感官評(píng)定結(jié)果

西瓜黃豆醬感官評(píng)定是鑒定其品質(zhì)必不可少的一步，因此，在發(fā)酵結(jié)束期，對(duì)4 組生西瓜黃豆醬進(jìn)行感官評(píng)定。如圖7所示，感官總分排名次序?yàn)镾3＞S2＞S1＞S0。滋味上，S2和S3優(yōu)于S0和S1，說(shuō)明蛋白酶活性對(duì)西瓜黃豆醬滋味具有顯著影響，與氨態(tài)氮含量趨勢(shì)結(jié)果保持一致。香氣上，S3＞S2＞S1＞S0，這與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果不同，可能是由于不同風(fēng)味物質(zhì)香氣閾值存在差異，對(duì)于未達(dá)到其閾值的風(fēng)味物質(zhì)，則無(wú)法被嗅聞到。色澤及體態(tài)上，S3評(píng)分均高于其他3 組。說(shuō)明CS3.04、CS3.22能夠改善西瓜黃豆醬的品質(zhì)，并且通過(guò)混菌制曲發(fā)酵可以達(dá)到最佳效果。

圖7 西瓜黃豆醬感官評(píng)分結(jié)果Fig. 7 Sensory scoring results of fermented watermelon-soybean paste

3 結(jié) 論

本研究篩選獲得1 株淀粉酶活性?xún)?yōu)良米曲霉CS3.04和1 株蛋白酶活性?xún)?yōu)良米曲霉CS3.22，將2 株菌株以不同制曲方式應(yīng)用于西瓜黃豆醬發(fā)酵中，與單一菌種制曲發(fā)酵相比較，混合菌種制曲發(fā)酵中在理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及感官評(píng)定均占有一定優(yōu)勢(shì)?；旌暇N制曲發(fā)酵過(guò)程中，淀粉酶與蛋白酶發(fā)揮互補(bǔ)協(xié)同作用，提供豐富的糖類(lèi)及氨基酸等小分子前體物質(zhì)，使還原糖及氨態(tài)氮含量有所提升，有利于生成醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)及短鏈酯類(lèi)等花果型香氣物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶活性?xún)?yōu)勢(shì)菌CS3.04與蛋白酶活性?xún)?yōu)勢(shì)菌CS3.22混合菌種制曲發(fā)酵西瓜黃豆醬的工藝能為解決豆醬甜感不足、香氣寡淡等問(wèn)題提供一條新的途徑，具有良好的應(yīng)用潛力。