f3b基因表達下調(diào)斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2、Huc的表達觀察

周瑞芳，陳宜剛，李曉潔，刁愛芹，于敏

(1江蘇省泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300;2上海市復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)國家重點實驗室)

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f3b基因表達下調(diào)斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2、Huc的表達觀察

周瑞芳1，陳宜剛1，李曉潔1，刁愛芹1，于敏2

(1江蘇省泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300;2上海市復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)國家重點實驗室)

目的 觀察f3b基因表達下調(diào)斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子2(olig-2)、神經(jīng)系統(tǒng)特異表達RNA結(jié)合蛋白(Huc)的表達情況。方法 將單細胞階段的斑馬魚胚胎隨機分為兩組(胚胎數(shù)量分別為90枚和85枚)，分別注射針對f3b起始密碼區(qū)域序列的嗎啡啉反義核苷酸(ATG-MO)和作為標(biāo)準(zhǔn)對照的隨機序列嗎啡啉反義核苷酸(CON-MO)。在CON-MO注射后的斑馬魚胚胎中隨機挑選20枚受精后24 h的胚胎作為對照組，在ATG-MO注射后出現(xiàn)特異表型的斑馬魚胚胎中隨機挑選20枚受精后24 h的胚胎作為實驗組，通過原位雜交的方法檢測兩組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2、Huc。結(jié)果 實驗組、對照組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2表達評分分別為(1.9±0.4)、(5.6±0.5)分，兩組比較，P<0.01。實驗組、對照組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)Huc表達評分分別為(6.3±0.6)、(6.5±0.3)分，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 f3b基因表達下調(diào)斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2表達減弱、Huc表達無明顯變化。

f3b基因；斑馬魚胚胎；少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子2；神經(jīng)系統(tǒng)特異表達RNA結(jié)合蛋白

研究[1～4]發(fā)現(xiàn)，凝血因子Ⅲ在多種疾病中表達異常，凝血因子Ⅲ基因敲除的小鼠在胚胎期病死率高[5]。斑馬魚是近年來出現(xiàn)的一種良好的模式生物，在胚胎發(fā)育期通體透明，便于觀測神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[5]，并且其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在進化上與哺乳動物具有高度的保守性。斑馬魚中的凝血因子Ⅲ基因有兩個同源基因——凝血因子Ⅲa(f3a)與凝血因子Ⅲb(f3b)[7]。我們前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在f3b基因下調(diào)后出現(xiàn)了明顯的特異表型，在胚胎受精后24 h腦部組織出現(xiàn)腫脹。為了進一步探討f3b對斑馬魚胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響，本研究觀察了f3b基因抑制對斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子2(olig-2)、神經(jīng)系統(tǒng)特異表達RNA結(jié)合蛋白(Huc)表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 野生型斑馬魚(AB*品系)胚胎取自復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室斑馬魚養(yǎng)殖基地。野生型斑馬魚(AB*品系)從國際斑馬魚資源中心引進，斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)從美國Aquatic Habitats公司引進，喂養(yǎng)方案按照Kimmel等[9]描述進行，用于原位雜交的斑馬魚胚胎在受精后24 h時,在其培養(yǎng)液中加入少許0.003%苯硫脲(PTU),以防止斑馬魚胚胎黑色素的形成。

1.2 儀器與試劑 SZX12解剖顯微鏡，DP-70數(shù)碼相機(日本Olympus公司)，IMAGE PRO圖像處理軟件(Media Cybernetic)，顯微注射器(日本Narishige公司)，PCR擴增儀(Gene Amp System 9700，美國ABI公司)。TRIzol RNA提取試劑盒(GIBCO BRL公司)，整體原位雜交RNA探針合成試劑盒(美國Roche公司)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa 公司)，pGEM-T載體系統(tǒng)(美國Promega公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(美國QIAGEN公司)，引物由Sangon生物公司合成。

1.3 斑馬魚胚胎f3b基因表達下調(diào)方法 收集同一批喂養(yǎng)的斑馬魚交配產(chǎn)生的胚胎，挑選生長狀態(tài)良好的處于單細胞階段的胚胎175枚，并隨機分為兩組(胚胎數(shù)量分別為90枚和85枚)。設(shè)計針對f3b起始密碼區(qū)域序列的嗎啡啉反義核苷酸(ATG-MO，序列為5′-TACAGTCTGAATTCCCATCGTTGGT-3′)和作為標(biāo)準(zhǔn)對照的隨機序列嗎啡啉反義核苷酸(CON-MO，序列為5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3′)，調(diào)節(jié)其濃度為0.5 mg/mL，通過顯微注射的方法分別注入到兩組斑馬魚胚胎的單細胞階段(每個胚胎約注射4 ng嗎啡啉)[8]。ATG-MO注射后正常、特異表型、死亡的斑馬魚胚胎數(shù)量分別為20、46、24枚，CON-MO注射后正常、特異表型、死亡的斑馬魚胚胎數(shù)量分別為53、5、27枚，兩者斑馬魚胚胎特異表型率比較，P<0.01。

1.4 斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2、Huc檢測方法 制備olig-2、Huc基因探針。抽提斑馬魚胚胎受精后48 h總RNA，經(jīng)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并以其為模板，使用olig-2引物序列(5′-TCTGTGCG-CAAGCTCTCTAA-3′、3′-TGAGGAAGGTTTGCCATTT-C-5′)及Huc引物序列(5′-CAAGGCTATCAACACGC-TCA-3′、3′-CGTCGTAGTTGGTCATGGTG-5′)分別進行PCR擴增特異性基因序列，作為原位雜交的探針片段。將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接入PGEM-T載體中，經(jīng)測序驗證后，獲得含有目的cDNA片段的質(zhì)粒。利用內(nèi)切酶將其線性化后，體外轉(zhuǎn)錄,得到olig-2及Huc反義RNA探針(地高辛標(biāo)記)。采用胚胎整體原位雜交方法檢測olig-2、Huc。在CON-MO注射后的斑馬魚胚胎中隨機挑選20枚受精后24 h的胚胎作為對照組，在ATG-MO注射后出現(xiàn)特異表型的斑馬魚胚胎中隨機挑選20枚受精后24 h的胚胎作為實驗組。兩組胚胎均用1×PBS溶液洗去多余的甲醇溶液，蛋白酶K消化，將胚胎置于65 ℃水浴進行預(yù)雜交3 h，然后加入所合成的反義RNA探針65 ℃水浴雜交過夜。多余的探針用0.2×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液洗去,加入anti-Dig-AP(購于Roche公司)與反義RNA探針結(jié)合過夜。未結(jié)合的抗體用1×PBS溶液洗去，再加入BCIP/NBT/NTMT溶液顯色30 min，迅速用1×PBS溶液洗去多余的顯色液，在顯微鏡下觀察拍照并記錄結(jié)果。原位雜交結(jié)果的判讀[10]：olig-2、Huc原位雜交的陽性信號位于斑馬魚胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，呈藍黑色(無探針雜交的樣本無陽性信號顯示)。陽性信號區(qū)域占整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)≤10%計1分、>10%～30%計2分、>30%～70%計3分、>70%計4分，著色強度弱計1分、中計2分、強計3分，將上述兩項積分相加，即為olig-2、Huc表達評分結(jié)果。

2 結(jié)果

實驗組、對照組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2表達評分分別為(1.9±0.4)、(5.6±0.5)分，兩組比較，P<0.01。實驗組、對照組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)Huc表達評分分別為(6.3±0.6)、(6.5±0.3)分，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

在本實驗中，我們采用顯微注射嗎啡啉修飾的反義核苷酸的方法對目的基因f3b進行了表達阻抑，并成功地得到了斑馬魚胚胎腦部組織腫脹的表型。ATG-MO根據(jù)斑馬魚f3b起始密碼子所在區(qū)域的序列設(shè)計，能夠與正義的mRNA結(jié)合，抑制f3b翻譯的起始，從而在翻譯水平阻斷f3b基因的表達。f3b基因表達下調(diào)后斑馬魚胚胎出現(xiàn)腦部組織腫脹，我們推測f3b對斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有一定影響。因此，我們合成了olig-2及Huc兩個探針并檢測了中樞神經(jīng)系統(tǒng)olig-2、Huc。

oLig-2屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族中的成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中主要存在于少突膠質(zhì)細胞祖細胞中，其對脊髓少突膠質(zhì)細胞的定向分化具有不可替代的作用[11～14]。Huc是胚胎致死異常視覺(ELAV)基因家族中的成員，其在神經(jīng)元特異表達，并且在胚胎發(fā)育過程中，對神經(jīng)元的形成及維持發(fā)揮重要的作用[15]。本研究顯示，f3b功能阻抑后，olig-2的表達減弱，這提示f3b在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中有重要作用，其功能抑制可導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)腦部組織腫脹的表型，其機制可能與olig-2的表達減弱有關(guān)。在olig-2基因缺失的大鼠脊髓中，少突膠質(zhì)前體細胞明顯減少,不能形成正常的少突膠質(zhì)細胞，在脊髓中甚至完全缺乏，并最終影響髓鞘的形成。在脊椎動物中，不同發(fā)育時期，不同細胞系的增殖與分化對整個神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育都非常重要。神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞在不同階段、不同位點發(fā)育，且參與這些細胞形成發(fā)育的時空調(diào)控分子信號通路也不同[16]。在大鼠脊髓神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)前體細胞的分化過程中，olig基因受到MAPK/ERK信號通路的調(diào)節(jié)，從而影響其向少突膠質(zhì)前體細胞分化。而在斑馬魚中，f3b通過哪些信號通路參與調(diào)節(jié)olig-2基因的表達，尚需進一步的研究。Takebayashi等[17]研究顯示，脊髓發(fā)育中，olig-2在時間和空間上的特異性表達會激活Ngn1和Ngn2基因，從而引起脊髓運動神經(jīng)元前體區(qū)域運動神經(jīng)元的分化。而在另一項研究[18]中，olig-2基因敲除的大鼠脊髓腹側(cè)運動神經(jīng)元的發(fā)育受到嚴(yán)重影響，甚至根本不能產(chǎn)生運動神經(jīng)元，原本起源于運動神經(jīng)元前體區(qū)的運動神經(jīng)元被V2中間神經(jīng)元替代。這或許可以解釋本研究結(jié)果中為何olig-2的表達明顯減弱，而Huc的表達情況卻未見明顯異常。olig-2編碼的蛋白在大多數(shù)人腦膠質(zhì)瘤中高表達[19，20]，在動物模型中除去olig-2陽性的細胞可抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展。研究人員還發(fā)現(xiàn)，抑制olig-2后，正在形成的腦膠質(zhì)瘤細胞改變了分化方向和分子構(gòu)成，從與少突膠質(zhì)細胞前體細胞相似的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾切文z質(zhì)細胞樣細胞。它們雖然繼續(xù)形成腫瘤，但這些新形成的星形膠質(zhì)細胞樣腦癌細胞以高水平生成表皮生長因子受體(EGFR)基因。EGFR是臨床上一些化療藥物治療腫瘤的一個常見且有效的靶點。在星形膠質(zhì)細胞樣癌細胞的小鼠模型中，研究人員用一種EGFR靶向化療藥物——吉非替尼進行治療，新腫瘤細胞停止了生長。

近年來，也有不少研究指出凝血因子Ⅲ與神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤密切相關(guān)。Guan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，凝血因子Ⅲ在人類腦膠質(zhì)瘤的血管發(fā)生過程中扮演重要角色。凝血因子Ⅲ在膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平與其血管供應(yīng)及惡性程度分級相關(guān)。在小鼠的動物實驗中也發(fā)現(xiàn)，通過不同方法減弱凝血因子Ⅲ的表達，可以有效地抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖[22,23]。在多個實驗?zāi)Ｐ椭幸沧C實凝血因子Ⅲ表達升高可以促進腫瘤生長[24]。在免疫缺陷小鼠動物實驗中發(fā)現(xiàn)，運用阻斷凝血因子Ⅲ表達的抗體之后可以減少血管形成、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達以及腫瘤生長[25]。同樣，在人類腫瘤中也進一步發(fā)現(xiàn)凝血因子Ⅲ的高表達與VEGF的高表達以及血管數(shù)增多相關(guān)[26]。目前的研究認為，組織因子參與腫瘤的機制可能與其促凝血功能和信號傳遞功能均相關(guān)。在腫瘤細胞中，凝血因子Ⅲ-凝血因子Ⅶa有促進細胞凋亡的作用，且該復(fù)合物可以調(diào)節(jié)PAR-2的激活，通過誘導(dǎo)一些促凝血物質(zhì)及免疫細胞因子、趨化因子、生長因子等，有助于形成腫瘤微環(huán)境。

可見，f3b基因表達下調(diào)斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)oLig-2表達減弱、Huc表達無明顯變化。

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泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院度科研項目(TZYKY-15-10)。

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R742

A

1002-266X(2016)35-0042-03

2015-10-06)