中藥砷劑活性代謝產物單甲基亞砷酸的生物學效應研究進展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

鄒建華1，付　娟1，陳　喆2（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006）

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中藥砷劑活性代謝產物單甲基亞砷酸的生物學效應研究進展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

鄒建華1，付娟1，陳喆2
（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006）

關鍵詞三氧化二砷；單甲基亞砷酸；生物學效應；研究進展

三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）俗稱砒霜，始載于宋《開寶本草》，其味苦酸，有毒，歸脾、肺、肝經，具有蝕瘡、去腐、殺蟲、劫痰定喘、劫瘧之功。砷是一種廣泛存在于人類生活環(huán)境中的致癌物質［1］，與包括皮膚癌、肺癌和膀胱癌在內的多種惡性腫瘤相關。近年來，As2O3被成功應用于治療急性早幼粒細胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）［2］。此外，砷可以誘導多種惡性腫瘤細胞凋亡。單甲基亞砷酸（MMAIII）是As2O3甲基化的活性代謝產物，大量研究表明MMAIII具有比As2O3更強的生物學活性［3-4］。低劑量短期作用表現明顯的抗腫瘤作用，長期慢性暴露在MMAIII下導致細胞惡性轉化?，F通過檢索國內外相關文獻，綜述As2O3代謝產物MMAIII的急性和慢性生物學效應。

1三氧化二砷體內代謝過程

砷是一種廣泛存在于人類生活環(huán)境中的致癌物質。近年研究發(fā)現As2O3在體內代謝有兩個關鍵過程：①五價砷被還原。五價砷被還原為三價狀態(tài)，主要通過砷酸鹽還原酶催化的酶促反應和谷胱甘肽催化的非酶促反應兩種途徑完成。②三價砷的甲基化。被還原為三價狀態(tài)的砷在肝臟甲基轉移酶的催化下生成單甲基砷酸（MMAV），在MMAV還原酶的作用下MMAV被還原為單甲基亞砷酸（MMAIII），MMAIII可以進一步被甲基化為二甲基亞砷酸（DMAIII）。在上述過程中，谷胱甘肽（GSH）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）發(fā)揮了重要的作用［5-6］。

2 MMAIII的急性生物學效應

2.1 MMAIII誘導內質網應激介導的腫瘤細胞凋亡

內質網應激（ERS）在細胞凋亡、生存、增殖和分化中發(fā)揮了重要的調控作用［7］。PERK是內質網上的一種跨膜蛋白，當ERS發(fā)生時PERK自身磷酸化為PPERK而被激活，進而通過級聯反應激活轉錄因子4 （activating transcription factor-4，ATF4）及下游重要的凋亡啟動蛋白CHOP的表達，誘導細胞凋亡［8-9］。有研究發(fā)現15 μM隱丹參酮（CPT）分別聯合1 μM MMAIII和1 μM As2O3協同作用乳腺癌MCF-7細胞，24 h后MTT法檢測發(fā)現MMAIII聯合CPT協同抗乳腺癌MCF-7細胞效果明顯優(yōu)于As2O3聯合CPT。Western blot檢測MMAIII聯合CPT協同作用1 h后P-PERK蛋白表達顯著增高，并且呈時間依賴性促進下游蛋白ATF4及CHOP的表達，進而誘導促凋亡蛋白Bax、Bak的活化和細胞色素C的釋放，引起MCF-7細胞凋亡［10］。

2.2 MMAIII通過泛素化蛋白酶系統誘導P53蛋白降解引起細胞凋亡

P53是一種重要的抑癌基因，其編碼產物參與細胞周期調控［11-12］。大量研究表明，被泛素化的P53蛋白最終在細胞質內通過Mdm2泛素化蛋白酶系統降解，進而發(fā)揮對細胞周期的調控作用［12-16］。槲皮素聯合MMAIII作用正常角質HaCaT細胞后通過誘導P53蛋白泛素化促進HaCaT細胞凋亡發(fā)生［17］。

2.3 MMAIII通過抑制線粒體功能誘導細胞凋亡

大量文獻報道線粒體在凋亡的早期即出現結構與功能的變化，包括通透性轉運孔（permeability transition pore，PTP）的開放和跨膜電位（mitochondrial transmembrane potential，MTP）的耗散。另有研究表明MMAIII影響線粒體通透性轉換孔的功能促進線粒體內膜的Ca2+內流，引起線粒體腫脹、細胞色素C釋放，誘導細胞凋亡發(fā)生［18］。已有研究報道，MMAIII抑制大鼠肝臟RLC16細胞線粒體呼吸鏈復合物II和IV的活性，誘導活性氧（ROS）的產生，促進細胞凋亡［19］。

2.4 MMAIII增強血管收縮引起血壓升高

高血壓與中風、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，大量流行病學證據表明，砷暴露與高血壓在內的多種心血管系統疾病密切相關。Lim K M等［20］將新鮮分離的大鼠主動脈環(huán)暴露于MMAIII（＜0.5 μM）發(fā)現可以增強激動劑誘導的血管收縮和升壓反應，Western blot檢測發(fā)現MMAIII呈時間和濃度依賴性促進苯腎上腺素（phenylephrine，PE）對RhoA的活化，進而說明MMAIII增強血管收縮引起高血壓與RhoA的激活密切相關。

2.5 MMAIII誘導血小板凋亡，促進血栓形成

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露在細胞外膜是激活凝血的重要過程，也被認為是細胞凋亡的標記之一［21］。Bae O N等［22］利用50 μM MMAIII作用人血小板1 h后發(fā)現PS外翻增加，線粒體膜電位改變，凋亡蛋白表達增多。上述過程中PS外翻與蛋白質的巰基和細胞內ATP水平下降有關，加入NAC和L-半胱氨酸等巰基化合物后可以明顯逆轉上述反應。這意味著蛋白質的巰基和ATP的耗竭可能有助于MMAIII誘導PS外翻，誘導血小板凋亡，促進血栓形成。

2.6 MMAIII抑制T細胞的增殖影響免疫系統的功能

體內外實驗研究證明,環(huán)境中的亞砷酸鹽會影響免疫功能，砷通過飲用水暴露在人群中，對人體T細胞免疫功能產生影響，而免疫抑制與感染、癌癥和其他疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。Burchiel S W等［23］將30個正常捐贈者血液中的T細胞暴露于1 nM～100 nM的MMAIII和NaAsO254 h后發(fā)現100 nM的NaAsO2對大多數捐贈者的T細胞沒有明顯的增殖抑制作用，但是100 nM MMAIII能明顯抑制所有捐贈者T細胞的增殖，進而影響捐贈者的免疫功能。

2.7 MMAIII急性暴露后抑制膽固醇的合成

膽固醇是人類細胞膜的重要組成部分，膽固醇合成不足可以影響細胞膜的穩(wěn)定性。Guo L等［24］利用定量蛋白質組學檢測MMAIII作用人類皮膚成纖維細胞GM00637后蛋白組學的變化情況，發(fā)現MMAIII可以下調膽固醇合成酶，使內源性膽固醇的合成減少。

3 MMAIII的慢性生物學效應

3.1 MMAIII長期暴露活化COX-2，促進膀胱細胞惡性轉變

COX-2是負責類花生酸合成的誘導酶，在促進細胞增殖、抑制細胞死亡、誘導血管生成和促進轉移侵襲中發(fā)揮調控［25-26］。Src、PI3K、COX-1、COX-2信號通路與MMAIII誘導的UROtsa細胞非貼壁性生長密切相關。提示COX-2或COX-2介導的信號轉導通路在MMAIII誘導膀胱上皮細胞惡性轉化中發(fā)揮重要作用。

3.2 MMAIII長期暴露促進炎癥相關因子釋放，引起炎癥反應

炎癥反應常被認為是一種對機體有害的生物學現象［27］，Virchow最初觀察到被特定化學刺激物引發(fā)的組織炎癥與細胞增生程度增強有關，提出慢性炎癥與癌變之間存在關聯［28］。細胞壞死時細胞膜破裂，細胞質釋放到鄰近細胞引起炎癥反應。大量文獻表明，MMAIII可以促進多種炎癥因子的釋放，進而激活細胞內多種信號通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究報道50 nM MMAIII作用于UROtsa細胞3個月后可以刺激TNFα、IL-6、IL-8等炎癥因子的釋放，引起炎癥反應［29］。UROtsa細胞長期暴露在MMAIII中發(fā)現炎癥相關因子（IL-1β，IL-6 and IL-8）分泌增多，其中IL-8尤為明顯。IL-8可以進一步激活NFKβ、AP1/cjun、ERK2、STAT3等炎癥相關基因表達上調，基因沉默IL-8后可以逆轉該現象［30］。上述結果表明IL-8介導了MMAIII促進UROtsa細胞惡性轉化。

3.3 MMAIII長期暴露后影響DNA修復功能

細胞的惡性變與DNA的損傷有著密切的關系，DNA損傷修復有多種酶參與，PARP-1是參與DNA堿基切除修復啟動的關鍵酶。Wnek S M等［31］發(fā)現MMAIII連續(xù)處理UROtsa細胞8 w、12 w后可顯著增加DNA單鏈的斷裂，斷裂的DNA可以迅速激活PARP-1，PARP-1的修復作用主要依賴于其N末端與DNA結合區(qū)域的兩個鋅指結構。MMAIII可以競爭性與兩個鋅指結構結合，從而抑制PARP-1蛋白功能，引起DNA損傷，促進UROtsa細胞惡性轉化。

4問題與展望

目前，小分子藥物靶點的發(fā)現對于生物和醫(yī)學具有重大意義，研究小分子化合物與蛋白質分子間的相互作用已成為熱點。MMAIII作為As2O3的小分子甲基化代謝產物，具有比As2O3更強的生物學效應，但其分子學作用機制仍不明確。大量體外實驗表明MMAIII抗腫瘤效果明顯優(yōu)于As2O3，且其毒副反應更小。盡管As2O3成功用于臨床治療APL等多種惡性腫瘤，但MMAIII的臨床應用文獻報道甚少。闡明MMAIII分子作用機制為中藥砷劑的深入研究，指導臨床治療用藥是我們目前亟待解決的問題。隨著對中藥砷劑研究的不斷深入，人們對其活性代謝產物MMAIII的認識不斷加深，這為其臨床應用和新藥開發(fā)提供了理論依據，MMAIII具有廣闊的臨床應用前景。

參考文獻

［1］Jo W J，Loguinov A Wintz H，Chang M，et al. Comparative functionalgenomic analysis identifies distinct and overlapping sets ofgenes required for resistance to monomethylarsonous acid（MMAⅢ）and arsenite（AsⅢ）in yeast［J］. Toxicological Sciences，2009，111（2）：424-436.

［2］Zhu J，Koken M H，Quignon F，et al. Arsenic-induced PML targeting onto nuclear bodies：implications for the treatment of acute promyelocytic leukemia［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（8）：3 978-3 983.

［3］Petrick J S，Ayala-Fierro F，Cullen W R，et al. Monomethylarsonous acid［MMA（Ⅲ）］is more toxic than arsenite in Chang human hepatocytes［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2000，163（2）：203-207.

［4］Wanibuchi H，Hori T，Meenakshi V，et al. Promotion of rat hepatocarcinogenesis by dimethylarsinic acid：association with elevated ornithine decarboxylase activity and formation of 8-hydroxydeoxyguanosine in the liver［J］. Japanese Journal of Cancer Research，1997，88（12）：1 149-1 154.

［5］李冰，皮靜波，孫貴范.甲基亞砷酸—一種毒性更強的無機砷代謝中間產物［J］.中國地方病學雜志，2001（3）：27.

［6］王利紅，尹西翔，段桂蘭，等.生物體砷代謝解毒機制的研究進展［J］.安徽農業(yè)科學，2009（17）：62.

［7］Huang H M，Zhang H，Ou H C，et al. alpha-keto-beta-methyl-n-valeric acid diminishes reactive oxygen species and alters endoplasmic reticulum Ca2+stores［J］. Free Radical Biology & Medicine，2004，37（11）：1 779-1 789.

［8］Fels D R，Koumenis C. The PERK/eIF2 alpha/ATF4 module of the UPR in hypoxia resistance and tumorgrowth［J］. Cancer Biology & Therapy，2006，5 （7）：723-728.

［9］Malhotra J D，Kaufman R J. The endoplasmic reticulum and the unfolded protein response［J］. Seminars in Cell & Developmental Biology，2007，18 （6）：716-731.

［10］Zhang Y F，Zhang M，Huang X L，et al. The combination of arsenic and cryptotanshinone induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in breast cancer cells［J］. Metallomics，2015，7（1）：165-173.

［11］Moll U M，Petrenko O. The MDM2-p53 interaction［J］. Molecular Cancer Research，2003，1（14）：1 001-1 008.

［12］Yang Y，Li C C，Weissman A M. Regulating the p53 system through ubiquitination［J］. Oncogene，2004，23（11）：2 096-2 106.

［13］Vogelstein B，Lane D，Levine A J. Surfing the p53 network［J］. Nature，2000，408（6 810）：307-310.

［14］Pickart C M，Eddins M J. Ubiquitin：structures，functions，mechanisms［J］. Biochim Biophysica Acta，2004，1 695（1-3）：55-72.

［15］Smalle J，Vierstra R D. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway［J］. Annual Review of Plant Biology，2004（55）：555-590.

［16］Roos-Mattjus P，Sistonen L. The ubiquitin-proteasome pathway［J］. Annals of Medicine，2004，36（4）：285-295.

［17］Shen S C，Lee W R，Yang L Y，et al. Quercetin enhancement of arsenic-induced apoptosis via stimulating ROS-dependent p53 protein ubiquitination in human HaCaT keratinocytes［J］. Experimental Dermatology，2012，21（5）：370-375.

［18］Naranmandura H，Chen X，Tanaka M，et al. Release of apoptotic cytochrome C from mitochondria by dimethylarsinous acid occurs through interaction with voltage-dependent anion channel in vitro［J］. Toxicological Sciences，2012，128（1）：137-146.

［19］Naranmandura H，Xu S，Sawata T，et al. Mitochondria are the main target organelle for trivalent monomethylarsonous acid［MMA（Ⅲ）］-induced cytotoxicity［J］. Chemical Research in Toxicology，2011，24（7）：1 094-1 103.

［20］Lim K M，Shin Y S，Kang S，et al. Potentiation of vasoconstriction and pressor response by low concentration of monomethylarsonous acid［MMA（Ⅲ）］［J］. Toxicology Letters，2011，205（3）：250-256.

［21］Lentz B R. Exposure of platelet membrane phosphatidylserine regulates blood coagulation［J］. Progress in Lipid Research，2003，42（5）：423-438.

［22］Bae O N，Lim K M，Noh J Y，et al. Trivalent methylated arsenical-induced phosphatidylserine exposure and apoptosis in platelets may lead to increased thrombus formation［J］. Toxicology and Applied Pharmacology，2009，239（2）：144-153.

［23］Burchiel S W，Lauer F T，Beswick E J，et al. Differential susceptibility of human peripheral blood T cells to suppression by environmental levels of sodium arsenite and monomethylarsonous acid［J］. Plos One，2014，9（10）：e109 192.

［24］Guo L，Xiao Y，Wang Y. Monomethylarsonous acid inhibited endogenous cholesterol biosynthesis in human skin fibroblasts［J］. Toxicology and Applied Pharmacology，2014，277（1）：21-29.

［25］Eblin K E，Bredfeldt Tg，Buffington S，et al. Mitogenic signal transduction caused by monomethylarsonous acid in human bladder cells：role in arsenic-induced carcinogenesis［J］. Toxicological Sciences，2007，95（2）：321-330.

［26］Eblin K E，Jensen T J，Wnek S M，et al. Reactive oxygen species regulate properties of transformation in UROtsa cells exposed to monomethylarsonous acid by modulating MAPK signaling［J］. Toxicology，2009，255（1-2）：107-114.

［27］Marting R，Wallace J L.gastrointestinal inflammation：a central component of mucosal defense and repair［J］. Experimental Biology and Medicine，2006，231（2）：130-137.

［28］Coussens L M，Werb Z. Inflammation and cancer［J］. Nature，2002，420（6 917）：860-867.

［29］Calatayud M，Gimeno-Alcaniz J V，Velez D，et al. Trivalent arsenic species induce changes in expression and levels of proinflammatory cytokines in intestinal epithelial cells［J］. Toxicology Letters，2014，224（1）：40-46.

［30］Escudero-Lourdes C，Wu T，Camarillo J M，et al. Interleukin-8（IL-8）over-production and autocrine cell activation are key factors in monomethylarsonous acid［MMA（Ⅲ）］-induced malignant transformation of urothelial cells［J］. Toxicology and Applied Pharmacology，2012，258 （1）：10-18.

［31］Wnek S M，Kuhlman C L，Camarillo J M，et al. Interdependentgenotoxic mechanisms of monomethylarsonous acid：role of ROS-induced DNA damage and poly（ADP-ribose）polymerase-1 inhibition in the malignant transformation of urothelial cells［J］. Toxicology and Applied Pharmacology，2011，257（1）：1-13.

（編輯：張世霞）

中圖分類號：R282.76

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0073-03

［基金項目］國家自然科學基金（81473389）

［作者簡介］鄒建華，在讀碩士，E-mail：2836088573@qq.com

［通訊作者］陳喆，副研究員，研究生導師，E-mail：alexisczh@sohu.com