基于多種信號放大策略的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究進展

王海軍，袁若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

基于多種信號放大策略的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究進展

王海軍，袁若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器技術(shù)，結(jié)合了ECL分析技術(shù)的高靈敏度和高可控性與生物識別的高特異性，能顯著提高生物分子檢測的靈敏度和選擇性，在臨床檢驗學(xué)等研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。提高檢測靈敏度一直都是ECL生物傳感領(lǐng)域共同的追求目標(biāo)。目前，研究者們通過引入具有優(yōu)良性質(zhì)的納米材料、酶、DNA等生物放大技術(shù)，或研究尋找新型的、具有高發(fā)光效率的且生物兼容性好的ECL試劑，并改善發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑的存在與作用方式等來提高ECL傳感器的檢測靈敏度，并取得了較好的效果。該文主要綜述了近幾年ECL生物傳感器構(gòu)建中常用的信號放大策略。

電致化學(xué)發(fā)光；生物傳感器；信號放大策略

0 引言

由于其較低的背景信號，較高的靈敏度以及良好的可控性，電致化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器廣泛應(yīng)用于疾病診斷與治療、食品分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，并在逐步實現(xiàn)商業(yè)化[1-2]。它主要是將ECL試劑置于檢測底液、固載于電極表面或直接作為信號標(biāo)記，通過生物分子間的特異性識別形成復(fù)合物之后ECL信號的變化來實現(xiàn)目標(biāo)生物分子的定量分析，具有很高的選擇性、靈敏度及穩(wěn)定性。在ECL生物傳感器的構(gòu)建中，如何有效地實現(xiàn)信號放大并提高檢測靈敏度是其更好應(yīng)用的關(guān)鍵性問題。該文主要綜述了近幾年在ECL生物傳感器構(gòu)建中的幾種主要的信號放大策略。

1 利用不同納米材料的固載與催化

納米材料被認(rèn)為是21世紀(jì)最有前途的材料，其應(yīng)用價值顯而易見。廣義而言，它所指的是三維空間中至少有一維處于1～100 nm之間的或者由其作為基本結(jié)構(gòu)單元而形成的材料。而納米材料所具有的性質(zhì)與這些基本結(jié)構(gòu)單元的特性緊密相關(guān)。這種介于宏觀與微觀之間的新物質(zhì)表現(xiàn)出了許多特殊的性質(zhì)，包括量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)及小尺寸效應(yīng)等，隨之呈現(xiàn)出良好的電、光、磁和化學(xué)催化性質(zhì)，以及比表面積大、導(dǎo)電能力強與生物兼容性好等特性。正是基于此，納米材料已廣泛地運用于陶瓷、軍事、電子學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品加工及化工等領(lǐng)域。在生物電分析方面，其作用主要分為以下幾個方面：首先，基于其較大的比表面積，納米材料可以很好地作為各種生物分子的載體；其次，由于其良好的生物兼容性，納米材料在作為固載平臺的同時可以很好地保持生物分子的活性，如酶、蛋白質(zhì)、核酸等；再次，基于其良好的導(dǎo)電性，納米材料可以很好地促進體系的電子傳遞；另外，研究表明，很多納米材料還具有各種特殊的催化功能（如，電催化、過氧化氫催化分解等）。所以，在ECL生物傳感器的構(gòu)建中，納米材料也扮演著舉足輕重的作用[3]。下面列舉了幾種不同的納米材料在ECL生物傳感器構(gòu)建中的應(yīng)用。

貴金屬納米材料是指Au、Ag、Pt、Pd等一類的納米尺寸級別的材料。它具有優(yōu)良的導(dǎo)電性、生物兼容性及電催化活性，被廣泛地用于ECL生物傳感器的構(gòu)建[4-6]。前面所提到的貴金屬納米簇就是極具代表性的一種，基于其本身的發(fā)光特性，可直接應(yīng)用于ECL生物傳感器的構(gòu)建。除此之外，貴金屬納米材料在ECL生物傳感器中應(yīng)用最多的還是其固載與催化功能。Zhou等[7]以氯金酸及氯鉑酸為母體，以發(fā)光試劑魯米諾作為還原劑，經(jīng)連續(xù)還原過程制得了花狀的Pt@Au合金材料（Pt@AuNFs）。在該制備過程中，不僅得到了比表面積大、電催化活性好的花狀貴金屬合金材料，且在合成過程中成功實現(xiàn)了發(fā)光試劑魯米諾的固載，簡化了實驗操作。以所得的Pt@AuNFs為支撐，固載膽堿氧化酶（ChOx）及二抗蛋白制得了檢測心肌肌鈣蛋白（cTnI）的夾心型ECL免疫傳感器。在含有膽堿的底液中進行測定時，膽堿氧化酶催化膽堿生成過氧化氫，而Pt@AuNFs具有仿辣根過氧化物酶（HRP）的作用可催化氧化氫分解，從而極大地促進魯米諾的ECL信號，實現(xiàn)對目標(biāo)物的靈敏檢測（如圖1所示）。Li等[8]利用魯米諾作為還原劑制備納米金并固載適體鏈，并基于堿基互補配對在電極表面形成了類似于網(wǎng)狀的DNA結(jié)構(gòu)。該方法不僅在制備納米金的同時實現(xiàn)了魯米諾的固載，也通過DNA雜交成功實現(xiàn)了魯米諾功能化納米金的固載量的提高?；诖耍晒χ苽淞遂`敏檢測凝血酶的ECL適體傳感器（如圖2所示）。

圖1 基于Pt@AuNFs二抗復(fù)合物的制備及用于檢測cTnI的ECL免疫傳感器的構(gòu)建[7]Fig.1The preparation of Ab2/luminol–Pt@AuNFs/ChOx probes and the construction of the ECL immunosensor for cTnI.Copyright 2014 RSC

圖2 基于luminol-AuNPs的ECL適體傳感器的制備示意圖[8]Fig.2Schematic illustration for the fabrication of the ECL aptasensor based on luminol-AuNPs.Copyright 2013 Elesiver

碳是組成有機體的基本元素之一。碳納米材料是納米材料家族中極其重要的一類。由于其比表面積大，穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)強度高及來源豐富等優(yōu)點，它一直都受到極大的關(guān)注[9]。目前，在ECL生物傳感器的構(gòu)建中，石墨烯（Graphene）[10]、碳納米管(Carbon nanotubes)[11]、富勒烯（C60, Fullerene）[12]及各種基于碳源的量子點[13]等得到了廣泛地應(yīng)用。Zhao等[14]利用牛血清白蛋白（BSA）修飾富勒烯（C60）使其表面富含大量氨基，經(jīng)Au-N鍵修飾上金納米顆粒后得到Au@nano-C60納米復(fù)合物。如此，使C60的溶解性、生物兼容性及對ECL的催化能力都得到了極大的提高，且易于進一步功能化。基于該C60的復(fù)合納米材料及S2O82--O2ECL體系，構(gòu)建了檢測小分子卡那霉素的“on-off-on”型ECL適體傳感器（如圖3所示）。

圖3 基于納米金修飾的C60納米復(fù)合物的ECL適體傳感器的構(gòu)建示意圖[14]Fig.3The construction of the ECL aptasensor based on Au@nano-C60.Copyright 2015 Elsevier

Zhu等[15]利用納米金修飾黑碳摻雜的還原石墨烯（Au-rGO@CB）作為一抗固載基質(zhì)，并用多孔狀的銀納米材料固載Ru(bpy)32+及二抗蛋白（NPS-Ru(bpy)32+-Ab2）作為信號標(biāo)記。從而構(gòu)建了夾心型的ECL免疫傳感器，并實現(xiàn)了甲胎蛋白AFP的靈敏檢測（如圖4所示）。眾多類似于此工作的研究表明，通過表面修飾、元素?fù)诫s等手段可以選擇性地改善碳納米材料的相關(guān)性能以滿足實際要求，為該類材料的更廣泛的應(yīng)用提供了可能。

半導(dǎo)體納米材料和磁性納米材料也是在ECL生物傳感器中應(yīng)用非常廣泛的材料[16-17]。其中半導(dǎo)體納米材料最典型的代表是各種具有ECL性質(zhì)的量子點，通過簡單的修飾及后處理即可直接用于ECL傳感器的構(gòu)建。而磁性納米材料主要是用于相關(guān)材料及傳感器制備過程中的分離，且某些磁性材料還具有ECL催化作用。Dong等[18]合成了CdSe@ZnS復(fù)合量子點，并將其作為能量受體，魯米諾作為能量供體，構(gòu)建了ECL適體傳感器。在溶液中魯米諾與電極表面CdSe@ZnS復(fù)合量子點的高效能量轉(zhuǎn)移下，所制備的適體傳感器成功實現(xiàn)了對凝血酶的超靈敏檢測（如圖5所示）。

圖4 生物耦合物Au-rGO@CB-Ab1(A),NPS-Ru(bpy)32+-Ab2的制備(B)及ECL適體傳感器的構(gòu)建示意圖[15]Fig.4The preparation procedure of Au-rGO@CB-Ab1(A), NPS-Ru(bpy)32+-Ab2(B)and the construction of the sandwich-type ECL immunosensor(C).Copyright 2016 Nature

圖5 用于測定凝血酶的ECL適體傳感器的構(gòu)建示意圖[18]Fig.5The construction of the thrombin ECL biosensor. Copyright 2014 ACS

Wang等[19]以四氧化三鐵為載體，并在其表面利用發(fā)光試劑魯米諾作為還原劑原位還原納米金，形成了發(fā)光功能化的磁性納米復(fù)合物（Lu-AuNPs@Fe3O4）。用此磁性納米復(fù)合物固載二抗蛋白作為信號標(biāo)記，并用金納米顆粒功能化的氧化鋅（AuNPs@ZnO）固載一抗，經(jīng)夾心免疫反應(yīng)制得信號增強型的ECL免疫傳感器，并實現(xiàn)了對黏蛋白（mucin-1）的檢測（如圖6所示）。磁性納米材料Fe3O4在該傳感器的構(gòu)建中不僅能作為二抗復(fù)合物的載體，還能催化過氧化氫的分解，顯著提高了傳感器檢測的靈敏度。

圖6 基于Lu-AuNPs@Fe3O4磁性納米材料的ECL免疫傳感器的構(gòu)建[19]Fig.6The construction of the ECL immunosensor based on Lu-AuNPs@Fe3O4.Copyright 2015 Elsevier

2 引入生物相關(guān)輔助放大策略

生物相關(guān)輔助放大策略，如酶催化、DNA相關(guān)信號放大手段（雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴增、目標(biāo)物循環(huán)及滾環(huán)放大等），是在生物傳感器中應(yīng)用非常廣泛的一類方法[20-21]。同樣，在ECL生物傳感器的構(gòu)建中，引入上述生物輔助放大手段，也可更好地提高檢測靈敏度及檢測效率。

Chen等[22]基于目標(biāo)DNA鏈引發(fā)的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）在電極表面制備了大量的且無限延伸的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。所形成的大量的雙鏈結(jié)構(gòu)為發(fā)光物質(zhì)鄰菲羅啉釕（Ru(phen)32+）提供了豐富的嵌入位點，顯著提高了Ru(phen)32+在電極表面的固載量，從而明顯提高了目標(biāo)DNA的檢測靈敏度及檢測效率（傳感器的制備如圖7所示）。

圖7 基于HCR的DNA ECL生物傳感器的制備[22]Fig.7Illustration of the sensitive HCR-based ECL biosensor for detection of DNA.Copyright 2012 ACS

Xu等[23]在溶液中以Fe3O4/AuNPs復(fù)合納米材料為支撐，經(jīng)夾心免疫反應(yīng)和Pb2+剪切后將目標(biāo)抗原（cTnI）的濃度轉(zhuǎn)化為間接檢測物DNA分子步行器（DNA Walker）的濃度。然后，在電極表面通過Au-S鍵將修飾有二茂鐵的DNA雙鏈組裝在鍍金玻碳電極上，并嵌入大量的發(fā)光物質(zhì)多吡啶釕。此時，因二茂鐵對多吡啶釕ECL信號的淬滅作用，體系ECL信號極低（關(guān)”狀態(tài)）。當(dāng)將所制備的DNA分子步行器被滴加到電極表面之后，DNA Walker與二茂鐵修飾的DNA互補配對，經(jīng)Nt.AlwI核酸內(nèi)切酶識別、剪切后，DNA Walker繼續(xù)與下一段二茂鐵修飾的DNA互補配對，從而再次被Nt.AlwI核酸內(nèi)切酶識別、剪切。如此重復(fù)，二茂鐵修飾的DNA被先后剪切掉，多吡啶釕的ECL信號得到恢復(fù)（“開”狀態(tài)）。通過上述方法，構(gòu)建了一種基于DNA Walker的“關(guān)-開”型ECL免疫傳感器，通過目標(biāo)檢測物cTnI到間接檢測物DNA分子步行器的轉(zhuǎn)化，得到ECL信號強度與cTnI的定量關(guān)系，實現(xiàn)了對cTnI的高靈敏檢測（傳感器的制備如圖8所示）。

圖8 基于DNA walker的ECL免疫傳感器的構(gòu)建[23]Fig.8Principles of the ECL biosensor based on DNA walker.Copyright 2015 RSC

3 尋找新型高效的電致化學(xué)發(fā)光試劑及共反應(yīng)試劑

ECL試劑與其對應(yīng)的共反應(yīng)試劑是ECL兩大基本要素。所以，在ECL技術(shù)發(fā)展的過程中，對新型發(fā)光試劑及高效共反應(yīng)的試劑的探索一直都是研究的重點。目前，研究比較成熟且應(yīng)用較為廣泛的ECL試劑有：聯(lián)吡啶釕及其衍生物、魯米諾及其衍生物以及一些金屬量子點（如CdTe及CdS等）。對于這些發(fā)光試劑常用的共反應(yīng)試劑包括胺類物質(zhì)（如三丙胺TPA）、過氧化氫（H2O2）、過硫酸根（S2O82-）及氧氣（O2）等。為了尋求發(fā)光效率更高、穩(wěn)定性更強、生物兼容性更好且更易功能化的發(fā)光試劑，以及生物毒性更小、催化效率更高且更易標(biāo)記的新型共反應(yīng)試劑，研究者們做著不斷地努力。

例如，近期以三聚氰胺為碳源制備的類石墨烯的g-C3N4，作為一種新型的發(fā)光材料，就受到了廣泛的關(guān)注[24-25]。Chen等[26]用納米金修飾所制備的具有層狀結(jié)構(gòu)的g-C3N4形成Au-g-C3N4NHs復(fù)合納米材料。直接將該納米復(fù)合物修飾于電極表面并固載抗體，并將共反應(yīng)試劑過硫酸根（S2O82-）置于檢測底液之中，就制得了檢測癌胚抗原CEA的免標(biāo)記型ECL免疫傳感器（如圖9所示）。方案中，納米金不僅很好地改善了g-C3N4的溶解性及穩(wěn)定性，而且其良好的導(dǎo)電性很好地促進了g-C3N4的ECL信號，提高了檢測靈敏度。

圖9 Au-g-C3N4NHs的ECL機理(A)及ECL免疫傳感器的構(gòu)建(B)[26]Fig.9(A)The ECL mechanism of the Au-g-C3N4NHs in the presensce of S2O82-(B)The construction of the ECL immunosensor based on Au-g-C3N4.Copyright 2014 ACS

4 提高發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑的固載并改善二者的作用效率

在研究之初，通常將ECL試劑或共反應(yīng)試劑置于檢測底液中。然而，這種方式不但增加了試劑用量，而且一些發(fā)光試劑及共反應(yīng)試劑具有毒性大、易揮發(fā)的缺點，增加了操作難度及測量誤差。故而，探尋發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑的新型固載方式，在節(jié)約試劑用量的同時，提高二者的固載量，改善二者與電極間電子傳遞效率，是提高ECL檢測靈敏度的有效方式。

Liao等[27]使用含具有良好成膜性質(zhì)的全氟磺酸-聚四氟乙烯（Nafion）的納米混合溶液修飾電極，經(jīng)靜電吸附將發(fā)光試劑Ru(bpy)32+固載于電極表面，再修飾上納米金之后即可固載一抗蛋白。同時，利用脫鐵蛋白包裹共反應(yīng)試劑聚乙烯亞胺（PEI）并將其負(fù)載于碳納米管上固載二抗蛋白。經(jīng)夾心免疫反應(yīng)后，制得了信號增強型的檢測人絨毛膜促性腺激素（HCG）的ECL免疫傳感器（如圖10所示）。該方案同時實現(xiàn)了發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑的固載，并且在不同的pH作用下，脫鐵蛋白可以解體并釋放出PEI，極大地增強了Ru(bpy)32+的ECL信號，提高了檢測靈敏度。

圖10 檢測HCG的ECL免疫傳感器的構(gòu)建[27]Fig.10The construction of the ECL immunosensor for detection of HCG.Copyright 2012 RSC

與上述例子類似，在ECL生物傳感器的構(gòu)建中，發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑的固載通常會引入各種比表面積大、生物兼容性好的納米材料作為支撐。為了進一步提高固載量，研究者們做了很多嘗試。如，Li等[28]直接利用常用的發(fā)光試劑Ru (bpy)32+為母體，經(jīng)溶劑蒸發(fā)誘導(dǎo)的自成核過程形成線狀的納米材料（如圖11所示）。相比于單分子狀態(tài)的Ru(bpy)32+，通過這種自成核方式制備的納米結(jié)構(gòu)的發(fā)光體顯著提高了Ru(bpy)32+分子的固載量及ECL效率，也使得基于該納米材料所構(gòu)建的ECL傳感器的靈敏度明顯增加。這也為其它發(fā)光試劑及共反應(yīng)試劑的固載提供了很好的思路。

圖11 RuNWs的制備示意圖[28]Fig.11Schematic illustration for the formation of the RuNWs.Copyright 2012 Wiley

研究表明，通過吸附、交聯(lián)、包埋或嵌入等方式可以將發(fā)光試劑或共反應(yīng)試劑固載于電極表面。然而，不同固載方式的固載效率卻存在很大的差別。并且，一些物質(zhì)易溶于水、易揮發(fā)、難標(biāo)記的缺點（如TPrA、H2O2、O2、S2O82-等）使其難于固載。所以，如何更好地提高共反應(yīng)試劑對發(fā)光試劑的作用效率是另一關(guān)鍵問題。2015年，Ma等[29]提出了共反應(yīng)促進劑（co-reaction accelerator）的概念，即指一類對發(fā)光試劑-共反應(yīng)試劑體系有促進作用的一類物質(zhì)。CdTe QDs-S2O82-是一種研究較成熟的ECL共反應(yīng)體系。Ma等在研究中發(fā)現(xiàn)，向CdTe QDs-S2O82-體系中加入氨基脲（Sem）后，Sem可以很好地促進共反應(yīng)試劑S2O82-的氧化，并催化CdTe QDs-S2O82-的ECL反應(yīng)?；诖?，研究中構(gòu)建了信號增強型的、并用于檢測凝血酶的ECL適體傳感器（如圖12所示）。體系中Sem就是S2O82-的共反應(yīng)促進劑，在其作用下傳感器的檢測靈敏度得到了極大的提高。

圖12 適體傳感器的制備過程及可能的發(fā)光機理示意圖[29]Fig.12Preparation process illustration of ECL aptasensor and possible luminescence mechanism. Copyright 2015 ACS

利用酶催化反應(yīng)原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑，不僅可以解決某些共反應(yīng)試劑難標(biāo)記、不穩(wěn)定等缺點，還可很好地提高其對發(fā)光試劑的催化效率。Kurita等[30]在電極表面利用乙酰膽堿酯酶催化底物乙酰硫膽堿反應(yīng)產(chǎn)生硫膽堿，并通過Au-S使其在電極表面累積。當(dāng)發(fā)光試劑Ru(bpy)32+存在時，硫膽堿作為共反應(yīng)試劑極大地增強了ECL強度（如圖13所示）。

圖13 基于酶催化反應(yīng)的ECL傳感器的構(gòu)建示意圖[30]Fig.13Schematic illustration of methyl-cytosine determination with the ECL method.Copyright 2012 ACS

然而，通過各種固載及酶催化反應(yīng)等方式雖然在一定程度上增強了ECL強度、減少了誤差，但仍存在以下不足：（1）基于表面固載和酶催化原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的方法獲得的ECL穩(wěn)定性不理想，且酶存在易失活、反應(yīng)條件苛刻等問題；（2）共反應(yīng)試劑與發(fā)光試劑分子間的相互作用通常伴有能量損失，且存在電子傳遞速度慢、效率低等缺點，限制了發(fā)光強度的提高。鑒于此，自增強型ECL試劑被提了出來，即是指在分子結(jié)構(gòu)中同時含有發(fā)光基團及共反應(yīng)基團的分子。這種自增強分子將發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑兩個分子之間的相互作用轉(zhuǎn)換到同一分子內(nèi)的不同基團的相互作用，從而縮短了兩個作用基團的作用距離、減少了能量損失，顯著增強了發(fā)光試劑的ECL強度。例如，一些基于釕配合物的自增強型ECL試劑如圖14所示[31]。將這種自增強型的ECL試劑引入到ECL生物傳感器的構(gòu)建中可簡化操作步驟、并顯著提高檢測的靈敏度。然而，有關(guān)這類型的ECL試劑的研究尚處于起步階段，關(guān)于其結(jié)構(gòu)特點和發(fā)光效率增強的作用機制尚不完全明確。因此，設(shè)計分子結(jié)構(gòu)合理的自增強型ECL分子，探討其發(fā)光作用機制及其在ECL生物傳感器構(gòu)建中的應(yīng)用研究具有重要的理論意義和實用價值。

圖14 一些自增強型釕配合物結(jié)構(gòu)圖[31]Fig.14Structures of some self-enhanced ruthenium(II) tris-bipyridyl complexes.Copyright 2009 RSC

5 展望

近年來，ECL生物傳感器的研究得到了飛速的發(fā)展，在傳感器的設(shè)計、分析性能以及應(yīng)用范圍等研究方面取得了顯著的進展，并被廣泛地應(yīng)用于各種疾病相關(guān)生物分子的靈敏檢測。然而，隨著臨床檢驗學(xué)的進一步發(fā)展，對分析方法的構(gòu)建提出了更高的要求，也促使ECL生物傳感器相關(guān)研究的進一步發(fā)展。如何制備新的具有更高靈敏度、選擇性及特異性的ECL生物傳感器，并不斷實現(xiàn)微型化、功能多樣化及集成化是后面所要解決的主要問題。

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Progress of electrochemiluminescence biosensor based on multiple signal amplification strategies

Wang Hai-jun,Yuan Ruo*
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Electrochemiluminescence(ECL)immunoassay technology,combined the high sensitivity and controllability of ECL analysis technique with high specificity of biological recognition,can significantly improve the detection sensitivity and selectivity of biological molecules,which shows great potential in clinical laboratory science.Improving the detection sensitivity has become common goal in the construction of ECL biosensor.Currently,by introducing nano-materials with excellent properties,enzymes,DNA and other biological amplification technology,finding new ECL reagents with high luminous efficiency and improving reaction efficiency of co-reagents,researchers constructed a lot of ECL biosensors with high detection sensitivity.This paper mainly reviews some commonly used signal amplification strategies in the construction of ECL biosensors in recent years.

electrochemiluminescence;biosensor;signal amplification strategies

國家自然科學(xué)基金資助項目(21575116,21275119,51473136)

*通信聯(lián)系人,E-mail:yuanruo@swu.edu.cn