基于目標(biāo)物循環(huán)放大和DNA 分子機(jī)器的電致化學(xué)發(fā)光microRNA 傳感器的研究

蒲楠平，張璞，卓穎*

（1.西南大學(xué)附屬中學(xué)，重慶 400715）（2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

基于目標(biāo)物循環(huán)放大和DNA 分子機(jī)器的電致化學(xué)發(fā)光microRNA 傳感器的研究

蒲楠平1，張璞2，卓穎2*

（1.西南大學(xué)附屬中學(xué)，重慶 400715）（2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

該研究首次將DNA分子機(jī)器—DNA納米鑷子引入到ECL傳感體系中，并設(shè)計(jì)構(gòu)建了新型的DNA酶誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)放大的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，用于超靈敏檢測(cè)癌癥細(xì)胞中的microRNA。首先，目標(biāo)物microRNA-21依次打開(kāi)兩個(gè)發(fā)夾型探針，形成“Y”型DNA結(jié)構(gòu)。通過(guò)DNA酶（Pb2+）的剪切實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)放大，并得到了大量的DNA引發(fā)鏈。該引發(fā)鏈可“關(guān)閉”DNA納米鑷子，隨著鑷子兩端的發(fā)光物質(zhì)靠近而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，釕將能量轉(zhuǎn)移給量子點(diǎn)，因而量子點(diǎn)電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)得到顯著增強(qiáng)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，線性范圍為10 nmol/L～0.1 pmol/L，檢測(cè)限為0.03 pmol/L（S/N=3）。該研究通過(guò)引入新型的DNA分子機(jī)器，拓展了DNA納米技術(shù)在生物傳感及臨床診斷方面的應(yīng)用，對(duì)于疾病診斷及預(yù)防具有重要的理論意義及實(shí)用價(jià)值。

電致化學(xué)發(fā)光；目標(biāo)物循環(huán)策略；MicroRNA；DNA分子機(jī)器

0 引言

在生物的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，microRNA具有調(diào)節(jié)細(xì)胞早期發(fā)育，參與細(xì)胞分化和組織發(fā)育，調(diào)控基因表達(dá)的生物功能[1-3]。近年來(lái)，MicroRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控功能，尤其是對(duì)腫瘤等疾病進(jìn)程的調(diào)控功能研究已發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一[4-6]。它的表達(dá)異常可以引起細(xì)胞分化、增殖、凋亡的異常，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。其作為疾病診斷的重要分子生物學(xué)標(biāo)志物，在腫瘤的診斷、治療中有著重要的潛在價(jià)值[7-8]。構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器對(duì)microRNA進(jìn)行檢測(cè)，受到了越來(lái)越多科學(xué)研究者的關(guān)注。

分子機(jī)器人，是人類征服自然的整個(gè)宏偉藍(lán)圖中最富有想像力和創(chuàng)造力的部分，而且運(yùn)用于醫(yī)學(xué)可以用來(lái)清除肌體深處的病毒、癌細(xì)胞等，分子機(jī)器也稱分子馬達(dá)(molecular motor)，由生物大分子構(gòu)成，是能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能的納米系統(tǒng)[9-10]。分子馬達(dá)大體可分為六類：細(xì)胞骨架蛋白、聚合體、G蛋白、旋轉(zhuǎn)的馬達(dá)、環(huán)狀蛋白以及核苷酸馬達(dá)。天然的分子馬達(dá)在生物體內(nèi)的胞質(zhì)運(yùn)輸、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、肌肉收縮等生命活動(dòng)起著重要作用。通過(guò)對(duì)分子馬達(dá)的深入研究，分子機(jī)器人的研發(fā)已成為當(dāng)今科技的前沿?zé)狳c(diǎn)[11-12]。DNA分子步行器可分為spiders、tweezers、gears、walkers等。其中，DNA鑷子由于其超強(qiáng)的靈活性、生物穩(wěn)定性和許多動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。如果將DNA分子機(jī)器與ECL檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、易操作等優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，必將為ECL生物傳感及microRNA的檢測(cè)提供了新的發(fā)展平臺(tái)。

圖1 MicroRNA傳感器構(gòu)建示意圖Fig.1The operating principle of microRNA sensing platform

以合成制備的具有發(fā)光效率高、穩(wěn)定性好的CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)作為電致化學(xué)發(fā)光體,該研究首次將DNA分子機(jī)器—DNA納米鑷子引入到ECL傳感體系中，并設(shè)計(jì)構(gòu)建了新型的DNA酶誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)放大的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，用于超靈敏檢測(cè)癌癥細(xì)胞中的microRNA（圖1）。首先，目標(biāo)物microRNA依次打開(kāi)兩個(gè)發(fā)夾型探針，形成“Y”型DNA結(jié)構(gòu)。通過(guò)DNA酶（Pb2+）的剪切實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)放大，并得到了大量的DNA引發(fā)鏈。當(dāng)引發(fā)鏈存在的條件下，引發(fā)鏈與DNA鑷子裸露的單鏈DNA雜交，DNA鑷子關(guān)閉，CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)與Ru(bpy)32+距離很近，因而Ru(bpy)32+可以把能量轉(zhuǎn)移給CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)，使CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)的ECL信號(hào)大大增強(qiáng)，達(dá)到了高靈敏檢測(cè)microRNA的目的。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，線性范圍為10 nmol/L ～0.1 pmol/L，檢測(cè)限為0.03 pmol/L（S/N=3）。該研究利用Pb2+作為剪切酶，不但實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)，降低傳感器的檢測(cè)限，而且避免了傳統(tǒng)酶剪切易失活、價(jià)格貴等缺點(diǎn)，開(kāi)辟了DNA鏈剪切的新途徑。通過(guò)引入新型的DNA分子機(jī)器，拓展了DNA納米技術(shù)在生物傳感及臨床診斷方面的應(yīng)用，對(duì)于疾病診斷及預(yù)防具有重要的理論意義及實(shí)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

PBS緩沖液（pH7.4）；氨基水溶性量子點(diǎn)-625（武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司）；三(2-羧乙基)膦（TCEP）、NaCl（成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)）；MgCl2、檸檬酸三鈉（重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司）；1%HAuCl4·4H2O(天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心)；聯(lián)吡啶釕，巰基乙醇(MCH)(百靈威科技有限公司）；DNA鏈（生工生物工程（上海）股份有限公司）；microRNA（大連寶生物公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CHI660D型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；MPI-E型ECL分析系統(tǒng)多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；WH-986靜音攪拌器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 目標(biāo)物循環(huán)過(guò)程

2 μmol/L的發(fā)夾型探針、輔助探針與目標(biāo)物各100 μL于PCR儀中37℃恒溫270 min后，得到“Y”型DNA結(jié)構(gòu)；當(dāng)加入DNA酶—Pb2+后，發(fā)夾型探針被剪切成兩段，“Y”型DNA結(jié)構(gòu)解體并釋放出目標(biāo)物microRNA，目標(biāo)物參與下一個(gè)循環(huán)。與此同時(shí)，剪切下來(lái)的引發(fā)鏈用于滴加在傳感界面上，參與下一步反應(yīng)。

1.3.2 DNA鑷子的制備

將DNA鏈ABC均勻混合，于37℃下反應(yīng)210 min，形成DNA鑷子結(jié)構(gòu)，并通過(guò)Au-S鍵組裝在修飾有金納米粒子的電極表面，并孵育過(guò)夜。將引發(fā)鏈滴于傳感界面，用于關(guān)閉DNA鑷子，此時(shí)，接近的量子點(diǎn)與釕產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，量子點(diǎn)的信號(hào)大大增加。

1.3.3 電極傳感界面的制備

將玻碳電極依次用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁漿料拋光，隨后在無(wú)水乙醇、去離子水中進(jìn)行超聲清洗，在裸電極檢測(cè)達(dá)到要求后進(jìn)行修飾。首先將玻碳電極置于1%的氯金酸溶液中，于-0.2 V恒電位下電化學(xué)沉積30 s，再滴加10 μL 1 μmol/L DNA鑷子溶液，于室溫下孵育12 h，隨后滴加10 μL MCH溶液孵育40 min以封閉多余的結(jié)合位點(diǎn)，防止非特異性吸附。滴加10 μL引發(fā)鏈，室溫下在電極表面孵育2 h后，即得到ECL傳感器界面。

2 結(jié)果與討論

2.1 MicroRNA傳感器的響應(yīng)性能

在最優(yōu)條件下，將傳感器用于不同濃度的microRNA-21檢測(cè)，探究ECL強(qiáng)度與microRNA濃度的關(guān)系（圖2)。在一定范圍內(nèi)，隨著microRNA-21濃度的增加，ECL峰值逐漸增高，峰型良好，且ECL強(qiáng)度與microRNA濃度的半對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。其線性范圍為10 nmol/L～0.1 pmol/L，線性回歸方程為I=13140.63+3199.86 lg c,相關(guān)系數(shù)r2為0.9935，檢出限為0.03 pmol/L (S/N=3)。

圖2 microRNA傳感器的校正曲線Fig.2Calibration curve for the various concentrations of microRNA

2.2 microRNA傳感器的穩(wěn)定性

在最優(yōu)條件下，將已制備好的傳感器連續(xù)掃描10圈(如圖3)，得到的ECL信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.17%，表明傳感器的穩(wěn)定性良好，能保證測(cè)量的精確度，有望用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖3 在以循環(huán)伏安法連續(xù)掃描10圈的條件下，MicroRNA傳感器信號(hào)表現(xiàn)出的穩(wěn)定性Fig.3The stability of the proposed biosensor with ECL intensity-time curve under consecutive cyclic potential scans for 10 circles

2.3 microRNA傳感器的重現(xiàn)性

在同一批電極中，取四根電極構(gòu)建相同的傳感器并測(cè)量其ECL信號(hào)，對(duì)比信號(hào)值得到批內(nèi)重現(xiàn)性。再取同一根電極，連續(xù)三天構(gòu)建相同的傳感器，并測(cè)定其ECL信號(hào)，對(duì)比信號(hào)值得到批間重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，說(shuō)明構(gòu)建的傳感器重現(xiàn)性良好。

2.4 microRNA傳感器的選擇性

為了考察microRNA-21傳感器的特異性，選取microRNA-155作為干擾物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定（如圖4）。分別以（A）blank，（B）microRNA-155，（C）microRNA-21，（D）microRNA-155+microRNA-21替換目標(biāo)物microRNA-21，在相同條件下測(cè)得ECL信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，microRNA-155對(duì)ECL信號(hào)的影響可忽略不計(jì)，即構(gòu)建的傳感器對(duì)microRNA-21的檢測(cè)具有良好的特異性。

圖4 microRNA-21生物傳感器的特異性（A）空白對(duì)照；（B）microRNA-155(50 pmol/L)；（C）microRNA-21 (1 pmol/L)；（D）microRNA-21(1 pmol/L)+microRNA-155 (50 pmol/L)Fig.4The specificity of the proposed ECL biosensor：(A) Blank,(B)microRNA-155(50 pmol/L),(C)microRNA-21 (1 pmol/L),(D)microRNA-21(1 pmol/L)+microRNA-155 (50 pmol/L)

3 結(jié)論

綜上所述，該研究將分子生物學(xué)和納米材料技術(shù)結(jié)合，運(yùn)用了目標(biāo)鏈循環(huán)放大，并首次將DNA分子機(jī)器—DNA納米鑷子引入到ECL傳感體系中，設(shè)計(jì)構(gòu)建了新型的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，用于超靈敏檢測(cè)癌癥細(xì)胞中的microRNA-21。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，線性范圍為10 nmol/L ～0.1 pmol/L，檢測(cè)限為0.03 pmol/L（S/N=3）。通過(guò)引入新型的DNA分子機(jī)器，拓展了DNA納米技術(shù)在生物傳感及臨床診斷方面的應(yīng)用，對(duì)于疾病診斷及預(yù)防具有重要的理論意義及實(shí)用價(jià)值，有望用于前列腺癌的早期診斷及治療。

[1]Jiang S,Zhang H W,Lu M H,et al.MicroRNA-155 functions as an OncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling 1 gene[J].Cancer Research,2010,70:3119-3127.

[2]Xu B,Feng N,Li P,et al.A functional polymorphism in Pre-miR-146a gene is associated with prostate cancer risk and mature miR‐146a expression in vivo[J].The Prostate,2010,70(5):467-472.

[3]Zamore P D,Haley B.Ribo-gnome:the big world of small RNAs[J].Science,2005,309:1519-1524.

[4]Zhang P,Wu X,Chai Y,et al.An electrochemiluminescent microRNA biosensor based on hybridization chain reaction coupled with hemin as the signal enhancer[J]. Analyst,2014,139(11):2748-2753.

[5]Chen A,Ma S,Zhuo Y,et al.In Situ Electrochemical Generation of Electrochemiluminescent Silver Naonoclusters on Target-Cycling Synchronized Rolling Circle Amplification Platform for MicroRNA Detection[J]. Analytical Chemistry,2016,88(6):3203-3210.

[6]Yang C,Dou B,Shi K,et al.Multiplexed and amplified electronic sensor for the detection of microRNAs from cancer cells[J].Analytical Chemistry,2014,86(23): 11913-11918.

[7]Zhou W,Li D,Chai Y,et al.RNA responsive and catalytic self-assembly of DNA nanostructures for highly sensitive fluorescence detection of microRNA from cancer cells[J].ChemicalCommunications,2015,51(92): 16494-16497.

[8]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants [J].Science,1999,286:950-952.

[9]Chen Y,Liu H P,Ye T,et al.DNA-Directed Assembly of Single-Wall Carbon Nanotubes[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129:8696-8697.

[10]Stulz E,Clever G,Shionoya M,et al.DNA in a modern world[J].Chemical Society Review,2011,40:5633–5635.

[11]Ding B Q,Deng Z T,Yan H,et al.Gold Nanoparticle Self-Similar Chain Structure Organized by DNA Origami [J].Journal of the American Chemical Society,2010, 132:3248–3249.

[12]Silvia H A,Karolis M,Vivek V T,et al.Voltage-Dependent Properties of DNA Origami Nanopores[J].Nano Letter,2014,14:1270-1274.

Studies on electrochemiluminescence microRNA biosensor based on target recycling amplification and DNA nanomachine

Pu Nan-ping1,Zhang Pu2,Zhuo Ying2*
（1.Affiliated middle school of Southwest University,Chongqing 400715,China)
(2.Key Laboratory of Luminescent and Real-Time Analytical Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

A novel electrochemiluminescence(ECL)biosensor was constructed for the highly-sensitive detection of microRNA-21 coupling with the target recycling amplification and the DNA nanomachine.First,the primer probe with assistant probe and miRNA formed Y junction which was cleaved with the addition of Pb2+to release microRNA. Subsequently,the released microRNA could initiate the next recycling process,leading to the generation of numerous DNA reporters.In the presence of the DNA reporters,the tweezer transformed to“closed”state through the hybridization of reporter DNA and generate ERET of Ru(bpy)32+and QDs,increasing the ECL intensity of QDs remarkably.The proposed biosensor realized high sensitive detection of the microRNA in cancer cell.The linearity range was 10 nmol/L～0.1 pmol/L with a detection limit down to 0.03 pmol/L(S/N=3).This work offers a new modular platform for the construction of DNA nanomachines which could serve as an effective signal amplification strategy for the real application in biosensing and clinical diagnosis.

electrochemiluminescence；target recycling amplification strategy；microRNA;DNA nanomachine

國(guó)家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目（21575116,21675129,21675130）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（XDJK2015A002）

*通信聯(lián)系人,E-mail:yingzhuo@swu.edu.cn,Tel:Fax:023-68253172