混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取工藝

趙惠茹， 劉 敏

（西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安710021）

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混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取工藝

趙惠茹， 劉 敏

（西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安710021）

摘要：目的 優(yōu)選半仿生法提取金櫻子的最佳工藝條件。方法 以3次煎煮用水的pH值和煎煮時間為考察因素，總黃酮、多糖、干浸膏得率為指標，應用混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取的最佳工藝參數(shù)。結果 金櫻子半仿生提取最佳工藝為3次煎煮用水的pH依次為5、7.5、9，時間分別為2、1、1 h。結論 該工藝合理可行，可用于金櫻子的提取。

關鍵詞：金櫻子；半仿生提??；混合均勻設計

金櫻子又名刺榆子、糖刺果、刺橄欖等，為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的成熟果實，味酸、甘、澀［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明［2］，金櫻子果實可作為利尿劑、鎮(zhèn)咳劑，也常用于高血壓、慢性腎炎、燒燙傷、神經衰弱等疾病的治療。作為藥食同源的植物之一，金櫻子含有多糖、黃酮、酚酸、甾體、三萜類化合物等生物活性成分，其中多糖和黃酮類物質的含有量較高［3］。關于金櫻子多糖、黃酮類化合物提取的研究報道較多，大多采用正交試驗設計，以熱水浸提多糖、含水乙醇提取黃酮、酶化、超聲波、微波等方法同時提取這兩類成分［4-7］，但當試驗中的因素和水平較多時，正交設計所需的試驗次數(shù)也較多，并且這些提取方法均未考慮到藥物在胃腸道的吸收情況。因此，本實驗采用可以提高藥物生物利用度的半仿生提取法［8-9］，依次用不同pH的酸水和堿水進行提取，主要考察pH值及提取時間對金櫻子中多糖和黃酮類物質的影響。在試驗設計方面，均勻設計特別適用于多因素多水平的試驗設計，可用多重線性回歸分析方法準確、迅速地分析數(shù)據。到目前為止，采用混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子的半仿生提取工藝尚未見報道，因此本實驗的目的在于為金櫻子的提取提供一條可參考的工藝路線，使其在藥食兩用領域的開發(fā)前景更加廣闊。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PHS-3C型精密pH酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；UV-160A紫外分光光度計（日本島津公司）；KQ5200E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；RE-201L旋轉蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；DHG-9240B電熱恒溫鼓風干燥箱（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 材料 D-無水葡萄糖（批號110833-200904）、蘆丁（批號100080-200707）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。金櫻子購于西安市萬壽路藥材市場，并由邊軍昌高級實驗師鑒定為薔薇科植物金櫻子Rosa laevlgata Michx的干燥成熟果實。水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試驗設計 根據半仿生法提取的原理，將金櫻子粗粉先用酸水提取，然后用堿水提取，模擬口服給藥及藥物經胃腸道轉運的過程，以金櫻子總黃酮、多糖和干浸膏得率為指標，在藥材粒度（過40目篩）、提取溫度（100℃）、提取次數(shù)（3次）、過濾、濃縮等條件相同的情況下，確定3次煎煮用水的pH值和總時間為主要因素，各因素選取不同的水平，試驗設計見表1。

表1　U9（91×33）試驗設計

2.2 總黃酮含有量測定［10］

2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品

21.4 mg，加適量無水乙醇溶解，定容于50 mL量瓶中，搖勻，得質量濃度為0.428 mg/mL的對照品貯備液。精密吸取5 mL，置于25 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得質量濃度為85.6 μg/mL蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備及樣品中總黃酮含有量的測定將金櫻子果實干燥，碾碎，過40目篩，置于索氏提取器中，用石油醚回流提取至無色，藥渣干燥至恒重。精密稱取脫脂后干燥的金櫻子粉末約5 g，按表1方法進行試驗，每份樣品煎煮3次（料液比依次為12、8、6倍，3次提取時間比為2∶1∶1），提取液用4層紗布加100目篩分別濾過，3 000 r/min離心15 min，合并上清液，濃縮并定容至100 m L量瓶中，即得樣品溶液。取20 m L置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，105℃下烘干，研勻，加80％乙醇15 mL，超聲提取30 min，濾過，定容于25 mL量瓶中，即得總黃酮的供試品溶液。精密吸取該溶液適量，加水逐級稀釋并定容于適當體積的量瓶中，再精密吸取此樣品溶液適量，置于10 mL量瓶中，測定金櫻子中總黃酮的含有量。

2.2.3 標準曲線的制備與線性關系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，依次加入5％亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，加入10％三氯化鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，再加入4％氫氧化鈉溶液4 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，在508 nm處測定吸光度。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（C），吸光度為縱坐標（A）繪制標準曲線，得回歸方程A=0.016 2C+0.010 4（r=0.999 7），表明蘆丁在8.56～42.8 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取質量濃度為85.6 μg/mL的蘆丁對照品溶液3.0 mL，按“2.2.3”項下方法連續(xù)測定6次吸光度，計算出RSD值為0.26％（n =6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，按“2.2.3”項下方法操作，分別在0、2、4、6、8 h測定吸光度，計算出RSD值為1.78％（n =5），表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.2.6 重復性試驗 取同一批金櫻子果實6份，按“2.2.2”項下方法制備樣品，按照表1中的7號試驗條件進行提取，“2.2.3”項下方法測定，計算含有量。結果，樣品中總黃酮含有量分別為35.9、36.3、37.2、37.8、36.9、35.1 mg/g，平均36.5 mg/g，RSD值為2.63％（n = 6），表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取經石油醚脫脂、干燥至恒重、含有量已知的金櫻子粉末0.1 g，共9份，分別精密加入80％、100％、120％的蘆丁對照品各3份，按“2.2.2”項下方法制備樣品，按照表1中的7號試驗條件進行提取，“2.2.3”項下方法測定含有量。結果，平均回收率為96.89％，RSD為1.82％（n =9），表明該方法可行，準確性好。

2.3 多糖含有量測定［11-12］

2.3.1 葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取葡萄糖對照品26.91 mg，加適量蒸餾水溶解，定容于10 mL量瓶中，搖勻，得質量濃度為2.691 0 mg/mL的葡萄糖對照品貯備液，精密吸取2.5 mL于25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.269 1 mg/m L的葡萄糖對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備及樣品中多糖含有量測定 精密吸取“2.2.2”項下3次水煎煮后的樣品溶液5 mL，加水稀釋，定容于量瓶中。再往3次水提后的殘渣中加水15 mL，置沸水浴中加熱回流30 min，趁熱過濾，殘渣用熱水洗滌，合并濾液，冷卻至室溫，轉移至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取以上兩種樣品溶液適量，分別置于10 mL量瓶中，按照“2.3.3”項下方法測定其含有量，兩者之和即為總多糖的含有量，見表2。

表2　各指標成分含有量及標準化處理結果

2.3.3 標準曲線的制備與線性關系考察 精密量取對照品溶液0.0、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 m L，分別置于10 mL量瓶中，加純水稀釋至刻度，搖勻，分別吸取1 mL，置于對應編號的試管中，加6％苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻，40℃水浴中保溫30 min，取出冷卻至室溫，在490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標（A），質量濃度為橫坐標（C）繪制標準曲線，得回歸方程A=0.011 0C+0.000 1（r=0.999 7）。結果表明，葡萄糖在16.15～69.96 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取葡萄糖對照品溶液1 mL，稀釋10倍，吸取1 mL置于試管中，苯酚-濃硫酸法顯色后，在490 nm處連續(xù)測定6次吸光度。結果，RSD值為0.17％（n =6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取多糖供試品溶液2.2 mL，稀釋10倍，精密吸取1 m L置于試管中，苯酚-濃硫酸法顯色后，在0、2、4、6、8 h，490 nm處測定吸光度。結果，RSD值為2.92％（n =5），表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗 精密稱取脫脂后的樣品6份，按照表1中的7號試驗條件進行提取，按“2.3.2”項下方法制備多糖供試品溶液，分別精密吸取1 mL，稀釋100倍，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，并計算含有量。結果，多糖的RSD值為1.94％（n =6），表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取經石油醚脫脂、干燥至恒重、含有量已知的金櫻子粉末0.1 g，共9份，分別精密加入80％、100％、120％的葡萄糖對照品各3份，按照表1中的7號試驗條件進行提取，按“2.3.2”項下方法制備多糖供試品溶液，“2.3.3”項下方法測定所得多糖含有量之和。結果，平均回收率為97.34％，RSD為1.56％ （n =9），表明該方法可行，準確性好。

2.4 干浸膏得率的測定 精密吸取“2.2.2”項下樣品溶液各20 mL，置于恒定質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃下烘至恒重，計算干浸膏得率。

2.5 試驗結果與標準化處理 按照試驗建立的總黃酮、總多糖、干浸膏得率計算方法，測定每份樣品中這3個指標的數(shù)據，按公式Xij=（Xij-Xj）/Sj進行標準化處理（Xij為樣品液i中成分j的含有量；Xj為9個水平樣品液i中成分j的平均值；Sj為成分j的標準偏差；Xij為標準化后的值［13］）。根據各指標在提取工藝中的主次地位，給予不同的加權系數(shù)，Y=總黃酮含有量×4 +總多糖含有量×4 +干浸膏得率×2。以標準化后的值（表2中括號內的數(shù)字）加權后求和，即得綜合評價指標Y值，結果見表2。

2.6 多元回歸方程的建立 將Y（綜合評價指標）用DPS 7.05軟件進行二次多項式逐步非線性回歸分析，得回歸方程Y=309.985 +168.174B-223.617C-0.522 381A2+ 20.780 6C2+0.435 729AB+0.590 236AD-18.499 4BC，r=0.999 9，F(xiàn)（7，1）=595.716 9。查F值表，F(xiàn)0.05（7，1）= 236.8，F(xiàn)＞F0.05（7，1）（P＜0.05）。F檢驗表明，回歸方程在a=0.05水平上有顯著意義；剩余標準差S =0.213 2，決定系數(shù)=0.999 7，說明此回歸方程具有良好的預測精度。數(shù)據模型因素的相關性分析見表3。

由表3可知，各因素對綜合評價指標的影響程度為B= B×C＞C2＞A×D=C＞A2＞A×B，即第二煎pH值、第三煎pH值、第一煎pH值的二次項、第三煎pH值的二次項、第一煎pH值分別與第二煎pH值和提取時間的交互項、第二煎pH值與第三煎pH值的交互項均有顯著性影響。然后，應用DPS 7.05軟件將方程進行優(yōu)化，以綜合評價指標的期望值大者為佳，得優(yōu)化條件為A=5.1，B=7.5，C= 9，D=4，預測Y值為8.425。結合生產實際，確定金櫻子半仿生提取的最佳工藝，即三煎用水的pH分別為5.0、7.5、9.0，分別加12、8、6倍量水，煎煮時間分別為2、1、1 h。

表3　數(shù)據模型因素的相關性分析

2.7 驗證試驗 按照優(yōu)化的工藝條件，依據“2.2”～“2.5”項下樣品的制備和測定方法，進行3次驗證性試驗，測得各指標成分含有量，并將結果進行標準化處理。結果，總黃酮平均含有量為45.8 mg/g，總多糖平均含有量為303.52 mg/g，干浸膏得率平均值為38.06％，綜合評價指標Y′為8.262，與預測值（Y=8.425）比較接近，說明該提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

由于金櫻子以黃棕至紅棕色的果實入藥，含有大量的脂類及脂溶性色素，而本實驗采用紫外可見分光光度法測定總黃酮和總多糖的含有量，為了使顯色反應更加靈敏，專屬性更強，在提取前藥材用石油醚連續(xù)回流提取，使脫脂更完全。

在本實驗的操作過程中，用于測定多糖含有量的樣品包括兩部分，一部分來源于不同pH值提取的3次水煎液，而另一部分是由提取過黃酮的藥渣繼續(xù)用中性水提取得到。結果表明，第二部分所得多糖的含有量僅為第一部分的1.5％～3.8％，而金櫻子多糖的含有量非常高，故為了提高工作效率，可以省去藥渣的再次提取。

表1的試驗設計是用pH值依次增大的蒸餾水連續(xù)3次煎煮藥材，這是由于人體胃、小腸、大腸的體液pH值分別為1.5～2.0、7.6、8.4，體現(xiàn)了半仿生提取法的特點。但根據實際情況，第二次和第三次煎煮的pH值以及時間在合理的范圍內細分為9個水平意義不大，故第一次煎煮的pH值設置了9個水平，而第二次和第三次煎煮的pH值以及時間只設置了3個水平。由此，在選擇均勻設計表時采用了U9（91×33）混合均勻設計表來安排試驗，可使試驗次數(shù)明顯減少，效率顯著提高。

用混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取工藝時，由于本實驗選用的總黃酮、總多糖和干浸膏得率等指標在提取工藝中的主次地位不同，因此在進行數(shù)據處理時，分別給予它們不同的權重系數(shù)，將實驗數(shù)據進行標準化處理，得到綜合評價指標［14-15］。這樣，就可以消除各指標之間單位和量綱的不同，使實驗結果更加合理科學。

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作者簡介：趙惠茹（1972—），女，碩士，副教授，從事天然藥物研究與開發(fā)。Te1：（029）86177548，E-mai1：wang- gq@chd.edu.cn

基金項目：陜西省教育廳科研計劃項目（15JK1638）；陜西省科技廳自然科學基金（2015JM8449）

收稿日期：2014-10-21

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.048

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0197-04