刺五加注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及其受體表達(dá)的影響

賈琳琳， 張 滌， 李佳明， 張 波， 徐 劍， 陶春虹， 李春雨

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；3.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002）

?

刺五加注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及其受體表達(dá)的影響

賈琳琳1， 張 滌2， 李佳明1， 張 波1， 徐 劍2， 陶春虹3， 李春雨1

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；3.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002）

摘要：目的 觀察刺五加注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中谷氨酸及其受體表達(dá)的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成正常對(duì)照組、慶大霉素組、刺五加+慶大霉素組和刺五加注射液組。采用腹腔注射慶大霉素制作耳毒模型，刺五加注射液進(jìn)行干預(yù)治療。連續(xù)用藥10 d后，觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)閾變化、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及其受體表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組和刺五加注射液組相比，慶大霉素組豚鼠聽(tīng)閾閾值和耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及其受體的表達(dá)明顯增高；刺五加注射液可顯著改善慶大霉素所致的聽(tīng)閾改變和降低谷氨酸及其受體的表達(dá)。結(jié)論 慶大霉素作用下耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中谷氨酸和其相應(yīng)受體表達(dá)增高；刺五加注射液可通過(guò)抑制谷氨酸及其受體在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中的過(guò)度表達(dá)，對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：刺五加注射液；螺旋神經(jīng)節(jié)；谷氨酸；受體；慶大霉素

谷氨酸是耳蝸內(nèi)主要的興奮性傳入神經(jīng)遞質(zhì)，在內(nèi)毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)之間介導(dǎo)信號(hào)傳遞作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在各種病理?xiàng)l件下，谷氨酸及其類似物的過(guò)度釋放和堆積可以產(chǎn)生興奮性毒性，但其參與氨基苷類抗生素（AmAn）耳毒性發(fā)生的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。刺五加注射液為臨床上治療心腦血管疾病的常用藥物，我們前期工作發(fā)現(xiàn)刺五加注射液對(duì)外源性谷氨酸所致豚鼠耳蝸復(fù)合動(dòng)作電位改變和內(nèi)耳結(jié)構(gòu)損傷具有拮抗作用［1］，本研究通過(guò)制作豚鼠慶大霉素耳中毒模型，觀察刺五加注射液對(duì)豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及其受體表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討刺五加注射液拮抗慶大霉素所致聽(tīng)覺(jué)損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理 選用耳廓反應(yīng)靈敏的健康白色紅目豚鼠40只，體質(zhì)量為200～250 g，雌雄不拘，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（遼）2007-0003。隨機(jī)分成正常對(duì)照組、慶大霉素組、刺五加+慶大霉素組和刺五加注射液組。慶大霉素組每日腹腔注射慶大霉素注射液100 mg/kg；刺五加+慶大霉素組每日腹腔注射刺五加注射液250 mg/kg和與慶大霉素組等量的慶大霉素注射液；正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水2.5 m L/kg；刺五加注射液組注射與刺五加注射液+慶大霉素組等量的刺五加注射液注射液［2-3］，連續(xù)用藥10 d。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 硫酸慶大霉素（山東恩威藥業(yè)有限公司，批號(hào)150881507）；刺五加注射液（哈爾濱珍寶制藥有限公司，批號(hào)20110715）；免疫組化試劑盒、相關(guān)抗體和試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；顯微圖像分析系統(tǒng)；電子分析天平；聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（ABR）誘發(fā)記錄系統(tǒng)；解剖顯微鏡。

1.3 檢測(cè)ABR閾值 各組豚鼠分別于用藥前和停藥后第1天檢測(cè)ABR閾值。1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/kg）。操作在隔音電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，采用主頻率為3 kHz的短聲刺激信號(hào)，具體操作方法參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-2］。

1.4 SABC免疫組化法檢測(cè)谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸型受體（NMDAR1）的表達(dá) 停藥第1天檢測(cè)ABR閾值后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物快速斷頭處死取耳蝸制備標(biāo)本［3］，參照即用型SABC免疫組化試劑盒使用說(shuō)明書要求進(jìn)行染色。應(yīng)用顯微圖像分析技術(shù)，計(jì)算各組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及NMDAR1的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)值以±s表示，各組間差異的顯著性比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值檢測(cè) 結(jié)果（表1）顯示，用藥前各組豚鼠ABR閾值無(wú)明顯差異；連續(xù)腹腔注射藥物10 d后，慶大霉素組ABR閾值升高明顯，與正常對(duì)照組相比差異明顯；刺五加+慶大霉素組ABR閾值與慶大霉素組相比明顯減低，說(shuō)明刺五加注射液對(duì)慶大霉素引起的聽(tīng)力損傷有拮抗作用。

表1　豚鼠ABR閾值（dbnHL）變化（±s，n=10）

表1　豚鼠ABR閾值（dbnHL）變化（±s，n=10）

注：與用藥前比較，*P＜0.01；與正常對(duì)照組比較，#P＜0.01；與用藥后慶大霉素組比較##P＜0.01

組別　　用藥前　　用藥后正常對(duì)照組　2.55±2.05　2.55±2.05慶大霉素組　2.35±1.93　36.55±6.63*#刺五加+慶大霉素組　2.54±2.15　9.53±2.32##刺五加注射液組2.98±2.35　3.15±2.25

2.2 豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸、NMDAR1的蛋白質(zhì)表達(dá) 正常對(duì)照組、刺五加注射液組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中有谷氨酸和NMDAR1的表達(dá)；慶大霉素組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有谷氨酸和NMDAR1的棕黃色顆粒沉著，與正常對(duì)照組相比，表達(dá)程度明顯增強(qiáng)；刺五加+慶大霉素組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中棕黃色顆粒的染色程度明顯淺于慶大霉素組。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2　豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸和NMDAR1陽(yáng)性反應(yīng)平均灰度值（±s，n=10）

表2　豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸和NMDAR1陽(yáng)性反應(yīng)平均灰度值（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，#P＜0.01；與慶大霉素組比較，△P＜0.01

組別　　谷氨酸　NMDAR1正常對(duì)照組　115.24±6.45　95.63±6.24慶大霉素組　71.31±7.53#　66.35±6.74#刺五加+慶大霉素組　92.44±5.65△　86.53±7.36△刺五加注射液組112.06±5.85　93.74±5.31

圖1　谷氨酸在各組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)（×200）

3 討論

內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的傳入神經(jīng)突觸是聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路上的第一個(gè)突觸結(jié)構(gòu)，在外界信號(hào)的傳入和編碼過(guò)程起著重要的作用。在聲信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接受毛細(xì)胞釋放的興奮性遞質(zhì)谷氨酸的刺激產(chǎn)生興奮性電位，然而在缺血缺氧、噪音、耳毒性藥物等因素下所致過(guò)量的谷氨酸釋放及降解受阻會(huì)引起耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷［2，4 -5］。有研究表明，外源性谷氨酸耳蝸灌注可導(dǎo)致豚鼠耳蝸傳入神經(jīng)元形態(tài)和功能的損害，預(yù)先灌流含有谷氨酸受體拮抗劑的人工外淋巴液可防止谷氨酸所致的聽(tīng)力損失和耳蝸病理改變［6-8］。谷氨酸的神經(jīng)毒性作用主要通過(guò)突觸后膜的促離子型受體起作用。NMDAR是谷氨酸離子型受體的一類，有3個(gè)亞單位，分別為NR1、NR2和NR3，其中NR1最為重要，是NMDAR必需的功能亞單位。谷氨酸濃度的不斷增加可過(guò)度激活NMDAR，引起該受體控制的Ca2 +通道病理性開(kāi)放，Ca2 +大量?jī)?nèi)流，導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞下的傳入神經(jīng)細(xì)胞水腫甚至死亡［9-10］。慶大霉素是AmAn的一種，其耳毒性已被臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)廣為證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慶大霉素作用下可使螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中谷氨酸和NMDAR1表達(dá)增加并伴有聽(tīng)力損傷，提示谷氨酸和NMDAR1參與了慶大霉素對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制。

圖2　NMDAR1在各組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)（×200）

刺五加注射液是用傳統(tǒng)中藥刺五加的莖葉制成的滅菌溶液，其主要成分為總黃酮，是臨床常用藥物，特別用于治療缺血性心腦血管疾?。?1］。大量研究證實(shí)刺五加注射液的藥理作用包括擴(kuò)張血管、增加器官的血流量、促進(jìn)和改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、減少組織耗氧量、提高組織對(duì)缺氧的耐受性和清除自由基等［12-13］。考慮到刺五加注射液的藥理作用及AmAn耳毒性的基本病因之一是內(nèi)耳微循環(huán)障礙造成耳蝸缺血、缺氧、自由基產(chǎn)生增多而使耳蝸內(nèi)的結(jié)構(gòu)受到損傷，我們推測(cè)刺五加注射液可通過(guò)增加耳蝸的血液循環(huán)、改善內(nèi)耳缺血缺氧狀態(tài)而減輕谷氨酸的毒性作用和減少NMDAR的過(guò)度激活，起到對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。我們前期工作研究顯示刺五加注射液可抑制慶大霉素所致誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的過(guò)度表達(dá)［3］，iNOS可催化生成高于正常組織濃度的、具有自由基毒性作用的NO。谷氨酸與NO關(guān)系密切，谷氨酸及其受體的過(guò)度釋放可刺激NO的生成，進(jìn)一步加重對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷。因此刺五加注射液對(duì)抗谷氨酸及其受體的過(guò)度激活所引起的螺旋神經(jīng)節(jié)損傷可能是通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)，降低NO的量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，刺五加注射液可通過(guò)降低谷氨酸及其相應(yīng)受體NMDAR1在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其拮抗慶大霉素的耳毒作用，但確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 賈琳琳，趙曉蓮，張建華，等.刺五加注射液對(duì)外源性谷氨酸所致豚鼠耳蝸復(fù)合動(dòng)作電位和內(nèi)耳組織形態(tài)的影響［J］.中成藥，2013，35（9）：2008-2010.

［2］ Fetoni A R，Eramo S L，Ro1esiR，etal.Antioxidant treatment with coenzyme Q-ter in prevention of gentamycin ototoxicity in an anima1mode1［J］.Acta Otorhinolaryngol Ital，2012，32 （2）：103-110.

［3］ 賈琳琳，湯 浩，付純芳，等.刺五加注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸iNOS表達(dá)的影響［J］.中成藥，2008，30 （9）：283-1285.

［4］ Vorwerk C K，ZurakowskiD，McDermott LM，etal.Effects of axona1 injury on gang1ion ce11surviva1and g1utamate homeostasis ［J］.Brain Res Bull，2004，62（6）：485-490.

［5］ Sawada S，Mori N，Mount R J，et al.Differentia1vu1nerabi1ity of inner and outer hair ce11systems to chronicmi1d hypoxia and g1utamate ototoxicity：insights into the cause of auditory neuropathy［J］.JOtolaryngol，2001，30（2）：106-114.

［6］ 屈 涓，劉順利，丘建華，等.外源性谷氨酸對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞及聽(tīng)閾的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（6）：560-562.

［7］ 侯志強(qiáng)，余力生，李興啟.多巴胺對(duì)豚鼠耳蝸谷氨酸受體NMDANR1和NMDA NR2A的調(diào)節(jié)作用［J］.聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2010，18（2）：153-156.

［8］ Mejias R，Adamezyka A，Anggono V，et al.Gain-of-functiona1 g1utamate receptor interacting protein 1 varianta1ter G1uA2 recyc1ing and surface distribution in patients with autism［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，3（7）：245-251.

［9］ 張 靜，張 赟，張 寧，等.谷氨酸、NMDA和嗎啡對(duì)培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（7）：5221-5224.

［10］ Goforth P B，Ren J，Schwaftz B S，et al.Excitatory synaptic transmission and network activity are depressed fo11owing mechanic injury in cortica1neurons［J］.JNeurophysiol，2011，2 （23）：423-428.

［11］ 鐘朝暉，李萬(wàn)華.刺五加注射液治療冠心病心絞痛隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的Meta分析［J］.中國(guó)藥業(yè)，2007，16（15）：5-6.

［12］ 賈琳琳，湯 浩，齊淑芳，等.刺五加注射液拮抗慶大霉素所致豚鼠耳蝸血管紋細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2012，34（4）：736-738.

［13］ 劉 宏.刺五加注射液治療腦卒中后抑郁及神經(jīng)功能缺損的療效觀察［J］.海南醫(yī)學(xué)，2008，19（1）：56-57.

作者簡(jiǎn)介：賈琳琳（1975—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幙拱被疹惪股囟拘詸C(jī)制的研究。Te1：（0454）8618310，E-mai1：zhangshurui175@163.com

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳項(xiàng)目（12521564）

收稿日期：2014-04-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.043

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0181-03