普樂安片HPLC指紋圖譜研究

程巧鴛， 張文婷， 陳碧蓮， 鄭 成， 鄭瑜倩

（1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310022；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053）

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普樂安片HPLC指紋圖譜研究

程巧鴛1， 張文婷1， 陳碧蓮1， 鄭 成1， 鄭瑜倩2

（1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310022；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053）

摘要：目的 建立普樂安片（油菜花粉）HPLC指紋圖譜。方法 普樂安片甲醇提取液的分析在C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）上進行；乙腈-0.4％磷酸溶液為流動相，梯度洗脫；檢測波長265 nm；柱溫40℃。LC/MS/MS法以白麻苷為參照峰，對樣品進行相似度評價。結(jié)果 輔料、茶花粉、荷花粉、蕎麥花粉、向日葵花粉、玉米花粉和油菜花粉能被區(qū)分開，全國5家企業(yè)生產(chǎn)的35批樣品的相似度為0.856～0.999。結(jié)論 除4批樣品的相似度低于0.900外，普樂安片的質(zhì)量相對可靠。

關(guān)鍵詞：普樂安片；指紋圖譜；HPLC；LC/MS/MS

普樂安片為油菜花粉加輔料制成的單味藥制劑，具有補腎固本的作用，主要用于腎氣不固，腰膝酸軟，尿后余瀝或失禁及慢性前列腺炎、前列腺增生具有上述癥候者。根據(jù)文獻報道［1-8］，油菜花粉的主要化學成分為蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)成分及甾醇、黃酮、多肽、輔酶、皂苷等活性物質(zhì)，其中甾醇和黃酮類成分具有明顯的抗前列腺增生活性。油菜花粉的質(zhì)量標準為2001年浙江省食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的藥材標準，質(zhì)控項目單一。相應制劑普樂安片的質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2010年版一部第一增補本，包括顯微鑒別、薄層鑒別及總黃酮醇苷定量測定，但尚未建立反映整體信息的指紋圖譜，且難以有效甄別是否其他花粉投料如茶花粉、蕎麥花粉、向日葵花粉、玉米花粉等，因此需進一步建立專屬性更強的質(zhì)控項目以保障其質(zhì)量。

中藥指紋圖譜因能表征中藥的整體信息，目前在中藥質(zhì)量評價方面得到了廣泛認可。在前期實驗基礎上［9］，采用LC/MS/MS法對特征峰進行指認，建立經(jīng)方法學驗證的普樂安片HPLC指紋圖譜，并對全國5家企業(yè)生產(chǎn)的35批樣品進行相似度評價，為進一步提高普樂安片的質(zhì)量標準、更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量奠定基礎。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀，配備DGU-20A5在線脫氣機、四元梯度泵、SIL-20AC自動進樣儀、CTO-20AC柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；Agi1ent LC1200-Agi1ent 6430 Trip1e Quad LC/MS液-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agi-1ent公司）；AE 240電子天平（瑞士Mett1er公司）；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。乙腈、甲酸為色譜純（德國Merck公司）；甲醇為分析純（安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；水為超純水（美國Mi1ipore公司）和純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。白麻苷（西北大學生命科學學院趙英永副教授自制并惠贈，純度大于95％）。普樂安片（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號分別為130139、130141、130142、130143、130144、130145、130146、130147、130148、130149，規(guī)格0.57 g/片；甘肅河西制藥有限責任公司，批號分別為120106、120205、120209、120305、120309、120405、120409、120413、120112、111006，規(guī)格0.56 g/片；安徽新隴海藥業(yè)有限公司，批號分別為121116、121117、121118、121119、121120，規(guī)格0.5 g/片；包頭中藥有限責任公司，批號分別為1212301、1212303、1212304、1212307、1212309，規(guī)格0.55 g/片；楚雄老撥云堂藥業(yè)有限公司，批號分別為130101、130102、130103、130104、130107，規(guī)格0.56 g/片），共35批，研究用樣品批號為130139。油菜花粉（批號120825）、茶花粉（批號111206）、荷花粉（批號120715）、蕎麥花粉（批號120710）、向日葵花粉（批號120721）、玉米花粉（批號120806）由浙江康恩貝制藥股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 We1ch U1timate?XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.4％磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～60 min，5％～60％ B）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長265 nm；柱溫40℃；進樣體積10μL。

2.2 參照物溶液的制備 取白麻苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含30 μg白麻苷的溶液，作為參照物溶液Ⅰ。另取油菜花粉對照藥材約0.25 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，冷卻，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為參照物溶液Ⅱ。

2.3 供試品溶液的制備 取普樂安片樣品10片，研細，取約0.25 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備參照物溶液Ⅱ，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取空白輔料、茶花粉、荷花粉、蕎麥花粉、向日葵花粉、玉米花粉和油菜花粉，按“2.2”項下方法制備參照物溶液Ⅱ，在“2.1”項色譜條件下，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，空白輔料對樣品的測定無干擾，油菜花粉色譜圖中呈現(xiàn)分離良好的特征峰，表明本方法的專屬性良好。

A.玉米花粉 B.向日葵花粉 C.蕎麥花粉 D.荷花粉 E.茶花粉 F.油菜花粉 G.輔料A.corn po11en B.sunf1ower po11en C.buckwheat po11en D.1otus po11en E.came11ia po11en F.rape po11en G.excipients圖1　不同種類花粉及輔料液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of different types of pollens and excipients

2.4.2 精密度試驗 取樣品（批號130139），按“2.3”項下方法制備，在“2.1”項色譜條件下，重復進樣6針，記錄色譜圖，以6針平均值為模板，計算相似度。結(jié)果，各色譜圖相似度的RSD小于0.01％，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取樣品（批號130139），按“2.3”項下方法制備，平行6份，在“2.1”項色譜條件下，記錄色譜圖，以6份平均值為模板，計算其相似度。結(jié)果，各色譜圖相似度的RSD小于0.01％，表明本方法的重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取樣品（批號130139），按“2.3”項下方法制備，在“2.1”項色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、12、24、36 h記錄色譜圖，以0 h色譜圖為模板，計算其相似度。結(jié)果，各色譜圖相似度的RSD為0.1％，表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 相似度評價 運用上述分析方法，建立35批普樂安片樣品的指紋圖譜，選取色譜峰信息量較大的10批樣品，應用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2.0版）”軟件，生成對照指紋圖譜，計算35批樣品的相似度值，見表1。從表中可以看出，相似度在0.950～0.999者共29批，0.900～0.950者共2批，0.856～0.900者共4批，表明目前普樂安片的質(zhì)量相對可靠，但不同企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量仍有差異，因此建立指紋圖譜可使質(zhì)量更為可控。

表1　35批普樂安片的相似度值Tab.1 Sim ilarity values of 35 batches of Pule'an Tablets

2.5 指紋圖譜中參照峰的設定

2.5.1 質(zhì)譜條件 色譜條件同“2.1”項。流動相為乙腈-0.1％甲酸溶液；ESI源，正離子模式；Fu11Scan掃描方式；霧化室壓力35 psi（1 psi= 6.895 kPa）；霧化溫度350℃；毛細管電壓4 000 V；干燥氣體積流量9.0 L/min；掃描范圍m/z50～1 000；碎裂電壓135 V；與紫外檢測器并聯(lián)分流。

2.5.2 參照峰確證 上述質(zhì)譜條件下所得HPLC 和TIC圖見圖2。從圖中可知，HPLC圖中1～9號峰在TIC圖中響應良好。提取MS圖發(fā)現(xiàn)，1號峰為槲皮素連接兩個6C糖（特征離子627.2，465.1，303.1）的黃酮苷；3號峰特征離子（438.2，292.2，147.0）；2、4號峰為山柰素連接兩個6C糖（特征離子611.2，449.1，287.1）的黃酮苷，可能為同分異構(gòu)體；5號峰特征離子（687.4，657.3，541.3，495.3，344.1，193.1）；6、7號峰特征離子（881.1，851.2，441.1，426.0，352.2）可能為同分異構(gòu)體；8、9號峰特征離子（865.1，835.2，666.2，433.1，418.1，352.1）也可能為同分異構(gòu)體。通過UV光譜掃描和Product Ion掃描證實，1號峰為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷，即白麻苷，與文獻報道一致［10-11］，見圖3～5。2、4號峰可能為文獻報道的山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷或山柰酚-3，4′-雙-O-β-D-葡萄糖苷［10］，由于缺乏相關(guān)對照品，故尚未能確證。3、5、6、7、8、9號峰相關(guān)文獻報道較少，推測可能為皂苷或其他未知成分。

圖2　普樂安片TIC和HPLC圖Fig.2 TIC and HPLC chromatogram s of Pule'an Tablets

圖3　參照物和普樂安片液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of reference materials and Pu le'an Tablets

圖4　白麻苷和普樂安片1號峰紫外光譜圖Fig.4 UV spectrum of baimaside and Peak 1 of Pule'an Tablets

圖5　白麻苷和普樂安片1號峰質(zhì)譜圖Fig.5 M ass spectrum of baimaside and Peak 1 of Pule'an Tablets

3 討論

3.1 提取條件的考察 為能在一張色譜圖中盡可能多地反應化合物信息，本實驗比較了不同提取溶劑（50％甲醇和甲醇）對色譜信息的影響。結(jié)果，以50％甲醇為提取溶劑時色譜圖中的信息量明顯少于甲醇為提取溶劑，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 本實驗曾對色譜條件進行優(yōu)化，以使白麻苷參照峰與相鄰色譜峰及其余各峰達到最佳分離，試驗了不同流動相組成及梯度。結(jié)果，乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)可達到良好分離，比較了不同柱溫（25、30、35、40和45℃）對色譜分離的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫40℃時，白麻苷參照峰與相鄰色譜峰能完全分離，且其余各峰的分離良好，說明白麻苷成分對柱溫較敏感，增加柱溫可使分離度提高。試驗中還比較了不同色譜柱對分離的影響，結(jié)果不同品牌色譜柱分離均良好，各色譜柱相似度的RSD為0.6％，表明色譜柱的耐用性良好。

3.3 普樂安片質(zhì)量評價 本實驗共測定了全國5家企業(yè)生產(chǎn)的35批普樂安片樣品，結(jié)果4批樣品的相似度低于0.900。由于普樂安片的原料藥油菜花粉的產(chǎn)地相對比較集中，主要產(chǎn)自于青海、甘肅兩省，且制劑的制備工藝簡單，故目前普樂安片的質(zhì)量相對可靠，但也有個別企業(yè)個別批次的樣品質(zhì)量較差，可能與原料來源及質(zhì)控項目單一有關(guān)。本實驗采用對照品保留時間比對及質(zhì)譜法確證設定參照峰，并經(jīng)色譜條件考察優(yōu)化后建立指紋圖譜，可為保障普樂安片的批間穩(wěn)定性、質(zhì)量可靠性奠定實驗基礎。

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HPLC fingerprint of Pule'an Tablets

CHENG Qiao-yuan1， ZHANGWen-ting1， CHEN Bi-1ian1， ZHENG Cheng1， ZHENG Yu-qian2
（1.Zhejiang Provincial Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 31OO22，China；2.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 31OO53，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC fingerprint of Pu1e'an Tab1ets（po11en of brassica campestris L.）. METHODS The ana1ysis of Pu1e' an Tab1ets methano1ic extract was deve1oped on C18co1umn（4.6 mm× 250 mm，5 μm）at40℃，with acetonitri1e-0.4％ phosphoric acid so1ution as themobi1e phase in a gradient e1ution manner，1.0 mL/min for f1ow rate and 265 nm for detection wave1ength.Baimasidewas confirmed as the reference peak for LC/MS/MS.A simi1arity ana1ysiswas then carried on among samp1es' eva1uation.RESULTS The differences among rape po11en，excipients，po11ens of came11ia，1otus，buckwheat，sunf1ower and corn cou1d be identified.The simi1arities of thirty-five batches of Pu1e'an Tab1ets from fivemanufacturerswerewithin the ranges of 0.856 -0.999.CONCLUSION Except for the four batches under a simi1arity va1ue of0.900，amajority of Pu1e'an Tab1ets in themarket are re1iab1e in qua1ity.

KEY WORDS：Pu1e'an Tab1ets；fingerprint；high performance 1iquid chromatography（HPLC）；LC/MS/MS

作者簡介：程巧鴛（1981—），女，副主任中藥師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量安全研究。Te1：（0571）86459425

基金項目：國家自然科學基金（NSFC 81303213）；浙江省自然科學基金（LQ12H28001）

收稿日期：2015-05-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.020

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0094-04