青蒿素對腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的REIC表達(dá)相關(guān)平滑肌增殖的影響

曹乾，陳潔，姜艷，劉雪

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.心內(nèi)科；2.急診科，沈陽110004）

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青蒿素對腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的REIC表達(dá)相關(guān)平滑肌增殖的影響

曹乾1，陳潔1，姜艷2，劉雪1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.心內(nèi)科；2.急診科，沈陽110004）

摘要目的探討青蒿素（ART）對腫瘤壞死因子α（TNF?α）介導(dǎo)的細(xì)胞永生化表達(dá)下調(diào)（REIC）表達(dá)相關(guān)平滑肌增殖的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組。建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，分離血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。Western blot檢測REIC表達(dá)，熒光定量PCR檢測引物。結(jié)果大鼠頸動脈球囊損傷后，REIC基因表達(dá)受到抑制，ART處理對大鼠動脈平滑肌細(xì)胞中REIC蛋白的表達(dá)影響極小。而TNF?α處理下細(xì)胞中REIC蛋白的表達(dá)水平受到顯著抑制。ART對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，能夠顯著減輕TNF?α導(dǎo)致的REIC蛋白表達(dá)抑制。而ART處理呈劑量依賴性上調(diào)REIC的表達(dá)。結(jié)論REIC表達(dá)通過TNF?α介導(dǎo)參與平滑肌增殖過程，而且應(yīng)用ART可以抑制平滑肌增殖過程。

關(guān)鍵詞青蒿素；大鼠頸動脈球囊損傷模型；細(xì)胞永生化表達(dá)下調(diào)；腫瘤壞死因子

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Effectof Artemisinineon REICExpression Related Smooth Muscle Proliferation Inducedby Tumor Necrosis Factorα

CAOQian1，CHENJie1，JIANGYan2，LIUXue1

（1.Departmentof Cardiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang110004，China；2.Departmentof Emergency，Shengjing Hospital，China Medi?cal University，Shenyang110004，China）

Abstract Objective To explore the influence of artemisinine（ART）on smooth muscle proliferation related to reduced expression of immortal?ized cells（REIC）induced by tumor necrosis factor α（TNF?α）.Methods Rats were randomly divided into sham?operated group，model group，50 mg/kg ART group，and 100 mg/kg ART group.Balloon?damaged rat carotid artery models were established.Vascular smooth muscle cells were isolated and cultured.REIC protein and mRNA expression were detected by Western blot and fluorescent quantitation PCR.Results The expres?sion of REICgenes was suppressed when carotid arteries were balloon?damaged.Vascular smooth muscle cells，intervened with ART，minimally af?fected REICproteinexpressioninratarterialsmoothmusclecells.Whiletreatedwith TNF?α，thelevelofcellularexpressionof REICproteinwassig?nificantly restrained.Preconditioning of ART on cells would prominently ameliorate the TNF?α?induced suppression of REIC protein expression and unregulated REICexpressioninadose?dependentmanner.Conclusion REICisinvolvedintheprocessof TNF?α?inducedsmoothmuscleprolifer?ation.ARTiscapableofsuppressingproliferativeprocessofsmoothmusclecells.

Keywords artemisinine；balloon?damaged rat carotid artery；reduced expression of immortalized cells；tumor necrosis factor α

各種理化因素導(dǎo)致的損傷可以誘導(dǎo)炎癥過程、氧化應(yīng)激加強(qiáng)，通過原癌、抑癌基因表達(dá)失調(diào)，使平滑肌增殖、遷移，進(jìn)而動脈增殖加速，這是動脈粥樣硬化發(fā)生的主要機(jī)制。近幾年腫瘤領(lǐng)域有關(guān)細(xì)胞永生化表達(dá)下調(diào)（reduced expression in immortalized cells，REIC）研究的報道很多，但是其與動脈粥樣硬化的關(guān)系還不清楚。因此，探討REIC與平滑肌增殖關(guān)系、明確REIC表達(dá)意義及其與氧化和炎癥的關(guān)系有重要意義，可以為研究動脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。通過干預(yù)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和/或調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)以阻斷血管平滑肌細(xì)胞增殖，可望成為治療心血管疾病的有效途徑。青蒿素（artemisinin，ART）又名黃花蒿素，是由菊科植物黃花蒿提煉出來的倍半萜內(nèi)酯化合物，是治療惡性瘧原蟲所引發(fā)的瘧疾的特效藥［1］。近來研究發(fā)現(xiàn)，ART還具有廣譜的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，如抗腫瘤［2］、抗炎［3］、抗氧化［4］等。本研究通過建立大鼠頸動脈球囊損傷模型以及大鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)用ART、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF?α）對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，采用實時熒光定量PCR分析REIC基因的表達(dá)水平，Western blot分析REIC蛋白的表達(dá)水平，為上述問題提供證據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1大鼠頸動脈球囊損傷模型的建立

選取健康SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組。模型組、50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組大鼠行頸外動脈切開，行球囊剝脫內(nèi)膜。假手術(shù)組經(jīng)同樣處理但不進(jìn)行球囊損傷。建模后，50 mg/kg ART組和100 mg/kg ART組大鼠每天經(jīng)灌胃分別給予50 mg/kg ART和100 mg/kg ART，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2大鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

處死大鼠，取動脈內(nèi)膜剪成小塊，于培養(yǎng)瓶底部進(jìn)行培養(yǎng)。12 h后加入完全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，放置到培養(yǎng)板中培養(yǎng)。第1代細(xì)胞生長至5～6 d時，進(jìn)行傳代處理，收集、離心、去上清，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，接種培養(yǎng)。

模型組細(xì)胞分為6組，分別做以下處理，用于后續(xù)試驗：A組，不做任何處理；B組，用100 μmol/L ART處理細(xì)胞2 h；C組，用10 ng/mL TNF?α處理細(xì)胞24 h；D組，用25 μmol/L ART處理細(xì)胞2 h，再用10 ng/mL TNF?α處理細(xì)胞24 h；E組，用50 μmol/L ART處理細(xì)胞2 h，再用10 ng/mL TNF?α處理細(xì)胞24 h；F組，用100 μmol/L ART處理細(xì)胞2 h，再用10 ng/mL TNF?α處理細(xì)胞24 h。

1.3蛋白質(zhì)抽提測定

1.3.1抽提蛋白及定量：制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將抽提的蛋白待測樣本1 μL與19 μL PBS緩沖液混勻，加入各孔中吹打混勻。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度及對應(yīng)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸方程計算樣本蛋白濃度。

1.3.2SDS?PAGE：根據(jù)目的蛋白分子量選用對應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠。先后灌入分離膠、濃縮膠，封口，等待上樣。稀釋蛋白樣品后在沸水浴中煮沸，制成上樣液。電泳槽每孔加入20 μL電泳上樣液進(jìn)行電泳。

1.3.3轉(zhuǎn)印封閉，孵育一抗、二抗：電泳結(jié)束后，剝落凝膠。在轉(zhuǎn)印夾負(fù)極一側(cè)鋪海綿、濾紙、凝膠，之后浸于轉(zhuǎn)印緩沖液中的PVDF膜，膜的正面與凝膠接觸，在PVDF上面鋪上濾紙和海綿，進(jìn)行轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出PVDF膜，TTBS沖洗后，浸入脫脂奶粉溶液中。用脫脂奶粉稀釋抗體，制成抗體工作液，倒入雜交袋中，放入PVDF膜，進(jìn)行抗體孵育。同樣進(jìn)行二抗孵育。

1.3.4ECL底物發(fā)光，抗體剝脫封閉：取出孵育二抗后的PVDF膜進(jìn)行曝光后加入剝脫液，再浸入脫脂奶粉溶液中。

1.3.5孵育內(nèi)參抗體、二抗：同樣方法孵育內(nèi)參抗體及二抗后ECL底物發(fā)光。

1.3.6結(jié)果分析：將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel?Pro?Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.4熒光定量PCR

1.4.1總RNA提?。簶颖局屑尤肓呀庖?、氯仿，振蕩離心，吸附柱吸附，離心。

1.4.2反轉(zhuǎn)錄：將RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到對應(yīng)的cDNA，樣本上樣量（μL）與ddH2O使用量（μL）如下：A組，3.8、6.7；B組，5.2、5.3；C組，4.5、6.0；D組，3.4、7.1；E組，3.3、7.2；F組，5.5、5.0。在無核酸酶的離心管中加入反應(yīng)混合物，混勻，加熱終止反應(yīng)。以上步驟由PCR儀完成，最后得到20 μL cDNA樣本。

表1　引物序列表Tab.1 Oligonucleotide primer sets for real?time PCR

1.4.3實時熒光定量分析：稀釋引物，引物信息見表1。反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL；上下游引物（10μmol/L）各0.5 μL；SYBR GREEN mastermix 10 μL；用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。分別以不同反應(yīng)條件反應(yīng)40次。

1.5免疫熒光染色及鏡檢

固定細(xì)胞爬片，將爬片倒扣在載玻片上封片。于激光共聚焦顯微鏡下觀察。于鏡下（400×）拍照。1.6 REIC表達(dá)和引物序列檢測

1.6.1Western blot檢測REIC表達(dá)：一抗為REIC抗體，內(nèi)參抗體為β?actin抗體，二抗為羊抗兔IgG?HRP。

1.6.2熒光定量PCR檢測引物序列：REIC（NM_ 138519.2），F(xiàn)，CAACTACCACAACGAGACCAA；R，ATGGCTCTTCTTGCCTTCT。β?actin（NM_031144.3），F(xiàn)，GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC；R，GGCCG?GACTCATCGTACTCCTGCTT。

1.7RNA濃度測定

RNA提取后利用紫外分光光度計用實時熒光定量分析方法（2-△△CT方法）對提取的RNA濃進(jìn)行測定。結(jié)果提示A組～F組核酸濃度（ng/μL）分別為263.5、193.5、220.7、291.5、304.6、182.1，A組～F組吸光度比值（260/280）分別為1.82、1.83、1.93、1.96、1.99、1.81。本研究中每種樣本每個基因進(jìn)行復(fù)孔平行實驗，舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實驗保留數(shù)據(jù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，應(yīng)用Bonferroni法進(jìn)行多重比較，應(yīng)用方差分析進(jìn)行單因素分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠動脈平滑肌細(xì)胞顯微形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

細(xì)胞形體多呈長梭形，核大，有明顯的肌絲纖維，細(xì)胞呈典型“峰－谷”狀生長。見圖1。

A，×100；B，×400.圖1　大鼠動脈平滑肌細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.1 Morphology of rat arterial smooth muscle cells

免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，與細(xì)胞長軸平行的綠色部分為α平滑肌肌動蛋白（α?smooth muscle actin，α?SMA），藍(lán)色部分為細(xì)胞核。胞質(zhì)中α?SMA呈陽性表達(dá)，證明分離的細(xì)胞為大鼠動脈平滑肌細(xì)胞。見圖2。

A，DAPI；B，α?SMA；C，merged.圖2　大鼠動脈平滑肌細(xì)胞免疫熒光鑒定×400 Fig.2 Immunofluorescence identification of rat arterial smooth muscle cells×400

2.2實時熒光定量PCR分析REIC基因的表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠頸動脈中REIC mRNA水平顯著降低（P< 0.01）。50 mg/kg ART組及100 mg/kg ART組大鼠頸動脈中REIC的表達(dá)與模型組比較顯著升高（P< 0.05）。

模型組中，B組細(xì)胞中REIC基因的表達(dá)無顯著變化，C組細(xì)胞中REIC基因的表達(dá)受到顯著抑制。D組、E組及F組中可以觀察到，不同濃度的ART對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，能夠呈劑量依賴性減輕TNF?α對REIC基因表達(dá)的抑制。見圖3。

2.3Western blot分析REIC蛋白的表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠頸動脈中REIC蛋白水平顯著降低（P< 0.01）。在50 mg/kg ART組及100 mg/kg ART組大鼠頸動脈中，REIC蛋白水平的表達(dá)與模型組相比顯著升高（P< 0.05）。見圖4。

圖4　REIC蛋白的表達(dá)水平Fig.4 REIC protein expression level

模型組中，B組細(xì)胞中REIC蛋白的表達(dá)無顯著變化，C組細(xì)胞中REIC蛋白的表達(dá)水平受到顯著抑制。D組、E組及F組中可以觀察到，ART能夠顯著減輕TNF?α導(dǎo)致的REIC蛋白表達(dá)抑制，且ART的作用呈劑量依賴性。見圖5。

圖5　REIC蛋白的表達(dá)水平Fig.5 REIC protein expression level

3　討論

動脈粥樣硬化是一種主要侵害大、中動脈，使血管內(nèi)膜增厚、變硬、管腔狹窄的慢性動脈疾病。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的活化、增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)展的必要條件，有炎性反應(yīng)參與，有研究表明可能是通過上調(diào)炎性細(xì)胞因子及下調(diào)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)參與動脈粥樣硬化的形成［5］。在生理狀態(tài)下，VSMCs合成分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。但是粥樣斑塊形成早期，VSMCs從血管中膜遷移至內(nèi)膜，進(jìn)而增殖并發(fā)生表型變化，合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)、釋放多種生長因子，如TNF?α等［6，7］。動脈粥樣硬化的平滑肌增殖過程，與腫瘤類似。某種基因低表達(dá)可以促使細(xì)胞永生化，即抑癌基因。一些原癌、抑癌基因由于參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌增生與凋亡，在動脈粥樣硬化中也起到關(guān)鍵作用。Tsuji等［8］從幾種永生化細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)一段新的基因序列REIC表達(dá)明顯下調(diào)。REIC基因在永生化的細(xì)胞系和部分腫瘤細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，在心、腦和脊髓高表達(dá)。近年來對REIC基因在腫瘤方面有所研究，認(rèn)為與新生血管數(shù)量、平滑肌細(xì)胞明顯增殖、內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)。但是REIC基因與動脈粥樣硬化的關(guān)系少有研究。因此研究調(diào)控VSMCs的增殖和遷移的機(jī)制，尋找能夠調(diào)控VSMCs的增殖和遷移的藥物，對于開發(fā)新的有效的動脈粥樣硬化的治療方法具有重要意義。

血管壁受損是導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖的起始原因。損傷刺激通過細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起許多原癌基因的表達(dá)和細(xì)胞因子生成，使血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的平衡被打破，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞過度增殖［9］。本研究中與假手術(shù)組相比，模型組大鼠頸動脈中REICmRNA水平顯著降低，而在50 mg/kg ART組及100 mg/kg ART組大鼠頸動脈中，REIC的表達(dá)比模型組顯著升高。反映球囊損傷后，REIC基因表達(dá)受到抑制，平滑肌增殖明顯，而ART處理能夠呈劑量依賴性上調(diào)REIC的表達(dá)，對抗增殖。對于培養(yǎng)的大鼠動脈平滑細(xì)胞，100 μmol/L ART處理后無論REIC的基因表達(dá)還是蛋白表達(dá)并無顯著變化，可能與缺少作用關(guān)鍵環(huán)節(jié)有關(guān)。而10 ng/mL的TNF?α能夠顯著抑制細(xì)胞中REIC基因的表達(dá)水平和蛋白合成。使用25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L ART對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，能夠呈劑量依賴性減輕TNF?α對REIC基因表達(dá)和蛋白合成的抑制。說明在平滑肌增殖過程中TNF?α起到重要作用，對于大鼠損傷動脈的平滑肌增殖，不同濃度ART通過TNF?α介導(dǎo)的REIC表達(dá)抑制起到抑制受損的平滑肌增殖作用。

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（編輯陳姜）

［1］Ross R.Atherosclerosis?an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，

收稿日期：2015-05-13

作者簡介：曹乾（1975-），男，副教授，碩士.

基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金（201202275）；遼寧省省直醫(yī)院改革

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.006

中圖分類號R331.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號0258-4646（2016）01-0026-05