自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療顱腦損傷后痙攣性癱瘓

伊西才 魏禮洲 黑悅 龍乾發(fā) 王博晨 田沁濤 周躍飛 劉衛(wèi)平

·臨床研究·

自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療顱腦損傷后痙攣性癱瘓

伊西才1魏禮洲1黑悅1龍乾發(fā)2王博晨1田沁濤1周躍飛1劉衛(wèi)平1

目的探討應(yīng)用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療顱腦損傷后痙攣性癱瘓的臨床療效。方法回顧性分析第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科自2009年5月至2014年4月治療的33例顱腦損傷后痙攣性癱瘓患者，完成4次自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，每周1次，每次經(jīng)腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射，細(xì)胞數(shù)為2×107，移植前、移植后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月通過(guò)改良Ashworth分級(jí)、Brunnstrom分級(jí)評(píng)估患側(cè)上下肢肌張力、運(yùn)動(dòng)功能，并行腦PET/CT、腦電圖、偏癱肢體肌電圖檢查。結(jié)果移植后1個(gè)月開(kāi)始Brunnstrom分級(jí)較移植前改善。移植后3個(gè)月開(kāi)始Ashworth分級(jí)較移植前改善。5例移植后3個(gè)月頭顱PET/CT見(jiàn)腦葡萄糖代謝減低較前改善。臨床觀察未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，腦電圖、偏癱肢體肌電圖檢查未見(jiàn)明顯變化。結(jié)論自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)顱腦損傷后痙攣性癱瘓的肢體肌張力增高和運(yùn)動(dòng)障礙均有改善，移植后6個(gè)月內(nèi)通過(guò)臨床觀察及影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，為臨床治療顱腦損傷后遺癥提供了新方法。

顱腦損傷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；痙攣性癱瘓；肌張力

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)常常遺留各種類(lèi)型的神經(jīng)功能障礙，其中痙攣性癱瘓發(fā)生率最高，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。痙攣性癱瘓治療難度大，采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物及肌松藥物治療，效果不佳。TBI后可導(dǎo)致大量的神經(jīng)元喪失，是痙攣性癱瘓的主要原因。干細(xì)胞治療的研究試圖通過(guò)引入新的細(xì)胞來(lái)替代喪失的神經(jīng)元，或者所引進(jìn)細(xì)胞通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用來(lái)增加受損的神經(jīng)細(xì)胞的存活、可塑性和功能的恢復(fù)來(lái)發(fā)揮作用。選取自2009年5月至2014年4月在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療顱腦損傷后痙攣性癱瘓33例?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

資料與方法

一、一般資料

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)顱腦損傷后3個(gè)月以上、1年以?xún)?nèi)，臨床表現(xiàn)為一側(cè)肢體癱瘓，呈痙攣性，肌張力亢進(jìn)，腱反射亢進(jìn)，引出或引不出病理反射，頭顱CT或MRI確診；(2)近期服用鎮(zhèn)靜藥物或肌肉松弛劑無(wú)效。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)仍有顱內(nèi)血腫、腦水腫或顱內(nèi)感染的患者；(2)顱骨缺損或腦積水等需要手術(shù)的患者；(3)難治性癲癇、植物生存患者；(4)合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎疾病或血液病的患者。

本組33例患者中男性30例，女性3例；年齡6～62歲，平均35.2歲。自外傷至接受干細(xì)胞移植的平均時(shí)間為4.7個(gè)月。研究方案獲得第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者及家屬知情同意并簽字確認(rèn)。

二、干細(xì)胞移植方法

所有患者均住院治療，接受自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，1次/周，共計(jì)4次。每次移植在手術(shù)室內(nèi)完成。先通過(guò)骨髓穿刺，分離細(xì)胞，再通過(guò)腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。各項(xiàng)操作由2名研究者分別在手術(shù)室、細(xì)胞室進(jìn)行，具體步驟為：(1)患者側(cè)臥位，消毒、鋪巾，局麻后在髂后上棘穿刺骨髓腔后采集骨髓14 ml，針筒內(nèi)預(yù)先用0.5 ml肝素鈉稀釋液抗凝。(2)細(xì)胞分離在專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞室進(jìn)行，操作嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。預(yù)先在超凈臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備2個(gè)離心管，裝5 ml 1.077 g/ml的Percoll分離液(Pharmacia產(chǎn)品)。(3)將骨髓平分成兩份，分別緩慢沿管壁加入到兩個(gè)預(yù)置等量Percoll分離液的離心管內(nèi)，以2 500 r/min離心20min。小心取出離心管，仔細(xì)觀察，中間稀釋層為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所在層，小心吸出。(4)用5ml PBS緩沖液洗滌2次，將獲得的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取2×107(1ml)送回手術(shù)室。(5)局麻下腰椎穿刺腰3/4或腰4/5椎間隙，鞘內(nèi)注射將細(xì)胞移植入體內(nèi)，然后患者返回病房。

本臨床研究中心已通過(guò) “生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范”(good manufacturing practice，GMP)認(rèn)證。標(biāo)本采集、細(xì)胞分離、移植的過(guò)程應(yīng)始終使用無(wú)菌技術(shù)，以最大限度減少污染、感染的風(fēng)險(xiǎn)。干細(xì)胞移植間歇期及移植后觀察期間，患者出院，僅進(jìn)行康復(fù)鍛練。

三、臨床療效評(píng)定

所有患者于干細(xì)胞移植前和移植后的1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行肌張力和運(yùn)動(dòng)障礙評(píng)定。由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的醫(yī)師進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定者不參與治療。肌張力評(píng)定：采用改良Ashworth分級(jí)；0為無(wú)肌張力增加；1為肌張力輕度增加，當(dāng)受累肢體進(jìn)行被動(dòng)屈伸時(shí)，在關(guān)節(jié)活動(dòng)度之末出現(xiàn)突然阻抗或出現(xiàn)最小的阻力；1+為肌張力輕度增加，被動(dòng)屈伸時(shí)，在關(guān)節(jié)活動(dòng)度的后50%范圍內(nèi)出現(xiàn)突然的阻抗，當(dāng)繼續(xù)運(yùn)動(dòng)到關(guān)節(jié)活動(dòng)度終端時(shí)，始終伴有最小的阻力；2為大部分關(guān)節(jié)活動(dòng)度中肌張力均較明顯增加，但是患肢仍容易移動(dòng)；3為肌張力嚴(yán)重增加，進(jìn)行被動(dòng)關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍檢查有困難；4為受累肢體在屈伸活動(dòng)時(shí)僵直。運(yùn)動(dòng)障礙程度按Brunnstrom分級(jí)判定，評(píng)分越高提示患者肢體運(yùn)動(dòng)越靈活。

四、影像學(xué)及電生理學(xué)檢查

所有患者于干細(xì)胞移植前和移植后的3個(gè)月進(jìn)行腦PET/CT、腦電圖、偏癱肢體肌電圖檢查。

五、不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)

患者手術(shù)中至術(shù)后4 h進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)，術(shù)后1 d出院至術(shù)后6個(gè)月內(nèi)有任何不良反應(yīng)及時(shí)隨診、記錄。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究結(jié)果采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，術(shù)前、術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月Ashworth分級(jí)、Brunnstrom分級(jí)分別采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、干細(xì)胞移植前后臨床評(píng)分比較

從表1看出，移植后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月偏癱肢體Ashworth分級(jí)分別與移植前相比較，差異都有顯著性意義，說(shuō)明干細(xì)胞治療后1個(gè)月開(kāi)始上下肢肌張力均有下降。

從表2看出，干細(xì)胞移植后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月偏癱肢體Brunnstrom評(píng)分分別與移植前相比較，差異都有顯著性意義，說(shuō)明干細(xì)胞治療后1個(gè)月開(kāi)始偏癱的上下肢運(yùn)動(dòng)障礙均有改善。

表1 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前后肢體Ashworth分級(jí)的比較(n)

表2 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前后肢體Brunnstrom評(píng)分的比較(n)

二、影像學(xué)及電生理學(xué)檢查

移植前頭顱PET/CT檢查發(fā)現(xiàn)25例有腦軟化灶形成，23例位于偏癱對(duì)側(cè)大腦半球不同區(qū)域，2例位于偏癱同側(cè)大腦半球，軟化灶呈葡萄糖代謝缺損或減低，7例有腦室輕度擴(kuò)張。移植后的3個(gè)月進(jìn)行頭顱PET/CT復(fù)查，腦軟化灶體積無(wú)明顯變化，5例葡萄糖代謝減低較前改善。腦電圖、偏癱肢體肌電圖檢查，移植后的3個(gè)月與移植前相比無(wú)明顯變化。

三、不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)

1例患者曾在干細(xì)胞移植后當(dāng)晚發(fā)熱，體溫38℃，次日恢復(fù)正常，排除了顱內(nèi)或穿刺部位感染。其余患者干細(xì)胞移植期間及所有患者治療后6個(gè)月內(nèi)，未見(jiàn)不良反應(yīng)。

討論

顱腦損傷后遺癥患者的神經(jīng)功能恢復(fù)主要依賴(lài)于正常神經(jīng)元的代償作用及室管膜下區(qū)和海馬旁回的神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化[1-2]。但患者自身的干細(xì)胞數(shù)量有限，自我恢復(fù)的效果欠佳。因此，外源性干細(xì)胞移植為促進(jìn)腦創(chuàng)傷后遺癥患者神經(jīng)功能恢復(fù)提供了一條新的途徑。目前應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及部分臨床治療顱腦損傷的細(xì)胞主要有神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞等，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因取自骨髓，可以體外擴(kuò)增，能分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，為以后更好地治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供依據(jù)，成為神經(jīng)組織工程最具有潛力的種子細(xì)胞[3-4]。由它誘導(dǎo)分化而來(lái)的組織在進(jìn)行移植時(shí)不存在免疫排斥問(wèn)題，誘導(dǎo)分化的組織類(lèi)型廣泛等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值[5-9]。本研究采用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)33例顱腦損傷后痙攣性癱瘓患者進(jìn)行移植治療，符合倫理學(xué)原則，成本較低，在有條件的單位操作簡(jiǎn)便。當(dāng)然，質(zhì)量控制及檢測(cè)仍是進(jìn)行推廣之前必須考慮的。

對(duì)于顱腦疾病進(jìn)行干細(xì)胞移植的途徑主要有腦實(shí)質(zhì)內(nèi)移植、血液內(nèi)移植、蛛網(wǎng)膜下腔移植、腦室內(nèi)移植。以上各種移植途徑及其具體方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，學(xué)者們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究將它們加以比較。Bakshi等[10]比較了腰穿鞘內(nèi)注射、腦室內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射途徑移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞和定向神經(jīng)干細(xì)胞治療大鼠頸髓損傷，認(rèn)為腰穿鞘內(nèi)注射和腦室內(nèi)注射途徑能比靜脈內(nèi)注射途徑更有效地將細(xì)胞植入損傷的頸髓。本研究采用的移植途徑即為腰穿鞘內(nèi)移植，避免了腦室穿刺手術(shù)的切口愈合問(wèn)題，兼顧了較好的移植效果和較低的風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)1例發(fā)生顱內(nèi)感染。

腦卒中后出現(xiàn)肌張力增高是機(jī)體錐體束功能逐漸恢復(fù)的一種表現(xiàn)。如出現(xiàn)持續(xù)肌張力增高和痙攣狀態(tài)會(huì)影響患者肢體功能的恢復(fù)，進(jìn)而影響患者的生活質(zhì)量。因此及時(shí)的治療肌張力增高和痙攣狀態(tài)是腦卒中早期康復(fù)的重點(diǎn)之一。通過(guò)本研究的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果，可初步證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)顱腦損傷后患者持續(xù)肌張力增高和痙攣狀態(tài)具有較好的療效。當(dāng)然，本研究?jī)H采取自身前后對(duì)照，而缺乏對(duì)照病例，不能除外神經(jīng)系統(tǒng)自身康復(fù)的因素。

干細(xì)胞治療正在逐步發(fā)展成為標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用技術(shù)，目前仍需要克服一些特別的困難。在多數(shù)情況下，干細(xì)胞及其衍生物是一種全新產(chǎn)品，其安全性、穩(wěn)定性和效能的檢測(cè)鑒定，都需要有研究者的協(xié)助，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞安全性具有優(yōu)勢(shì)。干細(xì)胞的自我復(fù)制與分化難以控制，臨床轉(zhuǎn)化研究難以完全、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)人的細(xì)胞在患者身上可能引起的免疫或其他生物學(xué)反應(yīng)，本研究長(zhǎng)期、全面地檢測(cè)不良反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常組織和腫瘤形成。因此，該臨床研究為進(jìn)一步研究提供了安全性證據(jù)。采用非侵入性納米分子影像學(xué)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植后在腦內(nèi)的生長(zhǎng)、代謝及整合情況將逐漸成為評(píng)估神經(jīng)移植物安全性和療效的重要手段[11-12]。國(guó)內(nèi)外許多單位，包括本研究小組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已成功應(yīng)用該技術(shù)，下一步將轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用研究[13]。

總之，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)顱腦損傷后痙攣性癱瘓的肢體肌張力增高和運(yùn)動(dòng)障礙均有改善，移植后6個(gè)月內(nèi)通過(guò)臨床觀察及影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，為臨床治療顱腦損傷后遺癥提供了新方法。當(dāng)然，由于該研究缺乏對(duì)照組，確切的有效性尚需進(jìn)一步研究。

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Spastic paralysis after traumatic brain injury treated by autologous bone marrow mesenchymal stem cells

Yi Xicai1,Wei Lizhou1,Hei Yue1,Long Qianfa2,Wang Bochen1,Tian Qintao1,Zhou Yuefei, Liu Weiping1.1Department of Neurosurgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China;2Departmentof Neurosurgery,Xi′an Central Hospital,Xi′an 710003,China

Liu Weiping,Email:liuwp@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the clinical efficacy of autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on spastic paralysis after traumatic brain injury.M ethodsDuring May 2009 to April 2014,the clinical data about 33 patients with spastic paralysis after traumatic brain injury were retrospectively analyzed.Bone marrow puncture was performed under general anesthesia.Bonemarrow mesenchymal stem cells(2×107)were intrathecally transplanted once a week for four weeks.The measurement points contain before treatment,one month,three months and six months after treatment.Muscular tension and movement disorders were evaluated using modified Ashworth scale and Brunnstrom stage classification respectively.Besides that,brain PET/CT, electroencephalo-graphy and electromyography were recorded.ResultsMuscular tone was improved one month after treatment.Movement disorders were improved 3 months after treatment.PET/CT revealed the glucose metabolism defect was ameliorated in 5 cases 3 months after transplantation.No apparent change was found on the electroencephalography or electromyography after transplantation.ConclusionThe clinical efficacy of autologous bone marrow mesenchymal stem cells on spastic paralysis after traumatic brain injury was detected by modified Ashworth scale and Brunnstrom stage classification after treatment.No any adverse reactions in the treatment were found by clinical observation and imageological examination.

Brain injuries;Bonemarrowmesenchymalstem cells;Spasticparalysis;Muscletone

2015-12-20)

(本文編輯：張麗)

DOI∶10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.01.002

陜西省科技統(tǒng)籌基金資助項(xiàng)目（2013KTCL03-08）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科1；710003西安，西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科2

劉衛(wèi)平，Email：liuwp@fmmu.edu.cn

伊西才,魏禮洲,黑悅,等.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療顱腦損傷后痙攣性癱瘓[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志, 2016,2(1)∶5-8.