層粘連蛋白靶向NT3促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷的修復(fù)研究

樊娟 張振海 張國良 沈春森 羅永春 袁曉敏 張鵬飛 黨圓圓 徐如祥

·基礎(chǔ)研究·

層粘連蛋白靶向NT3促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷的修復(fù)研究

樊娟 張振海 張國良 沈春森 羅永春 袁曉敏 張鵬飛 黨圓圓 徐如祥

目的研制能與層粘連蛋白牢固結(jié)合的含有層粘連蛋白(laminin)結(jié)合域的NT3(LBDNT3)，探討其與損傷后增多的層粘連蛋白結(jié)合促進(jìn)腦損傷的修復(fù)機(jī)理。方法46只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組(8只)、假手術(shù)組(8只)、PBS組(10只)、NT3組(10只)、LBD-NT3組(10只)，制作液壓打擊模型后注射對應(yīng)的PBS或因子，利用水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評分，1個(gè)月后處死大鼠，通過大鼠腦組織免疫熒光染色，比較各組神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的增減，用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)做統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果LBD-NT3組大鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)更好，和假手術(shù)組大鼠相比，P=0.845＞0.05；與空白對照組相比，P=0.956＞0.05；與PBS相比，P=0.006＜0.05；與NT3組相比，P=0.089＞0.05。筆者進(jìn)一步得出，第17、18天，NT3組大鼠和LBD-NT3組有顯著性差異，P＜0.05。神經(jīng)元細(xì)胞較多，膠質(zhì)細(xì)胞較少，LBD-NT3與PBS組、NT3組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與空白對照組、假手術(shù)組未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論LBD-NT3和體內(nèi)增多的laminin結(jié)合后，大鼠腦組織損傷相對較小，周圍的神經(jīng)元較多，膠質(zhì)細(xì)胞較少，功能保留較好。

層粘連蛋白；創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)營養(yǎng)因子-3

創(chuàng)傷性腦損傷是一類嚴(yán)重影響家庭和社會的醫(yī)學(xué)問題，其分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性或延遲性損傷。神經(jīng)、血管的剪切力或擠壓傷導(dǎo)致直接受損部位的神經(jīng)組織壞死。延遲性損傷包括原發(fā)性損傷導(dǎo)致的炎癥或生物化學(xué)分子的急性、亞急性和延遲釋放。這些損傷能夠?qū)е聡?yán)重的組織破壞，如神經(jīng)元死亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生等。目前臨床治療腦損傷仍以去骨瓣加壓、清除血腫、后繼以脫水、控制出血、減少代謝障礙、營養(yǎng)神經(jīng)等為主，大多數(shù)新的治療策略還停留于實(shí)驗(yàn)室階段。應(yīng)用神經(jīng)組織工程移植神經(jīng)營養(yǎng)因子可能為腦損傷后中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)提供了有效的途徑。生長因子是神經(jīng)組織工程的關(guān)鍵要素之一。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一群小分子多肽，參與神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)育和維持，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持方面具有重要作用。腦損傷后NT3的mRNA水平會降低[1,2]，腦外傷后神經(jīng)修復(fù)可能需要大量的NT3，因此腦損傷后增加外源性NT3可能起到神經(jīng)保護(hù)作用，對中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)可能起到有效的治療作用。NT3可以支持損傷的中樞神經(jīng)元的存活，誘導(dǎo)神經(jīng)突生長，然而，由于神經(jīng)營養(yǎng)因子在體內(nèi)擴(kuò)散等，如何更好的發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，使之與生物支架協(xié)同作用于損傷修復(fù)成為關(guān)鍵點(diǎn)。層粘連蛋白 (laminin)是一種具有多種功能的基質(zhì)膜糖蛋白，當(dāng)神經(jīng)組織損傷時(shí)，細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)如laminin[3]，從而重構(gòu)損傷部位的細(xì)胞骨架，為組織損傷過程中的修復(fù)因子提供了天然的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)為細(xì)胞生長提供了支架，最終促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。本課題擬利用損傷后細(xì)胞外基質(zhì)laminin增多的原理，構(gòu)建并獲得新的能與層粘連蛋白牢固結(jié)合的含有層粘連蛋白結(jié)合域的NT3(LBD-NT3)，制備LBDNT3-laminin緩釋體系。將其用于腦損傷模型的修復(fù)，探討其治療腦損傷的有效性和安全性，為神經(jīng)營養(yǎng)因子治療腦損傷提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、制備天然NT3和LBD-NT3

利用基因工程技術(shù)重組NT3，從人腦組織中提取基因組cDNA，利用設(shè)計(jì)好的NT3成熟肽的上下游引物擴(kuò)增NT3成熟肽的編碼序列nt3，與帶有組氨酸親和標(biāo)簽的質(zhì)粒pET28a重組成pET28a-nt3。同時(shí)，在組氨酸親和標(biāo)簽和nt3之間連接層粘連蛋白結(jié)合區(qū) (laminin binding domain，LBD)， 構(gòu)建pET28a-LBD-nt3。同時(shí)構(gòu)建天然pET28a-NT3，將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-nt3和pET-LBD-nt3分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，再通過轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)、復(fù)性、純化及活性檢驗(yàn)，制備有活性的NT3和LBD-NT3(圖1)。

二、實(shí)驗(yàn)動物與分組

46只健康雄性SD大鼠(240-260 g)，維通利華動物中心提供隨機(jī)分組：空白對照組(8只)、假手術(shù)組組(8只)、PBS組(10只)、NT3組(10只)、LBD-NT3組(10只)，大鼠飼養(yǎng)和訓(xùn)練方案經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

三、主要試劑和儀器

液壓腦損傷模型打擊器，顯微鏡，立體定向儀及微量注射器，共聚焦顯微鏡，水迷宮儀，NeuN抗體、GFAP抗體(abcam公司)。

四、動物模型制作及標(biāo)本制備

水合氯醛麻醉大鼠后，隨機(jī)分組，空白對照組SD大鼠沿中線切開頭皮后直接縫合頭皮，假手術(shù)組組大鼠顯微鏡下利用立體定向儀定位損傷灶，以矢狀線和冠狀線交點(diǎn)為中心，向右向下3.0mm作為圓心，3.0mm長作為直徑，鉆一類圓形減壓窗后縫合頭皮。PBS組制作減壓窗(同假手術(shù)組)后用液壓打擊儀2.6 atm打擊制作腦損傷模型，微量注射15 ul的PBS。同理制作NT3和LBD-NT3組大鼠腦損傷模型，并分別微量注射15 ul的NT3和15 ul的LBDNT3。醒后自由喂食喂水。第14～18天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，1個(gè)月后處死大鼠，多聚甲醛灌注大鼠，小心取出腦組織，多聚甲醛繼續(xù)固定腦組織，后轉(zhuǎn)入30%蔗糖，15 um冰凍切片，免疫熒光染色。

五、水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮直徑180 cm，注水到28 cm，高于平臺10 cm。術(shù)后第14～18天連續(xù)5 d放大鼠入水迷宮中啟動程序，自由游2 min，大鼠等上平臺獲救后30 s程序自動停止，如果2min后大鼠仍未登上平臺，手動將大鼠挪到平臺停留1min。平臺定于第一象限，每只大鼠分別從其他三個(gè)象限入水三次，記錄大鼠痕跡、登平臺所需時(shí)間和路程，求平均值作為記錄值。第19天后將平臺取出，依舊將大鼠入水，測量大鼠穿越平臺次數(shù)。

六、H.E.和免疫熒光染色

大鼠腦組織冰凍切片，片厚15 um，切片做常規(guī)H.E.染色(不詳述)和NeuN、GFAP免疫熒光染色。組織切片取出后10%羊血清37度封閉2 h，分別以NeuN(1∶1 000)和GFAP(1∶800)作為一抗，4度過夜，PBS洗三遍，再分別以FITC-anti-mouse 555(1∶500)和FITC-anti-mouse 555(1∶1 000)為二抗室溫下放置2 h，PBS洗三遍，DAPI封片，共聚焦顯微鏡下照片(200倍)。每只大鼠腦組織隨機(jī)染三張組織切片，每張組織切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析統(tǒng)計(jì)比較NeuN陽性細(xì)胞數(shù)和GFAP平均光密度值，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析統(tǒng)計(jì)比較水迷宮的時(shí)間和路程。

結(jié)果

一、NT3和LBD-NT3的表達(dá)

利用基因工程技術(shù)，本次研究成功建立nt3和LBD-nt3，并表達(dá)純化，得到所需要的天然NT3和LBD-NT3，Western Blot驗(yàn)證兩種因子(圖1)。

圖1 大鼠到達(dá)平臺所用時(shí)間、路程和大鼠穿越平臺次數(shù)的比較

水迷宮是檢驗(yàn)大鼠腦損傷后學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，本次研究數(shù)據(jù)化的得出結(jié)論，LBD-NT3的表現(xiàn)更優(yōu)于PBS和NT3組，特別是經(jīng)訓(xùn)練后，也就是術(shù)后第16、17、18天其表現(xiàn)更加優(yōu)秀，和假手術(shù)組大鼠相比，P=0.845＞0.05；與空白對照相比，P=0.956＞0.05；與 PBS相比，P=0.006＜0.05；與NT3組相比，P=0.089＞0.05。筆者發(fā)現(xiàn)似乎與NT3組大鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但比較每天的NT3和LBD-NT3結(jié)果，筆者進(jìn)一步得出，第17、18天，NT3組大鼠和LBD-NT3組有顯著性差異(表1、2)。

H.E.染色顯示大腦損傷灶大小，筆者可以經(jīng)過這個(gè)組織輪廓看出，PBS和NT3組向下向外周的繼發(fā)性侵蝕更加明顯，而LBD-NT3組大鼠腦組織的損傷灶相對較小(圖2)。逼向想看到損傷灶周圍細(xì)胞生長情況，NeuN和GFAP分別是神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的檢驗(yàn)指標(biāo)，通過他們的表達(dá)，筆者可以分析病灶周圍細(xì)胞生長情況，從而分析神經(jīng)再生情況(圖3、4)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，本次研究得出NeuN陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)和GFAP平均光密度值的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)(表3、4)。

表1 水迷宮時(shí)間(s)(±s)

表1 水迷宮時(shí)間(s)(±s)

分組假手術(shù)組 空白對照組 PBS NT3 LBD-NT3時(shí)間 64.862±3.682 64.331±5.689 84.593±3.005 73.309±3.362 63.987±3.196

表2 水迷宮路程(±s)

表2 水迷宮路程(±s)

分組假手術(shù)組 空白對照組 PBS NT3 LBD-NT3路程 579.82±67.28 576.34±108.77 830.37±42.77 771.74±42.54 544.21±64.08

圖2 H.E.染色顯示大鼠缺損腦組織(×6.3)

圖3 免疫熒光染色NeuN表達(dá)(×200)

討論

越來越多的研究證明，中樞神經(jīng)并非不能再生，提供損傷灶周圍良好的微環(huán)境有利于組織再生。早期應(yīng)用生長因子的方式是簡單注入，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子的半衰期都非常短，發(fā)揮生物活性作用的時(shí)間有限，加上中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)腦脊液循環(huán)的存在和損傷后血液流失造成NT3快速流失[4]，無法在局部腦組織中達(dá)到有效濃度。滲透泵等可以調(diào)控生長因子的釋放，但這些裝置有較高的感染潛力，而且由于他們是非降解物，容易引起感染。移植可分泌NT3的基因工程細(xì)胞和攜帶NT3基因的病毒載體可能導(dǎo)致免疫排斥及病毒性損害。細(xì)胞外基質(zhì)是體內(nèi)天然存在的物質(zhì)，包括膠原蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白等。1979年Aumailley等[5]首先報(bào)道層粘連蛋白(laminin)。Laminin是一種具有多種功能的基質(zhì)膜糖蛋白，有三個(gè)亞單位，即重鏈(α鏈，400 kDa)和β1(215 kDa)、β2(205 kDa)兩條輕鏈借二硫鍵交聯(lián)而成，結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)不對稱的十字形，由一條長臂和三條相似的短臂構(gòu)成。Laminin由圍繞周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突的雪旺細(xì)胞及腦損傷后由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。這種蛋白有多種生物學(xué)作用，比如促進(jìn)細(xì)胞存活和血管形成，促進(jìn)周圍和中樞神經(jīng)元的軸突延伸、生長，促進(jìn)細(xì)胞遷移、軸突生長及突觸形成[6]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外基質(zhì)中富含laminin，當(dāng)神經(jīng)組織損傷時(shí)，細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)如laminin[7]和纖維蛋白[8]，從而重構(gòu)損傷部位的細(xì)胞骨架，為組織損傷過程中的修復(fù)因子提供了天然的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)為細(xì)胞生長提供了支架，最終促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。Laminin在正常的大腦組織中含量很少[9]，在腦損傷后可經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，在腦損傷灶附近明顯提高長達(dá)14 d[9]。使用laminin為基礎(chǔ)的支架可能提高移植物的存活和整合，從而加強(qiáng)了腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)[10-12]。同時(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的炎癥反應(yīng)中，laminin可以有效地減少白細(xì)胞在缺血組織中的堆積，縮小了壞死面積，提高了神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]。本研究利用基因重組技術(shù)制備LBD-NT3，利用腦損傷時(shí)laminin大量表達(dá)的原理，制備LBDNT3-laminin緩釋系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)的緩釋原理將進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 免疫熒光染色GFAP表達(dá)(×200)

表3 NeuN陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

表3 NeuN陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

分組假手術(shù)組 空白對照組 PBS NT3 LBD-NT3 NeuN陽性細(xì)胞數(shù) 430.86±197.72 507±141.85 243.43±87.06 310.86±127.66 425.57±107.84

表4 GFAP平均光密度值(%)(±s)

表4 GFAP平均光密度值(%)(±s)

分組假手術(shù)組 空白對照組 PBS NT3 LBD-NT3 GFAP平均光密度值 0.017±0.005 0.033±0.022 0.062±0.016 0.055±0.014 0.028±0.010

制作液壓打擊模型在Dixon等[14]和McIntosh等[15]的文章中有詳細(xì)記載，是一種Plexiglas圓柱形的水柱，長60 cm，直徑4.5 cm，里面灌滿雙蒸水的密封器械。制作這種液壓打擊模型相較于中立打擊腦損傷模型，有較高的穩(wěn)定性，制備的模型更一致，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，筆者以為更適合于實(shí)驗(yàn)研究。

腦損傷灶注射LBD-NT3的大鼠腦組織，與注射PBS和NT3的大鼠相比，損傷灶周圍有更多的神經(jīng)元，差異具有顯著性；而膠質(zhì)細(xì)胞的減少也具有顯著性差異。筆者推測，單純的NT3與組織的結(jié)合性較低，LBD-NT3與損傷灶的laminin結(jié)合，延緩了因子的釋放，使因子停留在損傷灶周圍時(shí)間更久，因此能夠更好地促進(jìn)神經(jīng)再生和組織修復(fù)。有神經(jīng)營養(yǎng)因子的環(huán)境使得神經(jīng)元再生較多，膠質(zhì)細(xì)胞減少，這樣膠質(zhì)瘢痕形成較少。從大體標(biāo)本筆者可以看出，LBD-NT3組腦組織的缺損灶也相對較小，而且形狀較規(guī)則，大多局限于原損傷灶，而其他組，特別是PBS組，原損傷灶周圍由于可能的繼發(fā)細(xì)胞死亡、組織軟化，形成了更大的損傷灶。這種組織損傷的不同造成大鼠術(shù)后功能保存的差異。水迷宮是評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，大多在14～19 d進(jìn)行，此期間大鼠已得到比較理想的恢復(fù)。LBD-NT3組大鼠的恢復(fù)更快，完成水迷宮任務(wù)的能力也更強(qiáng)。在水迷宮試驗(yàn)中，可以看到PBS組大鼠由于左側(cè)肢體運(yùn)動能力尚欠佳，前幾天幾乎不能完成任務(wù)，進(jìn)步也相對較慢，NT3稍好，但相比之下，LBD-NT3組大鼠恢復(fù)速度喜人，大多能很快完成任務(wù)，獲得自救，尋找平臺也更有目的更直接。

通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，筆者得出結(jié)論：LBD-NT3組大鼠腦損傷周圍的神經(jīng)元能保存或再生更多，膠質(zhì)瘢痕形成較少，恢復(fù)較快，也具有更好地學(xué)習(xí)記憶能力。

[1]Hicks RR,Numan S,Dhillon HS,et al.Alterations in BDNF and NT-3mRNAs in rat hippocampus after experimental brain trauma [J].Mol.Brain Res,1997,48(2)∶401-406.

[2]Hicks RR,Zhang L,Atkinson A,et al.Environmental enrichment attenuates cognitive deficits,but does not alter neurotrophin gene expression in the hippocampus following lateral fluid percussion brain injury[J].Neuroscience,2002,112(3)∶631-637.

[3]Hausmann R,Betz P.The time course of the vascular response to human brain injury--an immunohistochemical study[J].Int J LegalMed,2000,113(5)∶288-292.

[4]McTigue DM,Horner PJ,Stokes BT,et al.Neurotrophin-3 and brain-derived neurotrophic factor induce oligodendrocyte proliferation and myelination of regenerating axons in the contused adult rat spinal cord[J].J Neurosci,1998,18(14)∶5354-5365.

[5]Aumailley M,Bruckner-Tuderman L,Carter WG,et al.A simplified laminin nomenclature[J].Matrix Biol,2005,24(5)∶326-332.

[6]Colognato H,Yurchenco PD.Form and function∶the laminin family of heterotrimers[J].Dev Dyn,2000,218(2)∶213-234.

[7]Perris R,Perissinotto D.Role of the extracellular matrix during neural crest cellmigration[J].Mech Dev,2000,95(1-2)∶3-21.

[8]Liu HM,Sturner WQ.Extravasation of plasma proteins in brain trauma[J].Forensic Sci Int,1988,38(3-4)∶285-295.

[9]Bellail AC,Hunter SB,Brat DJ,et al.Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion[J]. Int JBiochem Cell Biol,2004,36(6)∶1046-1069.

[10]Cullen DK,Stabenfeldt SE,Simon CM,et al.In vitro neural injurymodel for optimization of tissue-engineered constructs[J].J Neurosci Res,2007,85(16)∶3642-3651.

[11]Hausmann R,Betz P.The time course of the vascular response to human brain injury—an immunohistochemical study[J].Int J LegalMed,2000,113(5)∶288-292.

[12]Tate CC,Shear DA,Tate MC,et al.Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain[J].JTissue Eng Regen Med,2009,3(3)∶208-217.

[13]Yanaka K,Camarata PJ,Spellman SR,et al.Laminin peptide ameliorates brain injury by inhibiting leukocyte accumulation in a ratmodel of transient focal cerebral ischemia[J].JCereb Blood Flow Metab,1997,17(6)∶605-611.

[14]Dixon CE,Lyeth BG,Povlishock JT,et al.A fluid percussion model of experimental brain in-jury in the rat[J].J.Neurosurg, 1987,67(1)∶110-119.

[15]McIntosh TK,Vink R,Yamakami I,et al.Magnesium protects against neurological deficit after brain injury[J].Brain Res,1989, 482(2)∶252-260.

Lam inin targeted NT3 promotes traumatic brain injury repair

Fan Juan,Zhang Zhenhai,Zhang Guoliang,Shen Chunsen,Luo Yongchun,Yuan Xiaomin,Zhang Pengfei,Dang Yuanyuan.Departmentof Neurosurgery Research Institute,The Military General Hospital of Beijing PLA,100700 Beijing,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

ObjectiveTo construct and prepare laminin binding domain NT3(LBD-NT3), exploring itsmechanism to promote brain injury repaire with increasing laminin.M ethodsFourty-six rats were grouped into naive(8)、sham(8)、PBS(10)、NT3(10)、LBD-NT3(10)random ly.Following hydraulic strike,PBSor NT3 or LBD-NT3 was injected into the lesion.Behavioral testwent on by the Morriswater maze task.One month after the operation,the rats were perfused and executed,neuron and glial cell were compared by NeuN and GFAP separately with Immunofluorescence staining.Statistical analysiswas made by SPSS 19.0.ResultsIn the Laminin-NT3 group,rats performed better in Morris watermaze task,P＜0.05(compared with PBS),P＞0.05(compared with na?ve、sham、NT3)，but significantly better than NT3 group on 17th、18thday（P＜0.05）.LBD-NT3 had more positive NeuN cells and and less GFAP expression than PBS、NT3（P＜0.05）.There was statistical significance among the groups.ConclusionLBD-NT3 could bind to the increasing laminin.Therefore,the brain lesion was smaller,neurons increased and glial cells decreased.

Laminin; Traumatic brain injury; Neurotrophin-3

2015-12-02)

(本文編輯：楊藝)

DOI∶10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.01.007

國自然基金青年項(xiàng)目(81200959)

100700北京，北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科研究所

徐如祥，Email：zjxuruxiang@163.com

樊娟,張振海,張國良,等.層粘連蛋白靶向 NT3促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷的修復(fù)研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志, 2016,2(1)∶26-30.