SELEX技術(shù)及其在植物檢疫中的應(yīng)用前景

李建勇，王英超，王　飛，紀(jì)　瑛，厲　艷，吳興海，王　簡，邵秀玲.濟(jì)南出入境檢驗檢疫局，山東濟(jì)南5004.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島6600

?

SELEX技術(shù)及其在植物檢疫中的應(yīng)用前景

李建勇1，王英超2，王飛1，紀(jì)瑛2，厲艷2，吳興海2，王簡2，邵秀玲2
1.濟(jì)南出入境檢驗檢疫局，山東濟(jì)南250014
2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002

摘要：SELEX是從人工體外合成的隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的適配體的篩選技術(shù)。該技術(shù)的基本途徑主要是通過人工合成的隨機(jī)寡核苷酸序列文庫，歷經(jīng)篩選、分離、富集得到能與各種配體結(jié)合的寡核苷酸適配體，具有高特異性、高親和力和穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)。本文綜述了SELEX技術(shù)的發(fā)展，介紹了目前的研究進(jìn)展，以及該技術(shù)在植物檢疫領(lǐng)域中的應(yīng)用情況，并對其前景進(jìn)行分析和展望。

關(guān)鍵詞：SELEX技術(shù)；植物檢驗檢疫；應(yīng)用

美國的Gold和Ellington首先提出并命名了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligan ds by exponential enrichment，SELEX），該技術(shù)主要是從人工體外合成的隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的適配體（Aptamer）的篩選技術(shù)[1]。該技術(shù)的基本途徑主要是通過人工合成的隨機(jī)寡核苷酸序列文庫，歷經(jīng)篩選、分離、富集得到能與各種配體結(jié)合的寡核苷酸適配體，而這種適配體具有高特異性、高親和力和穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)。目前SELEX技術(shù)篩選的靶分子不僅包括無機(jī)離子、小分子有機(jī)化學(xué)物、核酸、蛋白質(zhì)等，甚至擴(kuò)展到了完整的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌病原體等復(fù)雜靶分子[2-5]。本文主要介紹SELEX技術(shù)在微生物鑒定方面的應(yīng)用及在植物檢疫中的應(yīng)用前景。

1　SELEX技術(shù)的發(fā)展

隨著SELEX技術(shù)研究的深入，近年來在傳統(tǒng)SELEX技術(shù)基礎(chǔ)上不斷發(fā)展和完善各類衍生SEL EX技術(shù)，如導(dǎo)向SELEX技術(shù)（Blended SELEX）、基因組SELEX（Genomic SELEX）、復(fù)合靶分子SELEX（Complex targets SELEX）、細(xì)胞消減SELEX技術(shù)（Subtractive SELEX）等，這些技術(shù)在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、藥物篩選、食品安全分析等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。其中，導(dǎo)向SEL EX技術(shù)是將能特定的與需要研究的物質(zhì)如蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子制備成一個寡核苷酸文庫，這樣借助SELEX篩選出的寡核苷酸適配體只與蛋白上的特異表位高度專一的結(jié)合，避免了它與細(xì)胞內(nèi)一些未知成分結(jié)合，從而增加了篩選的特異性。基因組SELEX，是從生物體的基因組寡核苷酸文庫中篩選蛋白質(zhì)、多糖等生活活性物質(zhì)的靶序列，通過篩選的天然識別序列，可以更快更好地發(fā)現(xiàn)新的蛋白結(jié)合位點(diǎn)、蛋白質(zhì)合成以及研究蛋白與核酸間的相互作用、復(fù)雜調(diào)控元件等[6]。

復(fù)合靶分子SELEX技術(shù)以多種分子構(gòu)成混合靶標(biāo)，可同時篩選出多種靶分子的適配子而不互相干擾。但這種有關(guān)復(fù)合靶子SELEX的研究均建立在已知的靶分子基礎(chǔ)上[7-9]。細(xì)胞消減SELEX（Subtractive SELEX）的技術(shù)優(yōu)勢主要是在目標(biāo)靶分子未知的條件下，使用與目標(biāo)細(xì)胞近似或同源性的和細(xì)胞寡核苷酸文庫進(jìn)行消減篩選，從而去除文庫中的均能夠識別目標(biāo)細(xì)胞和同源細(xì)胞的適配體，最終獲得能特異識別目標(biāo)細(xì)胞（靶細(xì)胞）的寡核苷適配體[10]。2009年李慧[11]等，在目標(biāo)細(xì)胞（已分化PC12細(xì)胞）與對照細(xì)胞（未分化PC12細(xì)胞）之間分子差異未知的條件下，首次成功地應(yīng)用消減細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選到了能特異識別目標(biāo)細(xì)胞而不識別對照細(xì)胞的單鏈DNA（ssDNA）適配體，從而將SELEX技術(shù)篩選的靶分子擴(kuò)展到了完整細(xì)胞等復(fù)雜分子。以上幾種衍生SELEX技術(shù)在微生物鑒定方面也得到了較好的應(yīng)用。

2　SELEX技術(shù)在微生物鑒定方面的應(yīng)用

近年來，SELEX技術(shù)越來越受到人們的重視。目前，國內(nèi)外已有利用SELEX技術(shù)在生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥、食品安全檢測中應(yīng)用的相關(guān)報道。在微生物鑒定方面，如醫(yī)學(xué)疫病診斷、食品微生物檢測也有相關(guān)的研究和報道。

2.1在醫(yī)學(xué)疫病診斷中的應(yīng)用

通過SELEX技術(shù)篩選得到的適配體與靶物質(zhì)結(jié)合具有高特異性、高親和力和良好穩(wěn)定性的特點(diǎn)，這種特點(diǎn)可以在微生物鑒定包括醫(yī)學(xué)疾病診斷中得到具體廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前應(yīng)用核酸適配體檢測靶蛋白的研究比較多，但成熟的臨床應(yīng)用報道還比較少。

Horii等[12]通過SELEX技術(shù)篩選針對神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿（Sphingosyl phosphoryl choline，SP C）的特異性RNA適配體，該適配體與分磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate，S1P）無交叉反應(yīng)，應(yīng)用這種篩選技術(shù)可以較好的研究SPC的生物學(xué)功能及臨床診斷。在流感病毒的分型診斷研究中，Go pinath等[13]通過SELEX技術(shù)篩選與B型流感病毒血球凝集素蛋白無交叉反應(yīng)的適配體，通過該適配體的研究為該病毒的分型診斷提供了堅實(shí)的基礎(chǔ)。詹林盛等[14]以重組的丙型肝炎病毒（Hepatitis C v irus，HCV）C蛋白為靶蛋白，從人工體外合成的隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體，為有效研究丙型肝炎病毒C蛋白抗原檢測和以C蛋白為靶位的抗HCV治療提供了有價值的工具。李衛(wèi)濱等[15]運(yùn)用SELEX技術(shù)從合成的隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選到針對全血環(huán)孢素A的特異性適配體，該方法采用生物素鏈親和素磁珠分離法制備次級文庫，為全血環(huán)孢素A濃度的快速而簡便的實(shí)驗室診斷提供了新的思路和方法。王立峰等[16]通過SELEX技術(shù)，通過7輪篩選獲得癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）的特異性適配體，該適配體與純化的癌胚抗原和天然狀態(tài)的癌胚抗原蛋白都有很好的特異性，為建立癌胚抗原腫瘤的靶向診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。甘龍杰等[17]通過SELEX技術(shù)篩選出了對金黃色葡萄球菌外毒素B（Staphylococcal enterotox in B，SEB）特異性的適配體（A11），通過對臨床6例患者血清標(biāo)本的檢測，表明該適配體特異性強(qiáng)，能夠簡便、快速、靈敏的識別SEB患者血清，具有很好的應(yīng)用前景。

2.2在食品微生物檢測中的應(yīng)用

在食品微生物檢測方面，SELEX技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合在微生物鑒定方面應(yīng)用較為廣泛。

Joshi等[18]通過SELEX技術(shù)篩選獲得了針對腸道血清型沙門氏菌的特異性適配體，將該適配體與磁珠連接，能夠在沙門氏菌病原水平較低的情況下抓捕并檢測到該菌，檢測下限為10-102CFU/mL，為食品和環(huán)境樣品中沙門氏菌的檢測提供了新的思路和方法。Hye等[19]將從大腸桿菌中篩選的核酸適配體與RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了檢測大腸桿菌的方法，該方法線性范圍為10-107CFU/ mL，檢測下限為10 E.coli /mL。Edith和Alociljac[20]對適配體生物傳感器在微生物檢測中的應(yīng)用做了較為全面的回顧及展望。Ohk[21]等應(yīng)用核酸適配體與抗體功能化的光導(dǎo)纖維生物傳感器對人工污染的牛肉、雞肉等食品中的李斯特菌進(jìn)行了特異性檢測，檢測下限為103CFU/mL。國內(nèi)研究方面，曹曉曉等[22]通過細(xì)菌消減SELEX技術(shù)，以完整的金葡菌細(xì)菌為目標(biāo)靶，使用與金葡菌細(xì)菌近似或同源性的鏈球菌和表皮葡萄球菌為消減靶，和寡核苷酸文庫進(jìn)行消減篩選，最終獲得一組能特異識別金葡菌的寡核苷適配體，結(jié)合流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測，能夠?qū)⒔鹌暇拖麥p靶細(xì)菌及大腸桿菌進(jìn)行有效的區(qū)分，大大提高了對各型金葡菌的檢出率。

3　SELEX技術(shù)在植物檢疫工作的應(yīng)用前景

3.1口岸植物檢疫存在的難題

植物檢驗檢疫從常規(guī)的分離技術(shù)如分離、純化、培養(yǎng)、鑒定逐步發(fā)展到免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法。分子生物學(xué)檢測從普通的PCR技術(shù)、巢式PCR到目前先進(jìn)的LAMP、實(shí)時熒光PCR、基因芯片等檢測技術(shù)，檢測的靈敏度有了很大的提高，能夠滿足檢疫部門日常檢測的需要，使外來有害生物傳入的風(fēng)險大大降低。但在實(shí)際口岸檢疫中，由于研究資料的缺乏和技術(shù)的限制，常常面臨以下幾個難題：

首先，現(xiàn)有的植物病原細(xì)菌分子檢測技術(shù)，無論是常規(guī)PCR，還是實(shí)時熒光PCR、基因芯片等都是以16 SrDNA作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記，分子標(biāo)記單一。而細(xì)菌中其他基因的序列大部分未知，無從設(shè)計引物。急需通過新的技術(shù)發(fā)現(xiàn)病原細(xì)菌特異性寡核苷酸或蛋白序列，為分子檢測奠定基礎(chǔ)。

其次，變種分型難。新修訂并公布的《進(jìn)境植物檢疫危險性病蟲雜草名錄》中有的植物病原細(xì)菌特別是致病變種，在現(xiàn)有技術(shù)和研究資料下，還不能有效區(qū)分，給口岸檢疫鑒定帶來一定的困難。

再次，富集困難。進(jìn)口種子中種傳病原細(xì)菌含量低，常規(guī)的病原富集技術(shù)難以實(shí)施，造成許多微量病原菌的漏檢。而目前的分子檢測技術(shù)都是以分離到病原菌并提取到目標(biāo)病原菌的DNA為前提的，因此在病原菌含量低的情況下分子檢測技術(shù)也無能為力。急需研究有效的病原細(xì)菌富集技術(shù)。

3.2SELEX技術(shù)在植物檢疫工作上的優(yōu)勢及應(yīng)用前景

目前國內(nèi)外還沒有SELEX技術(shù)在植物檢疫上應(yīng)用的報道。在口岸檢疫中，為了解決植物病原細(xì)菌分子檢測采用分子進(jìn)化標(biāo)記單一；種傳病害中致病菌的含量低而難以施檢；有些病原細(xì)菌的致病變種不能很好的區(qū)分；很多致病性細(xì)菌基因水平研究不夠深入，并且病原細(xì)菌在不同狀態(tài)下很容易發(fā)生變異，致使很多疾病在其發(fā)病早期無法檢測到或是被漏檢等問題，我們可以通過構(gòu)建以完整細(xì)胞為靶子的SELEX技術(shù)，把病原細(xì)菌看做是一個含有多種成分的復(fù)合物，以整個細(xì)菌作為靶分子進(jìn)行篩選，就可以在未知細(xì)菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能的情況下篩選出與其特異性結(jié)合的一組適配體，這組特異性的適配體與單個適配體相比，能提高細(xì)菌檢出的敏感性和特異性。同時，適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合方式同抗原-抗體反應(yīng)相似，具有高度識別并特異性結(jié)合靶物質(zhì)的能力。若與磁珠偶聯(lián)結(jié)合使用，可以作為病原富集的捕捉分子，大大提高對微量病原菌的富集能力?？梢钥闯?，SELEX技術(shù)有優(yōu)勢可以解決目前植物檢疫工作中的面臨的諸多難題。

因此在植物檢疫領(lǐng)域，我們可以建立基于SELEX技術(shù)的植物病原細(xì)菌特異性寡核苷酸適配體的篩選，通過篩選到的寡核苷酸適配體，結(jié)合富集技術(shù)、表面等離子共振（Surface plasmon resonanc e，SPR）技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface enhanced raman spectroscopy，SERS）技術(shù)、微流控技術(shù)、量子點(diǎn)等技術(shù)中的一種或幾種進(jìn)行致病菌快速、高通量檢測，并形成體系。不僅為植物病原細(xì)菌致病變種和植原體病害的快速檢測方法建立奠定基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)植物病原菌快速檢測的整套解決方案，而且在植物檢疫領(lǐng)域應(yīng)用SELEX技術(shù)，必將開拓一個集綜合材料學(xué)、生物學(xué)、信息學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科在內(nèi)的前沿技術(shù)領(lǐng)域，為口岸檢測技術(shù)的飛躍打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。

4　展望

目前，應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選適配體在生物醫(yī)學(xué)、食品檢測等多個領(lǐng)域得到了證明，但是能夠大規(guī)模應(yīng)用還為時尚早。這其中重要的原因主要有，篩選的合適的適配體數(shù)目相對較少；適配體的篩選過程較為煩瑣，過程中對適配體的修飾等方案還需優(yōu)化，這影響了適配體的穩(wěn)定性和特異性；由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，實(shí)驗室篩選的適配體在實(shí)際應(yīng)用中可能效果不理想。當(dāng)然隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步特別是SELEX技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，種種問題終將解決，SELEX技術(shù)必將在各個領(lǐng)域，當(dāng)然也包括植物檢疫領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] Ulrich H，Martins AH，Pesquero JB. RNA and DNA aptamers in cytomics analysis[J]. Cytometry，2004，59A（2）:220-231

[2] Konopka K，Lee NS，Rossi J，et al. Rev－binding aptamer and CMV promoter a decoys to inhibit HIV replication[J]. Gene，2000，255（2）:235-244

[3] Gal SW，Amontov S，Urvil PT，et al. Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits its protease function[J]. Eur J Biochem，1998，252（3）:553-562

[4] Herr JK，Smith JE，Medley CD，et al. Aptamer－conjugated nanoparticles for selective collection and detection of cancer cells[J]. Anal Chem，2006，78:2918-2924

[5] Tang Z，Shangguan D，Wang K，et al. Selection of aptamers for molecular recognition and characterization of cancer cells [J]. Anal Chem，2007，79:4900-4907

[6] Pan W，Xin P，Clawson GA. Minimal primer and primer-free SELEX protocols for selection of aptamers from random DNA libraries[J]. Antimicrob Agents Chemother，2008，52（6）:2097-110

[7] Morris KN，Jensen KB，Julin CM，et al. High afinity ligands from in vitro selection: complex targets [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998（95）:2902-2907

[8] Blank M，Weinschenk T，Priemer M，et al. Systematic evolution of a DNA aptamer binding to rat brain tumor microvessels selectivetargeting of endothelial regulatory protein pigpen [J]. J Biol Chem，2001，276（19）:16464-16468

[9] Hick BJ，Marion C，Chang YF，et al. Tenascin－C aptamers are genetated using tumer cells and purified protein [J]. J Biol Chem，2001，276（52）:48644-48654

[10] Wang C，Zhang M，Yang G，et al. Single－stranded DNA aptamers that bind differentiated but not parental cells:subtractive systematic evolution of ligands by exponential enrichment [J]. Biotechnology，2003，102:15-22

[11] Li H，Xu H，Ding HM，et al. Identification of an aptamer targeting hnRNPA1 by tissue slide－based SELEX [J]. Pathology，2009，218:327-336

[12] Ho riiK，OmiK，Yo shida Y，et al. Development of a sphingo sylpho spho ry lcho line detection system using RNA aptamers. Molecules[ J]. 2010，15（8）:5742-5755

[13] Gopinath SC，Kawasaki K，Kumar PK. Selection o f RNA-aptamer against human influenza B virus[ J]. Nucleic Acids Symp Ser（Ox f），2005（49）:85- 86

[14]詹林盛，孫紅琰，彭劍淳，等.丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸適配子的篩選與鑒定[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2002，22（5）:578-581

[15]李衛(wèi)濱，蘭小鵬，楊湘越，等.SELEX技術(shù)在篩選環(huán)孢霉素A適體中的運(yùn)用[J].福州總醫(yī)院學(xué)報，2007，14（3）:171-173

[16]王立峰，魏嘉，殷海濤，等.癌胚抗原特異性寡核苷酸適配子的體外篩選及其意義[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2007，20（9）:903-907

[17]甘龍杰，蘭小鵬，江麗，等.金黃色葡萄球菌外毒素B特異性適體的篩選及其應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（2）:232-235

[18] Joshi R，Janagama H，Dwivedi H P，et al. Selection, characterization，and application of DNA aptamers for the capture and detection o f Salmonellaen terica sero vars[J]. Mol Cell Probes，2009，23（1）:20-28

[19] Hye JL，Byoung CK，Kyung WK，et al. A sensitive method to detect Escherichia coli based on immunomagnetic separation and real-time PCR amplification of aptamers[J]. Biosensors and Bioelectronics，2009，24（12）:3550-3555

[20] Edith TC，Alocilja EC. Aptasensors for detection of microbial and viral pathogens[J]. Biosensors and Bioelectronics，2009，24（11）:3175-3182

[21] Ohk S，Koo O，Sen T，et al. Antibody-aptamer functionalized fibre-optic biosensor for specific detection of Listeria monocytogenes from food[J]. Journal of Applied Microbiology，2010，109（3）:808-817

[22] Cao X，Li S，Chen L，et al. Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res，2009，37（14）:4621-4628

Application Prospects of SELEX Technology in Plant Quarantine

LI Jian-yong1，WANG Ying-chao2，WANG Fei1，JI Ying2，LI Yan2，WU Xing-hai2，WANGJian2，SHAOXiu-ling2
1. Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine, Jinan 250014，China
2. Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine, Qingdao 266002，China

Abstract:SELEX is a new combinatorial technique screening the oligonucleotide sequence which is specific combined with various target molecules in vitro. The selectivity，affinity and stability of SELEX are high. The specific adapters can be found in the synthetic oligonucleotide library by screening，separation and enrichment. The article reviewed the progress and application of the SELEX in plant quarantine and analyzed its prospect and an outlook.

Keywords:SELEX；plant quarantine；application

作者簡介：李建勇（1970-），男，博士，高級農(nóng)藝師.主要從事植物檢疫工作. E-mail:lijianyong1996@sohu.com

基金項目：國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2015IK213、2013IK293）；山東檢驗檢疫局科技計劃項目（SK201437）；山東省科技攻關(guān)項目（2011GGB0003）

收稿日期：2015-11-11修回日期：2015-12-16

中圖法分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）01-0060-04