阿魏酸酯酶O42807在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

陳云華， 李慧， 張光亞， 葛慧華， 李夏蘭

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

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阿魏酸酯酶O42807在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

陳云華， 李慧， 張光亞， 葛慧華， 李夏蘭

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

摘要：研究阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)及重組阿魏酸酯酶的酶學(xué)特性.化學(xué)合成fae基因序列，構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒pPIC9K-fae，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，對篩選出的高活性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE分析顯示：發(fā)酵上清液為單一條帶，表觀相對分子質(zhì)量為42 ku，酶活為78.49 nkat·mL-1，比活力為524.38 nkat·mg-1，最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40～45 ℃溫度范圍內(nèi)較穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為5.0～5.5，且在pH值為6.0時，穩(wěn)定性較好;金屬離子K+，Ca2+，Na+對其活性有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+，Zn2+有一定的抑制作用，而Mn2+，Cu2+對其有明顯的抑制作用.

關(guān)鍵詞：阿魏酸酯酶； 表達(dá)； 畢赤酵母； 酶學(xué)性質(zhì)

植物細(xì)胞壁中，酚酸類物質(zhì)(如阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸等)通過酯鍵與多糖(如阿拉伯木聚糖、果糖)的阿拉伯糖基或半乳糖基相連，或者通過醚鍵與木質(zhì)素相連，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1].阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，F(xiàn)AE，EC 3.1.1.73) 又名肉桂酸酯酶，能水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放出阿魏酸等功能性物質(zhì).FAE可以協(xié)同木聚糖酶、木質(zhì)素酶破壞木質(zhì)纖維的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得疏松，從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素完全降解[1-2].FAE對木質(zhì)纖維廢棄物利用有著重要意義[3].至今,已經(jīng)從細(xì)菌和真菌中分離得到40多種FAE，但目前報道的FAE的酶活及表達(dá)量都達(dá)不到工業(yè)需要[4-6].畢赤酵母(Pichiapastoris)可高密度地發(fā)酵培養(yǎng)，其菌體量可達(dá)130 g·L-1干細(xì)胞重，在生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白動物飼料方面發(fā)揮重要作用[7-8].畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)比大腸桿菌(Escherichiacoli)體系有更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，并具有原核細(xì)胞系統(tǒng)生長速度快、便于基因操作和可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點[9].本文對阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)及重組阿魏酸酯酶的酶學(xué)特性進(jìn)行研究.

1材料和方法

1.1主要材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒E.coliDH5α為本實驗室保存；畢赤酵母GS115，載體pAO815，pPIC9K均購自美國Invitrogen公司.

1.1.2主要試劑和培養(yǎng)基 限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ，HindⅢ，SnaBⅠ，NotⅠ，BglⅡ)，T4 DNA連接酶(立陶宛Fermenstas公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒(上海Sangon公司)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker(14.4～116.0 ku),SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；阿魏酸甲酯(美國Sigma公司)；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品.MD培養(yǎng)基、YPD種子培養(yǎng)基、BMGY種子培養(yǎng)基、BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基按《畢赤酵母操作表達(dá)手冊》(美國Invitrogen公司)配制.

1.2pAO815-fae表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)阿魏酸酯酶O42807的氨基酸序列，以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密碼子優(yōu)化設(shè)計阿魏酸酯酶的基因序列，在基因序列的兩端引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點，化學(xué)合成基因序列fae.用HindⅢ，EcoRⅠ分別雙酶切合成的基因序列和質(zhì)粒pAO815，膠回收雙酶切片段后用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞.篩選出的陽性克隆子由Sangon測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pAO815-fae.

1.3pPIC9K-fae表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pAO815-fae為模板，采用上游引物5′- TACGTAGCCTCTACTCAGGGGATCAGT- 3′ 和下游引物5′-AATATGCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCCCCG- 3′ 擴(kuò)增成熟阿魏酸酯酶編碼序列.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)條件如下：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)30個循環(huán)，最后,72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收用SnaBⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，然后,連接到經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K上并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α.篩選出的陽性克隆子由Sangon測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-fae.

1.4fae在畢赤酵母中的表達(dá)

pPIC9K-fae用BglⅡ線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上篩選重組子，取MD平板上生長良好的菌落用牙簽點種至含G418的YPD搖瓶中，篩選抗G418的重組子，命名為GS115/pPIC9K-fae.提取GS115/pPIC9K-fae及以質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化菌株(GS115/pPIC9K)基因組DNA，利用通用引物5′AOX，3′AOX進(jìn)行PCR鑒定.重組酵母GS115/pPIC9K-fae誘導(dǎo)表達(dá)參見《畢赤酵母操作表達(dá)手冊》.用Bradford法測定蛋白質(zhì)量濃度，SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液.

1.5重組阿魏酸酯酶酶活測定

取250 μL酶液, 加入250 μL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH=5.0)配制的阿魏酸甲酯溶液，50 ℃反應(yīng)10 min，加入500 μL 冰乙酸(體積分?jǐn)?shù)為10%)，4 ℃，10 000 r·min-1離心20 min，高效液相色譜法(HPLC)測定阿魏酸的質(zhì)量濃度[10].空白對照為煮沸失活的酶液.在50 ℃，pH值為5.0條件下，每分鐘水解阿魏酸甲酯.

1.6重組阿魏酸酯酶粗酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.6.1最適反應(yīng)溫度的測定取250 μL酶液保溫5 min后，加入250 μL 阿魏酸甲酯溶液(由pH值為5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配置)，在40～65 ℃中反應(yīng)10 min，測定重組阿魏酸酯酶的酶活.以所測的最高酶活為100%，計算相對酶活(Ar).

“兩票制”執(zhí)行后，藥品批發(fā)企業(yè)需直接從生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)貨，生產(chǎn)企業(yè)為避免資金風(fēng)險，一般對資金承付要求較為嚴(yán)格，承付期限比以往代理商分銷時要短，且不少生產(chǎn)企業(yè)要求現(xiàn)款或預(yù)付款發(fā)貨。而藥品銷售到下游醫(yī)療機(jī)構(gòu)后，一般有3至6個月的滯賬期，部分情況下甚至更長。在上游墊資負(fù)擔(dān)增大和下游回款延長的雙重作用下，藥品批發(fā)企業(yè)的資金壓力進(jìn)一步加大，大部分企業(yè)現(xiàn)金流非常緊張，特別是中小企業(yè)，抗風(fēng)險能力較弱，如果下游回款出現(xiàn)問題，很容易造成資金鏈斷裂，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致企業(yè)的破產(chǎn)。

1.6.2溫度穩(wěn)定性的測定將FAE酶液置于40～65 ℃下，保溫12 h，每隔3 h取樣測定殘留酶活，以0 h酶活為100%，計算相對酶活.

1.6.3最適反應(yīng)pH值的測定取250 μL酶液50 ℃保溫5 min后，加入250 μL的阿魏酸甲酯溶液(0.2 mol·L-1的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值在4.0～7.0之間)，50 ℃下反應(yīng)10 min，測定重組阿魏酸酯酶的酶活.以所測的最高酶活為100%，計算相對酶活.

1.6.4pH值穩(wěn)定性的測定將酶液置于0.2 mol·L-1，pH值為4.0～7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，50 ℃保溫2 h，測定殘留酶活，以各pH值的0 h酶活為100%，計算相對酶活.

1.6.5金屬離子對重組阿魏酸酯酶酶活的影響將FAE酶液與含有10 mmol·L-1的各種金屬離子(Na+,K+,Mn2+,Fe2+,Cu2+,Mg2+,Ca2+,Zn2+) 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH=5.0)混合，于50 ℃保溫2 h，測定殘留酶活，以不添加抑制劑的酶活為100%，計算相對酶活.

2結(jié)果與分析

2.1pAO815-fae和pPIC9K-fae表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建的表達(dá)載體，如圖1所示.由圖1可知：測序結(jié)果顯示fae基因序列正確，重組表達(dá)載體pAO815-fae構(gòu)建成功.以質(zhì)粒pAO815-fae為模板，PCR產(chǎn)物在約800 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，其大小與預(yù)期的相符.將目的產(chǎn)物用SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切切膠回收后,與經(jīng)同樣雙酶切后回收的質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 篩選獲得重組質(zhì)粒.表達(dá)載體pPIC9K-fae雙酶切結(jié)果和示意圖，如圖2所示.圖2(a)中：泳道1為重組質(zhì)粒雙酶切片段；泳道2為DNA mark.由圖2(a)可知：酶切條帶相對分子質(zhì)量與載體基因大小吻合，兩條條帶分別為9.3 kbp和800 bp.

(a) 雙酶切結(jié)果　　　　　　　　(b) 示意圖　　　圖1　表達(dá)載體pAO815-fae示意圖　　　　　　圖2　表達(dá)載體pPIC9K-fae雙酶切結(jié)果及示意圖　　　　Fig.1　Schematic representation of Fig.2　Cleavage map and schematic representation 　　　　　the expression vector pAO815-fae of the expression vector pPIC9K-fae

2.2fae在畢赤酵母中的表達(dá)

挑取上述陽性轉(zhuǎn)化子，按照節(jié)1.3進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá).甲醇誘導(dǎo)每隔12 h或24 h取樣，測定其表達(dá)量，篩選到一個產(chǎn)酶活性最高的GS115/pPIC9K-fae重組子.取其發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖4所示.圖4中：1為GS115/pPIC9K發(fā)酵上清液；2為蛋白marker；3～10為GS115/pPIC9K-fae誘導(dǎo)培養(yǎng) 0,12,24,48,72,96,120,144 h的發(fā)酵上清液.由圖4可知：在42 ku得到一條清晰條帶，而且?guī)缀鯖]有雜條帶，初步說明fae得到成功表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果顯示的表觀相對分子質(zhì)量(Mr)明顯大于其理論值28.48 ku，這主要有以下2個原因：1) FAE的理論等電點(pI)為3.3，這可能降低了FAE與SDS的結(jié)合，以及在SDS-PAGE凝膠中的遷移；2) FAE蛋白序列的N端有一個糖基化位點，而畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時，會對其進(jìn)行糖基化修飾，從而使相對分子質(zhì)量增大[9].

圖3　GS115/pPIC9K-fae轉(zhuǎn)化子PCR電泳圖 圖4　SDS-PAGE分析產(chǎn)物的表達(dá)　　Fig.3　Cleavage map of the PCR analysis of Fig.4　Products expression analyzed　　GS115/pPIC9K-fae transformants by SDS-PAGE

GS115/pPIC9K-fae表達(dá)量的測定結(jié)果，如圖5所示.圖5中：培養(yǎng)液上清中阿魏酸酯酶酶活力(z)在誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后達(dá)最高，為78.49 nkat·mL-1，比活(u)為524.38 nkat·mg-1，之后酶活逐漸降低.菌體濃度(D)在培養(yǎng)24 h后基本穩(wěn)定，但發(fā)酵液中的蛋白量(ρp)一直持增長趨勢，這可能是由于發(fā)酵后期由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，造成部分菌體自溶使蛋白量增加.

2.3重組阿魏酸酯酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

通過研究在40～65 ℃時酶活的變化，探究酶反應(yīng)的最適溫度(θ),如圖6所示.由圖6可知：50 ℃之前,重組阿魏酸酯酶的酶活較高，相對酶活(Ar)都在80%以上.FAE的最適作用溫度為50 ℃，超過50 ℃后,FAE的酶活下降較快，可能是隨著溫度的升高，酶出現(xiàn)失活現(xiàn)象.

圖5　GS115/pPIC9K-fae表達(dá)量的測定 圖6　溫度對重組阿魏酸酯酶活性的影響　Fig.5　Determination of the products expression Fig.6　Effect of temperature on the activity　　in GS115/pPIC9K-fae of recombinant FAE

圖7　溫度對重組阿魏酸酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.7　Effect of temperature on the stability of recombinant FAE

將重組阿魏酸酯酶在40～65 ℃保溫 0,3,6,9,12 h后,測定其殘余酶活，結(jié)果如圖7所示.重組阿魏酸酯酶在40～65 ℃溫度下，隨著保溫時間(t)的延長，F(xiàn)AE的酶活(Ar)逐漸下降.40～45 ℃保溫12 h后，酶活為初始酶的50%左右;50 ℃以后，酶活下降較快，保溫12 h后，剩余酶活不足10%.

2.3.1最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性的測定pH值為4.0～7.0時，酶的最適反應(yīng)pH值，如圖8所示.由圖8可知：pH值為5.0～5.5，重組阿魏酸酯酶的酶活最大.pH值穩(wěn)定性結(jié)果,如圖9所示.由圖9可知：pH值為4.0～6.0時，隨著pH值的增大，重組酶的穩(wěn)定性隨之增大;pH值為6.0時，穩(wěn)定性相對較高，為63%;pH值大于6.0時，酶活穩(wěn)定性逐漸下降.重組酶對pH值比較敏感，這可能是因為pH值過低或過高會改變酶的空間結(jié)構(gòu)[11].

2.3.2金屬離子重組阿魏酸酯酶酶活性的影響無金屬離子,K+,Ca2+,Na+,Mg2+,Fe2+,Mn2+,Zn2+,Cu2+的相對酶活分別為100%，106%，109%，101%，98%，66%，41%，60%，55%.由此可知：K+,Ca2+,Na+對FAE有促進(jìn)作用；Fe2+,Zn2+對其有一定的抑制作用；Mn2+,Cu2+對其有顯著抑制作用.

圖8　pH對重組阿魏酸酯酶酶活性的影響　　　　　　　圖9　pH對重組阿魏酸酯酶穩(wěn)定性的影響　　Fig.8　Effect of pH on the activity 　　　　　　　　　　Fig.9　Effect of pH on the stability 　　　of recombinant FAE 　　　　　　　　　　　　　　　　of recombinant FAE

3討論

為了提高阿魏酸酯酶的表達(dá)量，已對多個阿魏酸酯酶編碼基因進(jìn)行了外源表達(dá).國內(nèi)外學(xué)者主要采用大腸桿菌、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對阿魏酸酯酶進(jìn)行重組表達(dá)，如表1所示.文中研究的產(chǎn)FAE工程菌目標(biāo)是應(yīng)用于飼料中，所以選擇已增補(bǔ)至《飼料添加劑品種目錄(2013)》中的黑曲酶的FAE序列.FAE的氨基酸序列來源于UniProt數(shù)據(jù)庫中的O42807.該FAE是DE Vries等[1]從黑曲霉(Aspergillusniger)CBS120.49中分離得到的，當(dāng)A.nigerCBS120.49在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 葡萄糖和1% 燕麥木聚糖的混合植物細(xì)胞壁中培養(yǎng)4 d后，酶比活(u)為20.875 nkat·mg-1(以阿魏酸甲酯為底物)，其最適溫度(θ)為55～60 ℃， 最適pH值為5.0， 屬于胞外酶. 此FAE含有281個氨基酸(1～21位為信號肽序列，21位為信號肽序列，22～281為成熟肽鏈)，其中,含有30個酸性氨基酸殘基(Asp,Glu)和10個堿性氨基酸殘基(Lys,Arg)，含有7個Cys和1個糖基化位點，pI為3.3，理論相對分子質(zhì)量為28.48 ku.

表1　阿魏酸酯酶基因工程菌的研究進(jìn)展

根據(jù)畢赤酵母偏好性表達(dá)對FAE O42807的基因序列進(jìn)行改造后，人工合成該酶的基因序列fae.這段序列與表達(dá)載體pPIC9K相連，F(xiàn)AE在α-factor信號肽的引導(dǎo)下分泌到胞外.由表1可知：酵母表達(dá)系統(tǒng)與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，其酶比活較高；該重組阿魏酸酯酶的酶比活可達(dá)524.38 nkat·mg-1，酶活力介于文獻(xiàn)報道之間，比原始菌株酶活大大提高；重組阿魏酸酯酶最適溫度在40～60 ℃,最適pH值在5.2～7.0之間，文中重組阿魏酸酯酶的最適溫度為50 ℃，最適pH值為5.0.

先前嘗試用胞內(nèi)表達(dá)載體pAO815在畢赤酵母中表達(dá)，但不能檢測到酶活.這可能是由于阿魏酸酯酶O42807是一種糖基化蛋白，胞內(nèi)表達(dá)時未進(jìn)行糖基化修飾，不能產(chǎn)生有活性的阿魏酸酯酶[9,16-17].

4結(jié)束語

文中報道的重組阿魏酸酯酶在40 ℃中保溫3 h后,保留了80%以上的酶活；40～45 ℃保溫12 h后，仍保留50% 左右的酶活.Fe2+,Zn2+對重組阿魏酸酯酶酶活有一定的抑制作用，而Mn2+,Cu2+對其有明顯抑制作用.這與Donaghy等[18]報道的阿魏酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)一致.構(gòu)建的基因工程菌在胞外表達(dá)時，發(fā)酵液中背景蛋白較少，重組蛋白純度較高.阿魏酸酯酶在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)為后續(xù)定向改進(jìn)酶學(xué)特性奠定了基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯： 錢筠 英文審校： 劉源崗)

Expression of Feruloyl Esterase O42807 inPichiapastorisGS115

CHEN Yunhua, LI Hui, ZHANG Guangya, GE Huihua, LI Xialan

(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Abstract：This paper studied the expression of the feruloyl estrase O42807 in Pichia pastoris GS115 and the enzymatic properties of the recombinant feruloyl estrase. Based on the amino acids of feruloyl estrase O42807, the gene (fae) of feruloyl estrase was synthesized chemically. The secreted expression vector pPIC9K-fae was constructed by the ligation of the fae gene into the shuttle vector pPIC9K. The plasmid pPIC9K-fae was linearized and then electrotransformed into Pichia pastoris GS115. Afterwards, the recombinant strain with high level of feruloyl estrase activity was obtained through activity screening. The SDS-PAGE result showed a single band in the fermentation supernatant. The molecular weight of the recombinant feruloyl estrase was about 42 ku and the enzyme activity was 78.49 nkat·mL-1. The specific activity of the recombinant feruloyl estrase was 524.38 nkat·mg-1. The results also showed that the optimal reaction temperature was 50 ℃, and stable from 40 ℃ to 45 ℃. And the optimal pH was from 5.0 to 5.5, stable at pH 6.0. Furthermore, the enzymatic activity was slightly enhanced by K+, Ca2+, Na+, whereas it was slightly inhibited by Fe2+, Zn2+, and strongly inhibited by Mn2+, Cu2+.

Keywords：feruloyl esterase; expression; Pichia pastoris; enzymatic properties

中圖分類號：Q 78; Q 556+.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項目：福建省廈門市科技計劃項目(2014S006)； 福建省發(fā)改委投資基金資助項目(2013-886)

通信作者：李夏蘭(1965-)，女，教授，博士，主要從事生物化工的研究.E-mail:xialan@hqu.edu.cn.

收稿日期：2014-10-31

doi:10.11830/ISSN.1000-5013.2016.02.0224

文章編號：1000-5013(2016)02-0224-06