多菌種協(xié)同發(fā)酵啤酒糟渣和蘋果渣生產(chǎn)蛋白飼料的研究

■王曉力王　帆孫尚琛王永剛李　想王春梅朱新強(qiáng)孫啟忠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010010）

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多菌種協(xié)同發(fā)酵啤酒糟渣和蘋果渣生產(chǎn)蛋白飼料的研究

■王曉力1王帆2孫尚琛2王永剛2李想2王春梅1朱新強(qiáng)1孫啟忠3

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010010）

摘要：以蘋果渣和啤酒糟為發(fā)酵基質(zhì)，利用里氏木霉、黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵菌種，采用單因素3驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)定，利用掃描電子顯微鏡技術(shù)探究了微生物在固態(tài)發(fā)酵中的作用。結(jié)果表明，最佳的基質(zhì)配比為1∶1，3種微生物配比為1∶1∶1，接種量為8%，含水量、發(fā)酵溫度和時(shí)間分別為60%，35℃和48 h，在此條件下，發(fā)酵后飼料中粗蛋白含量提高34.52%，酸性和中性纖維素含量分別降低22.93%和9.08%。飼料品質(zhì)良好，無結(jié)塊，伴有淡淡的酸香味和蘋果醇香味。尼龍袋瘺管羊瘤胃消化試驗(yàn)表明，72 h后粗蛋白、酸性和中性纖維素消化率分別為79.78%、51.96%和39.88%。掃描電鏡結(jié)果顯示微生物在發(fā)酵過程中破壞了飼料結(jié)晶區(qū)表面結(jié)構(gòu)，纖維素分子無定形區(qū)消失，大量酵母細(xì)胞分布在飼料表面，汲取養(yǎng)分生長繁殖成為高蛋白飼料。

關(guān)鍵詞：蘋果渣；啤酒糟；固態(tài)發(fā)酵；蛋白飼料;掃描電鏡

糟渣類飼料主要是指農(nóng)副產(chǎn)品加工的廢棄物以及工業(yè)下腳料中可以作為飼料資源的部分，包括工業(yè)副產(chǎn)品酒糟、醋糟、果渣、薯渣等，產(chǎn)量非常大[1-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國年產(chǎn)醋糟150～175萬噸、蘋果渣120～150萬噸、酒糟產(chǎn)量3 076.8萬噸[4]。但因這類資源含水量高，易腐敗變質(zhì)，含抗?fàn)I養(yǎng)因子，粗纖維含量高而不被廣泛利用，造成了環(huán)境污染和資源的極大浪費(fèi)。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料原料的供給成為制約我國畜牧業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展的瓶頸。據(jù)全國飼料工業(yè)辦公室估算，到2020年，我國僅蛋白質(zhì)飼料缺口就達(dá)到4 800萬噸4]。因此如何對(duì)糟渣類資源進(jìn)行深加工和開發(fā)利用成為緩解飼料資源供應(yīng)不足、治理環(huán)境污染的研究焦點(diǎn)之一。

針對(duì)糟渣類飼料資源含水量高，營養(yǎng)不均衡，抗?fàn)I養(yǎng)因子等特點(diǎn)，涌現(xiàn)出很多飼料開發(fā)技術(shù)，如青貯、微貯、氨貯和黃貯等[5-6]。其中微生物發(fā)酵技術(shù)成為提升飼料品質(zhì)的主要技術(shù)手段之一，能有效降低糟渣類物質(zhì)的纖維素含量，改善飼料動(dòng)物適口性，提高蛋白質(zhì)含量及可消化吸收性能。目前關(guān)于酒糟和蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的報(bào)道很多[7，13]，主要是采用高產(chǎn)纖維素酶和蛋白的微生物進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵來改善飼料品質(zhì)，獲得高蛋白飼料。但是關(guān)于酒糟和蘋果渣聯(lián)合作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的研究甚少，本研究參考張吉鹍所報(bào)道的《飼料間的組合效應(yīng)及其在配方設(shè)計(jì)中的應(yīng)用》一文[14]，基于前期對(duì)酒糟和蘋果渣基本營養(yǎng)組分測定的基礎(chǔ)上，探究了以啤酒糟和蘋果渣為發(fā)酵原料，黑曲霉、里氏木霉和產(chǎn)阮假絲酵母為發(fā)酵菌株的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料工藝參數(shù)，為蘋果渣和酒糟的飼用化提供一條切實(shí)可行的技術(shù)方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)原料

啤酒糟（蘭州黃河嘉釀啤酒有限公司）、醋糟（蘭州小二黑食品有限公司）、蘋果渣（天水長城果汁集團(tuán)有限公司）。

1.1.2供試菌株

黑曲霉孢子粉(孢子含量≥150億/g，沂源康源生物科技有限公司)、里氏木霉（纖維素酶≥30 000 U/g）、產(chǎn)朊假絲酵母粉（酵母菌數(shù)≥30.0億/g），購自武漢東康源科技有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

①PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，去皮，切成小塊，加水煮沸至軟而不爛，用紗布過濾，加瓊脂20 g，融化過濾后加葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，蛋白胨1 g，硫酸鎂1 g，硫酸胺1 g，補(bǔ)水至1 000 ml，pH值調(diào)至7.2～7.4，分裝在4個(gè)500 ml的錐形瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻待用。

②PDA種子液培養(yǎng)基：與配制上述PDA斜面培養(yǎng)基的方法相同，但不加瓊脂。

1.2試劑與儀器

試劑：濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、石油醚、丙酮、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

儀器：數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBZ，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9162MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、真空泵（SHB-IIIA，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、滅菌鍋（DSX-280B，寧波甬安醫(yī)療器械制造有限公司）、電子分析天平（AB104-N，梅特勒-托利多儀器有限公司）、博蘭特?zé)o菌操作臺(tái)（蘇州博蘭特實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)工程有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)（Cary50，美國瓦里安）等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1固態(tài)發(fā)酵工藝流程

以啤酒糟、蘋果渣和醋糟為發(fā)酵基質(zhì)，接種活化后擴(kuò)大培養(yǎng)的黑曲霉、里氏木霉和產(chǎn)朊假絲酵母3種菌懸液（活菌/孢子數(shù)≥109），用無菌玻璃棒在潔凈工作臺(tái)上攪拌均勻，用pH值6.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)水分含量，分裝100 g于500 ml三角瓶中，在不同的發(fā)酵條件下發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下干燥，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量。

1.3.2單因素發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.2.1固態(tài)發(fā)酵復(fù)合菌種組合的確定

以啤酒糟、蘋果渣和醋糟（m:m:m=1:1:1）為發(fā)酵基質(zhì)，分別將活化后擴(kuò)大培養(yǎng)的黑曲霉、里氏木霉和產(chǎn)朊假絲酵母3種菌懸液（活菌/孢子數(shù)≥109）以單獨(dú)或不同組合方式，按6%的接種量（v:m）接到發(fā)酵基質(zhì)上，用無菌玻璃棒在潔凈工作臺(tái)上攪拌均勻，用pH值6.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)水分含量為60%，分裝100 g于500 ml三角瓶中，在30℃條件下發(fā)酵5 d，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下干燥，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵菌種組合。

1.3.2.2固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)配比的確定

分別改變啤酒糟、蘋果渣和醋糟的配比，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵基質(zhì)組分配比。

1.3.2.3初始水分含量的確定

分別改變初始發(fā)酵基質(zhì)含水量，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的初始含水量。

1.3.2.4發(fā)酵時(shí)間的確定

分別改變發(fā)酵時(shí)間，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.3.2.5發(fā)酵溫度的確定

分別改變發(fā)酵溫度，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.3.2.6接種量的確定

分別改變接種量，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵，測定粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的接種量。

1.3.3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間、溫度和接種量為因素，采用L9（34）表做正交試驗(yàn)，以發(fā)酵飼料中粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1因素水平

1.3.4分析方法

①微生物計(jì)數(shù)：采用血球計(jì)數(shù)板法對(duì)黑曲霉、里氏木霉孢子和產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

②飼料基本成分測定：粗蛋白（CP）含量采用GB/T6432-1994方法測定；粗纖維含量采用GB/T 6434-1994酸堿洗滌法測定；粗脂肪（EE）含量采用索氏提取法測定；灰分（Ash）測定采用GB/T6438-1992中的灰化法；酸性洗滌纖維（ADF）含量參照NY/T 1459-2007方法測定；中性洗滌纖維素（NDF）含量參照GB/T 20806-2006方法測定。

1.3.5體外消化試驗(yàn)

飼料經(jīng)65℃干燥后，粉碎過2.5 mm篩孔，選取3只體重為（35±1.5）kg的24月齡安裝有永久性瘤胃瘺管的成年肉用公羊，精粗比為4:6，按1.3倍維持水平飼養(yǎng)（肉羊NRC 2007）。試驗(yàn)動(dòng)物按該品種動(dòng)物常規(guī)程序飼養(yǎng)管理，分圈飼養(yǎng)，槽飼喂，每天飼喂2次，自由飲水。測定前至少預(yù)飼15 d。以尼龍袋法（in si?tu）測定飼料在瘤胃中消化6、12、24、36、48和72 h后粗蛋白（CP）、酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）的降解率，本試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所進(jìn)行。

1.3.6掃描電鏡結(jié)構(gòu)表征

采用離子濺射鍍膜法制備發(fā)酵原料前后電鏡測試樣品，置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析，調(diào)節(jié)加速電壓20 kV，放大100～1 000倍，用隨機(jī)工作站進(jìn)行拍攝，觀察飼料表面的形態(tài)。

1.3.7發(fā)酵飼料質(zhì)量評(píng)價(jià)

感官評(píng)定：根據(jù)發(fā)酵飼料的氣味、色澤及質(zhì)地評(píng)定飼料發(fā)酵狀況的優(yōu)劣。

營養(yǎng)成分測定：參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法分別測定粗蛋白質(zhì)（CP）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量等。

1.3.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)平行測定3次，結(jié)果由平均值±SD值表示，用Excel 2007完成；采用SPSS 17.0（SPSS Inc.，Chicago）進(jìn)行方差分析和顯著性分析（P＜0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵原料營養(yǎng)成分分析

參照國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法分別對(duì)啤酒糟、醋糟和蘋果渣基本成分進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。3種原料中主要成分是蛋白質(zhì)和纖維素，其中啤酒糟中的蛋白質(zhì)含量最高，可能是含有一定量的酵母等微生物菌體蛋白。此外，基質(zhì)中含有大量的非水溶性纖維素類，也正是大量的非水溶性膳食纖維影響了各飼料原料的適口性。因此采用微生物發(fā)酵法通過降解基質(zhì)中的纖維素類，不僅可以改善飼料原料的口感，還可以產(chǎn)生很多對(duì)動(dòng)物消化吸收有利的代謝產(chǎn)物。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1發(fā)酵基質(zhì)復(fù)合比例的確定

表2發(fā)酵原料基本營養(yǎng)成分測定結(jié)果（以干基計(jì)%）

本試驗(yàn)選擇里氏木霉、黑曲霉和產(chǎn)阮假絲酵母為發(fā)酵菌株（1:1:1），為了保證微生物在發(fā)酵前期過程中能良好生長，本試驗(yàn)選擇以可溶性固形物含量較高的啤酒糟和蘋果渣為發(fā)酵主要原料，輔以醋糟進(jìn)行不同配比組合的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素測定結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，B種組合在相同條件下發(fā)酵后的蛋白含量高達(dá)27.89%，明顯高于其他原料復(fù)配組合，而且酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維的含量也明顯低于其他組，因此選取B組合作為固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)組合。

注：A代表醋糟:啤酒糟:蘋果渣=2:2:1；B代表啤酒糟:蘋果渣=4:1；C代表醋糟:啤酒糟:蘋果渣=1:3:1；D代表醋糟:蘋果渣=4:1；E代表醋糟:啤酒糟:蘋果渣=3:1:1。圖1不同基質(zhì)配比發(fā)酵后蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維含量

2.2.2發(fā)酵菌株的選擇

糟渣類物質(zhì)主要的組成特點(diǎn)是纖維素含量較高，適口性差，不利于動(dòng)物消化吸收，本試驗(yàn)選擇黑曲霉、里氏木霉和產(chǎn)阮假絲酵母為發(fā)酵菌株，目的是使微生物體內(nèi)的各種酶系協(xié)同作用，從而改善飼料的適口性，降低纖維素含量，提高蛋白質(zhì)含量。以啤酒糟和蘋果渣（m:m=1:1）為發(fā)酵基質(zhì)，參照1.3.2.1節(jié)方法將3種菌種以單獨(dú)或不同比例組合方式接種，發(fā)酵結(jié)束后測定飼料中粗蛋白、酸性纖維素和中性纖維素含量，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，不同的菌種組合利用糟渣類物質(zhì)的效率不同，與空白對(duì)照組相比，采用單菌發(fā)酵后的粗蛋白含量提高了20%～35%，而將兩種菌兩兩組合之后，粗蛋白含量提高了30%～50%左右，3種菌同時(shí)混合后進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果粗蛋白的含量提高了34.29%左右，所以本次試驗(yàn)中最佳的菌種組合是3種發(fā)酵菌種按照1:1:1混合，從而可以保證粗蛋白的含量達(dá)到最大。因此選擇里氏木霉、黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母三菌混合（1:1:1）作為發(fā)酵菌種。

注：L代表里氏木霉；H代表黑曲霉；R代表產(chǎn)朊假絲酵母菌。圖2不同菌種組合對(duì)發(fā)酵后飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維含量的影響

2.2.3初始水分含量的確定

微生物在發(fā)酵過程中需要有適宜的水分。發(fā)酵底物環(huán)境中的水分直接影響微生物的生長情況，隨著含水量的增加，提高了反應(yīng)體系的水活度，這不僅有利于菌體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，也增加了菌株代謝產(chǎn)酶量的增加。參照1.3.2.1節(jié)方法分別進(jìn)行初始基質(zhì)水分含量為50%、55%、60%、65%和70%的發(fā)酵試驗(yàn)，粗蛋白、纖維素測定結(jié)果如圖3。初始含水量為60%時(shí)，所得到的飼料中粗蛋白的含量最高，中性洗滌纖維素含量最小，酸性洗滌纖維素含量較小。因此確定發(fā)酵初始基質(zhì)含水量為60%。

2.2.4發(fā)酵時(shí)間的確定

以啤酒糟和蘋果渣(m:m=1:1)為發(fā)酵基質(zhì)，里氏木霉、黑曲霉和產(chǎn)阮假絲酵母為發(fā)酵菌株(1:1:1)，參照1.3.2.1節(jié)方法分別進(jìn)行24、36、48、60 h和72 h發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后飼料中粗蛋白、酸性纖維素和中性纖維素含量測定結(jié)果見圖4，從圖中可以看出當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，所得到的飼料中粗蛋白的含量最高，發(fā)酵時(shí)間對(duì)飼料中蛋白含量的增加影響是48 h＞36 h＞60 h＞72 h＞24 h，纖維素含量降低，說明隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，微生物能夠利用基質(zhì)中不溶性纖維素進(jìn)行繁殖和代謝，蛋白質(zhì)含量逐漸增加。

圖3初始含水量對(duì)發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維含量的影響

圖4發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維含量的影響

2.2.5發(fā)酵溫度的確定

溫度是影響微生物生長和代謝活動(dòng)的主要因素之一，由于本次發(fā)酵菌株都屬于真菌，因此分別在25、27.5、30、32.5℃和35℃5個(gè)溫度下進(jìn)行發(fā)酵，其他發(fā)酵參數(shù)同1.3.2.1節(jié)。發(fā)酵結(jié)束后，飼料中蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量如圖5，可以看出，在30℃下飼料中蛋白質(zhì)含量最高，酸性纖維素和中性纖維素含量最低，初步確定發(fā)酵溫度為30℃，既滿足微生物生長代謝，也滿足發(fā)酵代謝中產(chǎn)生的各種酶類所需要的最適宜酶解溫度。

圖5發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維含量的影響

2.2.6接種量的確定

接種量大小直接影響發(fā)酵過程中微生物的生長和代謝調(diào)控，接種量太小，微生物生長緩慢，發(fā)酵周期變長，接種量太大，會(huì)造成基質(zhì)溫度上升過快，局部溫度過高，發(fā)酵過程不易控制。本研究分別采用接種量（體積分?jǐn)?shù)）2%、4%、6%、8%、10%和12%，6個(gè)接種量接種發(fā)酵48 h，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、中性纖維素和酸性纖維素含量見圖6，從圖中可以看出接種量在8%時(shí)飼料中粗蛋白含量最大，纖維素含量與其他接種量發(fā)酵條件下差異性不大。究其原因可能是在為微生物的生長是按照指數(shù)增長，后期發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的差異性較小，因此發(fā)酵過程中利用纖維素的能力相當(dāng)，各條件下纖維素變化不大。

圖6接種量對(duì)發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維含量的影響

2.3正交試驗(yàn)

基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，本次試驗(yàn)選擇以啤酒糟和蘋果渣（m:m=1:1）為發(fā)酵基質(zhì)，里氏木霉、黑曲霉和產(chǎn)阮假絲酵母為發(fā)酵菌株（1:1:1），接種量為8%為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，分別研究發(fā)酵時(shí)間（A）、水分含量（B）和發(fā)酵溫度（C）3種因素對(duì)發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性洗滌纖維素和中性洗滌纖維素含量的影響，按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，蛋白質(zhì)、酸性洗滌纖維素和中性洗滌纖維素含量結(jié)果見圖7，從圖7可以看出各發(fā)酵組與對(duì)照組相比，蛋白質(zhì)含量都有較大程度的增加，纖維素含量都降低，其中組合3蛋白質(zhì)含量最高，但是酸性洗滌纖維素含量組合6最低，中性洗滌纖維素含量組合4最低。因此，以蛋白質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，發(fā)酵基質(zhì)初始含水率、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的影響程度為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵基質(zhì)初始含水率。而且發(fā)酵最優(yōu)條件為A1B2C3。即：發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵基質(zhì)初始含水率60%，發(fā)酵溫度為35℃。在此發(fā)酵條件下進(jìn)一步對(duì)該組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)測定發(fā)酵后飼料中粗蛋白含量達(dá)37.49%，因此確定本組合為最佳發(fā)酵工藝條件。

注：1、2、3、4、5、6、7、8、9代表正交試驗(yàn)組合，10代表空白對(duì)照。圖7固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)發(fā)酵后蛋白、酸性和中性洗滌纖維含量百分?jǐn)?shù)

2.4體外消化試驗(yàn)

以尼龍袋法分別測定微生物發(fā)酵飼料在肉羊瘤胃中消化6、12、24、36、48 h和72 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)CP、ADF和NDF的消化率，以發(fā)酵基質(zhì)啤酒糟和蘋果渣（m:m=1:1）為對(duì)照組，平行測定3次，結(jié)果見表4。從表中可以看出CP、ADF和NDF相較對(duì)照組消化率顯著增加。由此說明，微生物發(fā)酵過程中能夠利用發(fā)酵基質(zhì)中的可溶性碳源進(jìn)行生長代謝，產(chǎn)生一系列水解酶，如本試驗(yàn)中采用的黑曲霉、里氏木霉能夠分泌纖維素酶，進(jìn)而使得基質(zhì)中的部分纖維素進(jìn)行水解利用，破壞了基質(zhì)中纖維素?zé)o定形晶體結(jié)構(gòu)，從而提高了在肉羊瘤胃中的消化性能。

表3正交試驗(yàn)直觀分析

2.5發(fā)酵前后飼料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)表征

為了進(jìn)一步分析微生物在發(fā)酵過程中對(duì)發(fā)酵基質(zhì)的作用機(jī)理，采用掃描電子顯微鏡對(duì)發(fā)酵前后飼料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖8a（發(fā)酵前）和圖8b（發(fā)酵后）。由圖8a可知，發(fā)酵前原料基質(zhì)中木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)排列緊湊，纖維素聚集態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)構(gòu)致密有，纖維素結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)交錯(cuò)結(jié)合，沿鏈長方向纖維素聚集成微細(xì)纖維狀態(tài)。經(jīng)微生物發(fā)酵作用后，由圖8b可以看出，發(fā)酵基質(zhì)表面形貌變得粗糙，纖維素分子無定形區(qū)消失，結(jié)晶區(qū)表面結(jié)構(gòu)被破壞。由此可見，微生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)于提高纖維質(zhì)原料的飼用化具有重要的作用。此外在纖維素降解過程中產(chǎn)生的可溶性碳源有作為微生物生長良好的培養(yǎng)基，如圖8c，大量的酵母細(xì)胞附著在發(fā)酵基質(zhì)表面，出芽繁殖現(xiàn)象明顯，進(jìn)一步說明酵母菌體蛋白是飼料總蛋白含量提高的主要原因之一。

2.6發(fā)酵飼料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定

啤酒糟和蘋果渣發(fā)酵基質(zhì)按照正交試驗(yàn)優(yōu)化條件發(fā)酵48 h后，微生物生長較好，飼料表面和內(nèi)部由微生物菌絲體粘連在一起，干燥后手感松散，無結(jié)塊，發(fā)黃，伴有淡淡的酸香味和蘋果醇香味。綜合理化指標(biāo)測定結(jié)果表明，發(fā)酵飼料pH值為5.6，粗蛋白質(zhì)含量37.49%，中性纖維素含量和酸性纖維素含量分別為65.05%和38.81%。結(jié)合瘺管羊飼料消化試驗(yàn)測定結(jié)果表明，蛋白質(zhì)消化率為79.86%，中性和酸性纖維素消化率為39.78%和46.27%。綜合發(fā)酵飼料的質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)感官評(píng)定、化學(xué)評(píng)定和消化性能評(píng)定結(jié)果得出，以黑曲霉、里氏木霉和產(chǎn)阮假絲酵母為混合發(fā)酵菌劑，不僅可以酶解大分子纖維素，改善啤酒糟和蘋果渣發(fā)酵基質(zhì)動(dòng)物飼用的適口性，而且通過微生物生長和代謝過程產(chǎn)生大量的菌體蛋白，將無機(jī)氮源轉(zhuǎn)化成能夠被動(dòng)物消化利用的蛋白質(zhì)類。

表4發(fā)酵飼料CP、ADF和NDF在羊瘤胃中的消化率(%)

圖8發(fā)酵前后飼料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)表征

3　結(jié)論

本試驗(yàn)以啤酒糟和蘋果渣復(fù)合基質(zhì)為主要原料，利用黑曲霉、里氏木霉和產(chǎn)阮假絲酵母混合菌株對(duì)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行協(xié)同處理，對(duì)其最適菌種配伍、原料配比和發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并以瘺管羊?yàn)槟Ｐ?，采用尼龍袋法測定了發(fā)酵飼料的消化性能，對(duì)發(fā)酵飼料進(jìn)行了營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，結(jié)合掃描電子顯微鏡技術(shù)對(duì)發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵前后結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，進(jìn)一步揭示了微生物在發(fā)酵過程中對(duì)纖維素降解作用和利用發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行生長代謝產(chǎn)生高蛋白菌體飼料的本質(zhì)。

①以啤酒糟和蘋果渣（m:m=1:1）為發(fā)酵基質(zhì)，接種8%的里氏木霉、黑曲霉和產(chǎn)阮假絲酵母（1: 1:1）混合發(fā)酵菌劑，調(diào)整初始含水率為60%，在35℃下發(fā)酵48 h。相較發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵后飼料中粗蛋白含量從27.87%提高到37.49%，酸性洗滌纖維含量從50.36%降低到38.81%，中性洗滌纖維從71.55%降低到65.05%。

②發(fā)酵飼料的品質(zhì)評(píng)定結(jié)果表明，發(fā)酵飼料表面有白色微生物菌絲生長，干燥后手感松散，無結(jié)塊，發(fā)黃，伴有淡淡的酸香味和蘋果醇香味。結(jié)合瘺管羊尼龍袋消化試驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵后極大改善了飼料的纖維化，提升了飼料品質(zhì)，動(dòng)物適口性得到了有效改善。

③掃描電子顯微鏡技術(shù)掃描結(jié)果表明，微生物發(fā)酵技術(shù)在改善糟渣類物質(zhì)結(jié)構(gòu)，高效利用糟渣類物質(zhì)生產(chǎn)菌體蛋白飼料方面具有很大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

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（編輯：王芳，xfang2005@163.com）

Study on production of protein feedstuff from apple pomace and brewer's grains by cooperation of different microbial strains

Wang Xiaoli, Wang Fan, Sun Shangchen, Wang Yonggang, Li Xiang, Wang Chunmei, Zhu Xinqiang, Sun Qizhong

Abstract：Optimization the solid-state fermentation process was studied by single factor experiment and orthogonal experiment using apple pomace and brewer's grains as fermentation substrate, and Trichodermareesei, Aspergillus niger and Candida utilis as for fermentation strains. As well as, evalua?tion of the fermented feedstuff quality and exploration the role of microorganisms in solid-state fermen?tation using scanning electron microscopy were investigated. The results showed that the proportion of fermentation substrate and three microorganisms were 1∶1 and 1∶1∶1 respectively, inoculum amount was 8%，the water content, fermentation temperature and time was 60%，35℃and 48 h. Un?der optimized conditions，the protein content was increased 34.52%, while the acidic and neutral cellu?lose content were decreased 22.93% and 9.08% respectively. The feedstuff with a fantastic quality and no agglomerate was accompanied by mild acid and apple aroma. The degradability of crude protein, acidic and neutral cellulose in feedstuff using the nylon-bag method in the sheep rumen were 79.78%，51.96% and 39.88% respectively that 72 h after. Scanning electron microscopy results indicated that the microbes in the fermentation process destroyed the surface structure of feed?stuff , amorphous area of cellulose molecules dis?persed, and a large number of yeast cells distrib?uted in the surface of the feedstuff to absorb nu?book=33,ebook=36trients growing to feedstuff with high protein content.

Key words：apple pomace；brewer's grains；protein feed；digestibility；scanning electron microscopy

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)子課題：工業(yè)副產(chǎn)品的優(yōu)化利用技術(shù)研究與示范項(xiàng)目資助[201203042]和甘肅省自然基金[1310RJYA022]

收稿日期：2015-08-08

通訊作者：孫啟忠，研究員。

作者簡介：王曉力，副研究員，主要從事畜牧方面的研究工作。

中圖分類號(hào)：S816.6+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-991X（2016）03-0032-07

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.03.007