植物粗提物對荔枝霜疫霉的抑菌活性研究

宋冠華，蔡丹丹，王紹芬，曾令達(dá)

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007；2.惠州學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣東 惠州 516007）

植物粗提物對荔枝霜疫霉的抑菌活性研究

宋冠華1，2，蔡丹丹1，王紹芬1，2，曾令達(dá)1，2

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007；2.惠州學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣東 惠州 516007）

為尋找植物源抑菌物質(zhì)對果樹病害進(jìn)行防治，采用超聲波提取法獲得16種植物的乙醇粗提物，通過菌絲生長法和孢子囊萌發(fā)法測定粗提物對荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）的抑制作用。結(jié)果表明，白鮮、虎杖和蛇床粗提物抑菌活性較強(qiáng)，5mg/mL條件下白鮮、虎杖和蛇床在抑菌率分別是71.87％、54.03％和53.79％，對孢子囊萌發(fā)抑制率分別9.40％、90.95％、61.93％，白鮮和虎杖的復(fù)配物抑荔枝霜疫霉菌絲生長起增效作用。不同植物的乙醇粗提物對荔枝霜疫霉的抑菌效果不同，植物粗提物的復(fù)配能增強(qiáng)植物的抑菌活性。

粗取物；復(fù)配物；荔枝霜疫霉菌；抑菌活性

1 前言

荔枝霜疫霉病是荔枝生產(chǎn)中主要的病害之一[1]，也是造成荔枝采后腐爛變質(zhì)的重要因素[2]。荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）為荔枝霜疫霉病的病原菌[3]，使用瑞毒霉錳鋅、殺毒礬等化學(xué)殺菌劑一直是控制荔枝霜疫病發(fā)生的主要手段之一[4，5]?；瘜W(xué)殺菌劑因其高毒、高殘留和污染環(huán)境，給生態(tài)環(huán)境和食品安全帶來隱患[6]。研究和開發(fā)植物源抑菌劑用于荔枝霜疫霉病防治，對于控制農(nóng)藥殘留量、確保荔枝食用安全具有十分重要的意義。近年來，許多學(xué)者研究抑菌物質(zhì)發(fā)現(xiàn)了不少植物粗提物具有抑菌防腐的作用[7，8]。吳光旭[9]發(fā)現(xiàn)開口箭對荔枝霜疫霉具有抗菌活性，開口箭提取物對荔枝貯藏具有較好的抑菌效果。曾勇[10]發(fā)現(xiàn)盾葉薯蕷甲醇和乙醇的提取物對荔枝霜疫霉抑制效果較強(qiáng)。曾令達(dá)[11]用95％乙醇從丁香、黃連等17種植物提取提取物，發(fā)現(xiàn)丁香、黃連等乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌有很強(qiáng)的抑菌作用。為尋找成本低、易開發(fā)的植物抑菌材料，以及保護(hù)珍稀植物資源，本實驗采用超聲波提取法，以乙醇作為提取溶劑從16種植物中提取抑菌活性物質(zhì)形成抑菌粗提物，進(jìn)行抑荔枝霜疫霉菌絲生長活性的篩選，然后利用孢子萌發(fā)法測定抑菌絲生長較強(qiáng)的植物粗提物對孢子萌發(fā)的抑制率，并將抑菌絲生長活性較強(qiáng)的植物粗提物進(jìn)行復(fù)配，測定復(fù)配物的抑菌效果。本研究通過研究植物粗提物及其復(fù)配物的抑菌活性，旨在為發(fā)現(xiàn)有效抑荔枝霜疫霉的植物材料和活性物質(zhì)提供理論和技術(shù)依據(jù)，并為進(jìn)一步研究新植物源殺菌劑或水果保鮮劑提供線索。

2 材料與方法

2.1 供試植物和供試病原菌

供試植物共12科16種（見表1），其中從惠州市惠城區(qū)藥店購進(jìn)植物材料共3種。荔枝霜疫霉菌（Per?onophythora litchi）由惠州學(xué)院生命科學(xué)系植物學(xué)實驗室提供。

表1 供試植物樣品

（續(xù)表1）

2.2 材料處理及植物粗提物的制備

參考曾令達(dá)[11]方法并稍作改進(jìn)，植物洗凈烘干后粉碎過40目篩制成干粉。稱取50.0 g植物干粉于500 mL三角瓶，加入95％乙醇120 mL浸泡5h，將混合物于40℃下200 W，40 kHz超聲波（三源，中國）提取1h，過濾，最后95％乙醇定容至100ml（粗提物濃度是0.5g/ mL），4℃儲藏備用。

2.3 抑菌活性測定

2.3.1 菌絲生長速率法

參考曾令達(dá)[11]方法進(jìn)行菌絲生長速率法測定抑菌活性，并用下面公式計算抑菌率。公式中，凈生長量=菌落直徑-菌餅直徑。

抑菌率（％）=[（對照凈生長量-處理凈生長量）/對照凈生長量]×100％

2.3.2 孢子萌發(fā)法

參考曾令達(dá)[11]方法進(jìn)行孢子囊萌發(fā)法測定孢子萌發(fā)抑制率，并用下面公式進(jìn)行計算。

孢子萌發(fā)率（％）=孢子囊萌發(fā)數(shù)/孢子囊總數(shù)× 100％。

孢子萌發(fā)抑制率（％）=[（對照孢子囊萌發(fā)率-處理孢子囊萌發(fā)率）/對照孢子囊萌發(fā)率]×100％。

2.4 植物粗提物的復(fù)配物抑菌活性的測定

在1：1（V/V）的配比下，抑菌效果較好的三種植物粗提物進(jìn)行兩兩復(fù)配研究。先用50mlPSA培養(yǎng)基與單種植物粗提物配成5.0mg/mL帶藥培養(yǎng)基，再將帶藥培養(yǎng)基等體積復(fù)配制成5mg/mL的混合帶藥培養(yǎng)基。參照Gowing方法[12]進(jìn)行乙醇提取物的復(fù)配研究。實驗中如果測定的“復(fù)配物”對病菌的實際抑制作用水平（抑菌率）與預(yù)期作用水平（理論抑菌率）相等，比值等于1時，則混劑中各組分表現(xiàn)獨(dú)立作用；如果抑菌率大于或小于理論抑菌率，比值大于1或小于1時，則混劑中各組分表現(xiàn)增效或拮抗作用。

3 結(jié)果與分析

3.1 植物粗提物對荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用

16種植物的乙醇粗提物中，白鮮、虎杖和蛇床等3種植物粗提物對荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用較強(qiáng)，5 mg/mL條件下，抑菌率分別為71.87％、54.03％和53.79％，抑菌率均在50％以上；倒地鈴、魚腥草、艾、白背葉、火炭母、鹽膚木、金銀花、地稔、香樟和山蒼子等10種植物乙醇粗提物對荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用較差，其抑菌率僅在0至31％之間，抑菌率均低于50％。10種植物中，倒地鈴抑菌率最高，為30.94％，但倒地鈴的抑菌率僅為蛇床抑菌率的0.58倍。飛揚(yáng)草、蒲公英和葫蘆茶等3種植物乙醇粗提物的抑菌率分別為-7.77％、-16.11％和-19.41％，均為負(fù)值，表明飛揚(yáng)草、蒲公英和葫蘆茶等三種植物對荔枝霜疫霉病菌絲生長具有促進(jìn)作用，如表2。

表2 粗提物對霜疫霉菌菌絲生長的抑制作用

3.2 植物粗提物對荔枝霜疫霉孢子萌發(fā)的抑制作用

為更全面了解植物粗提物對荔枝霜疫霉的抑制作用，在供試的16種植物（見表1）中選5 mg/mL濃度下抑菌率大于50％的3種供試植物的粗提物作為進(jìn)一步研究的材料，測定其對荔枝霜疫霉孢子萌發(fā)的抑制率。如表3，虎杖粗提物對荔枝霜疫霉菌孢子萌發(fā)抑制率最高，達(dá)90.95％，蛇床粗提物的抑菌率61.93％，白鮮粗提物的抑制率最低，為9.40％。三種植物的粗提物抑孢子萌發(fā)的差異明顯，虎杖和蛇床的抑制率是白鮮的9.67倍和6.59倍。虎杖的抑制率比蛇床高出29.02％。

表3 粗提物對霜疫霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

3.3 復(fù)配物對荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用

表4 復(fù)配物對荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用

4 結(jié)論與討論

為便于篩選出具有抑菌活性強(qiáng)的植物和避免提取溶劑乙醇對荔枝霜疫霉的影響，本實驗參考曾勇[10]、丘麒[13]等的抑菌濃度，采用稀釋提取物100倍，即抑菌濃度為5mg/mL條件下進(jìn)行實驗抑菌活性測定。本實驗發(fā)現(xiàn)，不同植物的乙醇粗提物，抑荔枝霜疫霉菌絲生長的效果不同，在供試16種植物中，有13種植物的乙醇粗提物的抑菌率顯示對荔枝霜疫霉菌絲生長具有抑制作用，其中白鮮、虎杖和蛇床等3種植物的乙醇粗提物對荔枝霜疫霉病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率分別為71.87％、54.03％和53.79％，抑菌率均超過50％。而倒地鈴、魚腥草、艾、白背葉、火炭母、鹽膚木、金銀花、地稔、香樟和山蒼子等10種植物抑菌率低于50％。飛揚(yáng)草、蒲公英和葫蘆茶等3種植物抑菌率分別為-7.77％、-16.11％和-19.41％。丘麒[13]發(fā)現(xiàn)火炭母的甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌抑菌率17.30％，本實驗同樣發(fā)現(xiàn)火炭母乙醇粗提物抑菌率為15.67％，兩者結(jié)果較為一致。陳興龍[14]實驗發(fā)現(xiàn)葫蘆茶和蒲公英甲醇提取物的抑菌率分別為了-55.66％和-16.00％，均為負(fù)值，與本實驗結(jié)果一致，表明葫蘆茶和蒲公英粗提物中含有促進(jìn)荔枝霜疫霉菌絲生長的物質(zhì)。本實驗的魚腥草抑菌率為28.06％，而陳興龍[14]實驗魚腥草則為-4.93％，但是從抑菌效果來看，一個為低抑菌率，另一個為低促進(jìn)菌絲生長，說明兩者實驗結(jié)果相近的，而數(shù)據(jù)不同，可能和提取的溶劑或提取的材料有關(guān)。曾令達(dá)[11]發(fā)現(xiàn)艾的抑菌率為46.74％，而本實驗測定抑菌率為22.70％，均表明艾對荔枝霜疫霉菌絲生長具有較低的抑菌率。馬炳陽[15]發(fā)現(xiàn)白鮮水提物對真菌如辣椒立枯病菌、番茄灰霉病菌和人參枯萎病菌等具有良好的抑菌活性，說明白鮮中含有抑真菌的活性物質(zhì)。本實驗發(fā)現(xiàn)白鮮的乙醇提取物對荔枝霜疫霉也具有較強(qiáng)的抑菌活性。周寶利[16]用95％的乙醇提取蛇床，發(fā)現(xiàn)提取液對番茄灰霉病菌具有抗菌效果，抑菌率達(dá)76.92％。而本實驗發(fā)現(xiàn)蛇床95％乙醇粗提物對荔枝霜疫霉抑菌率為53.79％，具有較強(qiáng)的抑制作用。

本實驗采用孢子萌發(fā)法對植物粗提物進(jìn)行抑孢子萌發(fā)測定，發(fā)現(xiàn)虎杖粗提物具有最高的抑孢子萌發(fā)率，為90.95％，蛇床其次，為61.93％，白鮮最低，為9.40％。抑孢子萌發(fā)率和抑菌絲生生長的抑菌率在實驗中沒有發(fā)現(xiàn)數(shù)值大小具有一致性，如抑菌絲生長最強(qiáng)的白鮮，其抑菌率為71.87％，其抑孢子萌發(fā)率則最低，為9.40％，粗提物對菌絲和孢子萌發(fā)抑制作用的不一致可能跟抑菌物質(zhì)的作用機(jī)理和作用位點(diǎn)不同有關(guān)。

本實驗將抑菌率較高的3種植物的粗提物進(jìn)行兩兩復(fù)配，發(fā)現(xiàn)供試的復(fù)配物中，以白鮮+虎杖復(fù)配物的抑菌效果最好，抑菌率為93.58％，增效比值為1.07，復(fù)配表現(xiàn)為增效作用。而白鮮+蛇床、苦杖+蛇床復(fù)配物則表現(xiàn)出拮抗作用。抑菌物質(zhì)離體抑菌實驗是田間控制植物病害的前提，良好的抑菌物質(zhì)的復(fù)配能起到增加作用位點(diǎn)、增強(qiáng)抑菌效果的作用。對起增效作用的抑菌物質(zhì)，如能進(jìn)一步明確其抑菌機(jī)理和作用方式，并由此開發(fā)出新型植物源保護(hù)劑，無疑將為植物病害的有效控制開辟一條新的途徑。本實驗中白鮮和虎杖的乙醇粗提物復(fù)配起增效作用，有進(jìn)一步研究的價值。

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【責(zé)任編輯：吳躍新】

Study on Inhibitory Effects of Some Plant Crude Extracts onPeronophythora Litchi

SONG Guan-hua1，2，CAI Dan-dan1，WANG Shao-fen1，2，ZENG Ling-da1，2
（1.Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007；2.Institute of Biotechnology，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

To screen plant original inhibitory substances，for controlling diseases of fruit trees，16 kinds of plant extracts were obtained by using ultrasonic extraction，and their antifungal activity was tested by applying to Peronophythora litchi.Results showed that those extracts from Dictamnus dasycarpus，Polygonum cuspidatum and Cnidium monnieri showed the higher inhibitory effects than those from other plants，at the 5mg/mL of concentration they exhibited 71.87％，54.03％，and 53.79％inhibition on growth of Peronophythora litchi，and 9.40％，90.95％，61.93％inhibition on porangial germination，respectively.Mixture of extracts from Dictamnus dasycarpus and Polygonum cuspidatum showed synergistic inhibitory effect on mycelial growth of Peronophythora litchi.Different plant extracts showed different inhibitory effects on Peronophythora litchi，and the compounding extracts exhibited stronger antifungal activity on Peronophythora litchi.

crude extracts；compound；Peronophythora litchi；inhibitory activity

S667.1

A

1671-5934（2016）03-0018-04

2016-05-20

廣東省科技計劃項目（2013B020304010）；惠州市科技計劃項目（2009B010001024）；惠州學(xué)院自然科學(xué)項目（C211·0220）

宋冠華（1969-），男，廣東紫金人，實驗師，研究方向為生物技術(shù)。