近緣兩個木薯品種塊根蛋白質(zhì)組比較分析

張振文,羅秀芹,林立銘,陳松筆

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部 木薯種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室,海南 儋州 571737)

?

近緣兩個木薯品種塊根蛋白質(zhì)組比較分析

張振文,羅秀芹,林立銘,陳松筆*

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部 木薯種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室,海南 儋州 571737)

摘要：以木薯(ManihotesculentaCrantz)栽培種華南9號(SC9)及其近緣野生種W14的塊根為研究對象,利用蛋白質(zhì)組學技術,分析了這兩個品種塊根的蛋白質(zhì)差異情況,并對差異蛋白質(zhì)的功能進行了分類。結果表明：主要有22個蛋白質(zhì)出現(xiàn)較大的差異表達,其中16個為已知功能的蛋白質(zhì),可分為7類,包括信號傳導、核酸代謝和碳與能量代謝等。其中,與碳和能量代謝相關的蛋白質(zhì)果膠酶，以及與光合作用相關的蘋果酸合成酶在SC9塊根細胞中的表達量顯著高于在W14中的。進一步的RT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)PME3基因在SC9塊根中的表達量顯著高于在W14中的。

關鍵詞：木薯；塊根;野生種;栽培種；蛋白質(zhì)組學；比較

木薯(Manihotesculenta),又稱樹薯,屬大戟科木薯屬植物,有5000多年的種植歷史,遍布世界90多個國家和地區(qū),包括非洲、拉丁美洲和東南亞國家,是世界六大糧食作物和三大薯類作物之一,是非洲及南美洲近6億人口的主要口糧[1],其產(chǎn)量的變化直接關系到世界的糧食安全,特別是對世界熱帶、亞熱帶地區(qū)的國家發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義,得到普遍的關注。有關研究表明木薯鮮薯產(chǎn)量的潛力可達90 t/hm2左右[2-3],是目前世界木薯平均產(chǎn)量(12.8 t/hm2, FAO, 2012)的7倍左右,發(fā)展?jié)摿薮?而品種改良是提高該作物產(chǎn)量的主要途徑之一。

隨著科技的發(fā)展,木薯品種改良和育種技術日新月異,木薯產(chǎn)量也不斷提高,這得益于新品種的推廣應用,而新品種是以豐富的種質(zhì)資源作為物質(zhì)基礎的[4]。研究表明木薯起源于中美洲,并從許多野生木薯種中馴化出野生亞種、野生近緣種和栽培種木薯[5-6]；這些種質(zhì)資源在抗逆、耐貯藏和高淀粉等生理、生化特性和農(nóng)藝特征方面有不同的表現(xiàn)[7-11]；種質(zhì)間的這種差異在蛋白質(zhì)的表達中可以得到驗證[12-14]。于是,比較野生近緣種木薯塊根與栽培種木薯塊根主要差異蛋白質(zhì)的表達,可以更好地解釋品種間的性狀差異,這對探索新基因或新蛋白質(zhì)的新功能具有重要的實踐意義。

本研究對淀粉含量低的野生近緣木薯品種和淀粉含量高的栽培木薯品種的塊根蛋白質(zhì)進行了比較,分析了野生近緣木薯品種間主要差異蛋白質(zhì)的表達情況,探討了主要差異蛋白質(zhì)的表達與光合特性的相關性,旨在為木薯新品種的選育提供理論支撐。

1材料與方法

1.1實驗材料

本實驗所用的材料為野生型木薯W14 (Manihot

esculentassp.flabellifolia)和栽培種木薯華南9號(ManihotesculentaCrantz, SC9)(如圖1)。實驗材料均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源圃,種植時間為10個月。

1.2實驗方法

本實驗采樣、取樣及對蛋白質(zhì)的提取、分離和鑒定均參照張振文[15]的方法進行。

1.3雙向電泳凝膠分析

利用Delta 2D(4.1)軟件對雙向電泳凝膠進行比較、分析。

1.4蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

對差異蛋白質(zhì)的鑒定采用德國Bruker公司生產(chǎn)的基質(zhì)輔助激光電離解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-TOF-MS/MS)。鑒定過程分為蛋白質(zhì)點胰酶酶解、質(zhì)譜檢測分析和肽段比對等3個過程,具體操作參照張振文[15]的方法進行。

1.5蛋白質(zhì)定量分析

根據(jù)蛋白質(zhì)鑒定結果,利用TransGen Biotech公司的試劑盒TransStart?Top Green qPCR SuperMix提取RNA;利用引物合成軟件,設計Pectinesterase 3 OS=CitrussinensisPE=1 SV=1蛋白質(zhì)相應的RNA保守序列,并委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,結果如下:

5-GTGACCTTGATTGGCACCTG-3

5-CTCGACGAGTGGTTTCACGA-3

5-ATGAGAAACCCACGATTCAG-3

5-TTAGCTGCCCTGTGTTGGAC-3

在Eppendorf Mastercycler?nexus X4定量PCR儀上進行擴增。反應體系如表1。

2結果與分析

2.1蛋白質(zhì)雙向電泳分離檢測結果與分析

利用雙向電泳(2D)分離技術,對W14和SC9木薯塊根的蛋白質(zhì)進行分離,并利用考馬斯亮藍G250染色3 d,經(jīng)掃描后結果如圖2所示。

利用Delta 2D(4.1)軟件對蛋白質(zhì)點進行檢測分析,其中在W14中共檢測到有效蛋白質(zhì)點426±40個,在SC9中共檢測到有效蛋白質(zhì)點451±42個。以W14為對照,對檢測到的蛋白質(zhì)點進行比對分析,其相對體積分數(shù)比對結果如圖3所示。

2.2差異表達蛋白質(zhì)的分析

利用Delta -2D軟件對SC9和W14木薯塊根的蛋白質(zhì)進行差異表達分析,結果發(fā)現(xiàn)主要差異表達的蛋白質(zhì)點有21個(如圖4)；對20個差異表達的蛋白質(zhì)的3D圖進行比較，結果如圖5所示。

2.3差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

利用MALDI-TOF-TOF/MS/MS測序技術,對差異表達的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析,并通過Matrix Science網(wǎng)站(http://www. matrixscience.com)提供的Mascot軟件查詢比對分析21個差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF),其中檢索條件：對PI和MW未做要求；肽片段最大允許誤差為0～2 Da (1 Da=1 u)；蛋白質(zhì)分類種屬選擇“Green Plant”；允許漏切位點1個。進行碘乙酰胺處理,分別在SwissProt、NCBI和MSDB數(shù)據(jù)庫進行檢索,結果如表2。

在這22個被鑒定的差異表達蛋白質(zhì)中,有16個蛋白質(zhì)的功能是已知的,可分為七大類,主要包括信號傳導、核酸代謝和碳與能量代謝等相關的蛋白質(zhì)(見圖6)。

2.4蛋白質(zhì)的定量分析

果膠甲酯酶(PME)是一種重要的果膠酶,普遍存在于高等植物根、莖、葉和果實細胞中,主要對植物細胞壁和細胞之間的果膠含量進行內(nèi)源調(diào)控[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn),PME3在SC9木薯塊根中的表達水平是W14中的3.49倍,差異十分顯著(圖7)。這一結果與蛋白質(zhì)的表達量基本吻合。

3結論與討論

從抗性來講,在木薯栽培種間塊根的次生和初生結構并無顯著差異,但野生種木薯塊根的內(nèi)皮層細胞壁比栽培種的厚,這有利于內(nèi)皮層的凱氏帶防止水分散失；同時野生種的維管束較大,從而使野生種比栽培種更為耐旱[14,19]。在植物細胞壁結構降解中的主要酶類包括多聚半乳糖苷酶(PG)、β-半乳糖苷酶、果膠酯酶(PME)、纖維素酶(Cellulose)、木葡聚糖內(nèi)糖基轉移酶(XET)等。大多數(shù)研究認為,細胞壁結構的被破壞主要由降解細胞壁的相關酶所導致[20],其中以果膠酯酶(PME)和多聚半乳糖苷酶(PG)為關鍵酶。本研究發(fā)現(xiàn),果膠甲酯酶有3種，即PME1、PME2和PME3,它們在不同的條件下由不同的基因表達,受環(huán)境溫度的影響,其中在常溫下PME3的表達量呈先增強再降低的趨勢,熱穩(wěn)定性差,在植物細胞壁降解過程中具有重要作用[18,21-26]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),兩個木薯品種采后塊根的果膠(甲)酯酶(Pectinesterase 3 OS=CitrussinensisPE=1 SV=1)的表達水平差異顯著,其在SC9塊根細胞中的表達水平遠遠高于在野生近緣種W14中的,導致細胞容易被降解,這可能就是W14的細胞壁比SC9厚的主要原因。

有研究表明野生近緣類型的木薯品種W14和栽培種Arg7的葉片均有明顯的柵欄組織和海綿組織,這是光合C3植物的主要特征,但Arg7葉片的維管束鞘細胞比W14的發(fā)達[28]。與C3植物不同,維管束鞘細胞是C4植物光合產(chǎn)物的主要合成場所,也是塊根貯藏淀粉的主要庫源,葉片光合產(chǎn)物的淀粉和可溶性糖(包括蔗糖)95%以上在維管束鞘細胞中[29],并伴隨有生理生化過程和基因定量表達等方面的差異[30]。本研究表明,差異表達蛋白質(zhì)中與光合作用相關的兩個蛋白質(zhì)點17(RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplastic)和21(Maturase K OS=ChiococcaalbaGN=matK PE=3 SV=1)均出現(xiàn)明顯的差異表達,其中這兩個蛋白質(zhì)在栽培品種SC9中的表達比在近緣種W14中的表達高,可能是部分酶基因在這兩個木薯類型中存在表達水平差異[27],而這種差異也在其他與代謝相關的蛋白質(zhì)中出現(xiàn)，特別是在與碳代謝相關的3個蛋白質(zhì)中,分別是Pectinesterase 3 OS=CitrussinensisPE=1 SV=1、Malate synthase, glyoxysomal [Triticumurartu]和ATP synthase subunit beta, mitochondrial; Flags: Precursor。其中在SC9塊根中的蘋果酸合成酶的表達水平顯著高于在W14中的,再次說明了W14在維管束鞘細胞合成的淀粉顯著少于SC9。然而,本文的研究對象是木薯塊根,卻在塊根中發(fā)現(xiàn)與光合作用和淀粉代謝相關的酶,這可能是因為在木薯植株的營養(yǎng)器官中均存在與淀粉代謝相關的酶類,其表達水平的差異導致塊根淀粉含量的差異。

本研究還發(fā)現(xiàn),在22個差異表達蛋白質(zhì)中,與信號傳導相關的蛋白質(zhì)有4個,分別是Cysteine/Histidine-rich C1 domain family protein [Arabidopsisthaliana]、EF-hand, calcium binding motif-containing protein [Arabidopsisthaliana]、Dynamin-related protein 1B OS=ArabidopsisthalianaGN=DRP1B PE=2 SV=1和Calcium-dependent protein kinase (EC 2.7.1.-) CDPK-pumpkin。這些與信號傳導相關的蛋白質(zhì)是如何協(xié)調(diào)和傳導與植物碳代謝相關酶的代謝的,有待進一步研究。

致謝：衷心感謝江蘇大學生命科學院李軍老師在蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定實驗中給予大力支持與幫助！

參考文獻:

[1] Hillocks R J, Thresh J M, Bellotti A C. Cassava: biology, production and utilization, chapter 5: cassava botany and physiology[M]. CAB International, 2002.

[2] EI-harkawy M A. Cassava biology and physiology[J]. Plant Mol Biol, 2004, 56: 481-501.

[3] 張慧堅,劉恩平,劉海清,等.廣西木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2012(5):161-165.

[4] Nagib-Nassar M A, Hasan E, Atyia E. Cassava productivity worldwide: an overview[J]. Revista Ceres, 2002, 49(284): 369-381.

[5] Hillocks R J, Thresh J M, Bellotti A C. Cassava: biology, production and utilization, chapter 1: the origins and taxonomy of cassava[M]. CAB International, 2002.

[6] Nagib-Nassar M A. Wild manihot species of Central Brazil for cassava breeding[J]. Canadian Journal of Plant Science, 1997, 58: 257-261.

[7] Ihemere U, Arias-Garzon D, Lawrence S, et al. Genetic modification of cassava for enhanced starch production[J]. Plant Biotechnology Journal, 2006, 4(4): 453-465.

[8] Sánchez T, Chávez A L, Ceballos H, et al. Reduction or delay of post-harvest physiological deterioration in cassava roots with higher carotenoid content[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86(4): 634-639.

[9] Morante N, Sánchez T, Ceballos H, et al. Tolerance to postharvest physiological deterioration in cassava roots[J]. Crop Science, 2010, 50(4): 1333-1338.

[10] Van Oirschot Q E A, O'Brien G M, Dufour D, et al. The effect of pre-harvest pruning of cassava upon root deterioration and quality characteristics[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(13): 1866-1873.

[11] Li K, Zhu W, Zeng K, et al. Proteome characterization of cassava (ManihotesculentaCrantz) somatic embryos, plantlets and tuberous roots[J]. Proteome Science, 2010, 27(8): 10.

[12] Glaucia B C, Luiz J C, Carvalho B. Analysis of proteins associated with storage root formation in cassava using two-dimensional gel electrophoresis[J]. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 2001, 13(1): 41-48.

[13] Jeanne S, Nigel T, Claude F, et al. The cassava (ManihotesculentaCrantz) root proteome: protein identification and differential expression[J]. Proteomics, 2006, 6(5): 1588-1598.

[14] Bomfim N N, Graciano-Ribeiro D, Nassar N M A. Genetic diversity of root anatomy in wild and cultivated manihot species[J]. Genetics and Molecular Research, 2011, 10(2): 544-551.

[15] 張振文.木薯塊根采后生理的蛋白質(zhì)調(diào)控機理研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W,2012.

[16] Pelloux J, Rustérucci C, Mellerowicz E J. New insights into pectin methylesterase structure and function[J]. Trends Plant Sci, 2007, 12(6): 267-277.

[17] 查笑君,馬伯軍,潘建偉,等.果膠酯酶的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(16):8293-8295.

[18] Micheli F. Pectin methylesterases: cell wall enzymes with important roles in plant physiology[J]. Trends Plant Sci, 2001, 6(9): 414-419.

[19] Nassar N M, Abreu L F, Teodoro D A, et al. Drought tolerant stem anatomy characteristics inManihotesculenta(Euphorbiaceae) and a wild relative[J]. Genet Mol Res, 2010, 9(2): 1023-1031.

[20] 張丙秀,王傲雪,李景富.番茄果實細胞壁水解酶研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009,40(1):128-132.

[21] 趙明磊,鄺健飛,陸旺金,等.采后龍眼果肉自溶過程中PME基因的表達分析[J].熱帶亞熱帶植物學報,2011,19(2):135-141.

[22] Eriksson E M, Bovy A, Manning K, et al. Effect of the colorless non-ripening mutation on cell wall biochemistry and gene expression during tomato fruit development and ripening[J]. Plant Physiology, 2004, 136(4): 4184-4197.

[23] 張卉,張妍,張璇,等.蘋果果膠酯酶提取及其酶學性質(zhì)探究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(12):197-201.

[24] 唐佳佳.枇杷果膠酯酶基因克隆及表達特性分析[D].重慶：西南大學,2014.

[25] Brummell D A, Harpster M H. Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants[J]. Plant Molecular Biology, 2001, 47(1): 311-340.

[26] Al-Qsous S, Carpentier E, Klein-Eude D, et al. Identification and isolation of a pectin methylesterase isoform that could be involved in flax cell wall stiffening[J]. Planta, 2004, 219(2): 369-378.

[27] Moustacas A M, Nari J, Borel M, et al. Pectin methylesterase, metal ions and plant cell-wall extension. The role of metal ions in plant cell-wall extension [J]. Biochem J, 1991, 279 (2): 351-354.

[28] 張揚.木薯光合生理、結構及相關基因表達特征的初步研究[D].海口：海南大學,2012.

[29] 張振清,夏叔芳.玉米葉肉細胞和維管束鞘細胞中光合產(chǎn)物的分析[J].植物生理學報,1987,13(4):338-343.

[30] 趙家磊.C4綜合癥發(fā)育遺傳機制[D].濟南：山東師范大學,2015.

(責任編輯:黃榮華)

Comparative Analysis of Proteomics in Tuberous Roots between Two Kindred Cassava Varieties

ZHANG Zhen-wen, LOU Xiu-qing, LIN Li-ming, CHEN Song-bi*

(Tropical Crop Genetic Resources Research Institute, China Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Conservation and Utilization of Cassava Genetic Resources, Ministry of Agriculture, Danzhou 571737, China)

Abstract：Using cultivar species (ManihotesculentaCrantz CV. South China 9, SC9) and wild species (Manihotesculentasubsp.flabellifolia, W14 ) as material to analyze their differences by comparative proteomics. The results showed that there were 22 proteins, which should be clustered seven types among 16 proteins that function was known, including signal transfer, RNA or DNA synthesis, carbon or energy metabolism, photosynthesis, chaperones, anti-oxidation and proteins synthesis. The expression level of Pectinesterase 3 (PME3) and Malate synthase were significant higher in the root cells of SC9 than that of in W14. The relative expression level of PME3 in the root cells of SC9 was higher than that of in W14 by RT-PCR quantitative analysis.

Key words：Cassava; Tuberous root;Manihotesculentasubsp.flabellifolia; Proteomics; Comparison

收稿日期：2015-10-12

基金項目：國家自然科學基金項目(31371684);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-12);中央及地方基本科研業(yè)務費專項(1630032012013)。

作者簡介：張振文(1975─),男,福建詔安人,副研究員,博士,研究方向:木薯采后生理及蛋白質(zhì)組學。*通訊作者:陳松筆。

中圖分類號：S533.01

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)05-0001-06