新型腦白質(zhì)病變動物模型及其腦小血管的病理學(xué)研究

林晶王迪龍邱寶山范玉華

·論 著·

新型腦白質(zhì)病變動物模型及其腦小血管的病理學(xué)研究

林晶*王迪龍*邱寶山*范玉華*

目的 建立一個新型的具有高血壓及腦小血管病理改變的腦白質(zhì)病變（white matter lesions，WMLs）動物模型。方法 13只雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機分為假手術(shù)組（n=6）與易卒中型腎血管性高血壓-改良的2VO組（stroke-prone renovascular hypertensive rat-modified 2 vessel occlusion RHRSP/Modified 2VO）（n=7），RHRSP/Modified 2VO組先行雙腎雙夾術(shù)制作RHRSP模型，12周后間隔1周先后夾閉雙側(cè)頸總動脈。雙腎雙夾術(shù)后20周對大鼠進行水迷宮試驗觀察大鼠是否存在空間記憶功能的受損，組織病理學(xué)檢測觀察是否存在腦白質(zhì)病變及相應(yīng)的腦小血管病理學(xué)改變。結(jié)果 雙腎雙夾術(shù)后12周，RHRSP/Modified 2VO組7只大鼠收縮壓均大于180 mmHg；水迷宮實驗：RHRSP/Modified 2VO組的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間比較假手術(shù)組明顯降低[(2.5±1.05 vs.5±1.67);(28.04%±14.13%vs.49.69%±13.12%)]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RHRSP/Modified 2VO組腦白質(zhì)病變的分級明顯高于假手術(shù)組(2.17±0.75 vs.0.33± 0.52)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且RHRSP/Modified 2VO大鼠存在腦小血管的病理改變（小動脈管壁增厚、血腦屏障破壞及靜脈膠原沉積）。結(jié)論 RHRSP/Modified 2VO是適用的WMLs動物模型，可用于探究WMLs的發(fā)病機制及治療靶點。

新型動物模型 腦白質(zhì)病變 腦小血管 高血壓 大鼠

腦白質(zhì)病變（white matter lesions,WMLs）也稱為腦白質(zhì)疏松（leukoaraiosis,LA），是腦小血管病的一種主要亞型，主要表現(xiàn)為核磁共振T2及FLAIR像高信號。WMLs的病理特點以髓鞘蒼白脫失、少突膠質(zhì)細胞凋亡及空泡形成為主[1]，臨床上常常表現(xiàn)為認知功能減退、癡呆、步態(tài)異常及小便失禁[2-5]，目前WMLs的發(fā)病機制暫不清楚，可能與血管解剖學(xué)因素、腦血流自動調(diào)節(jié)功能受損、靜脈膠原病等因素相關(guān)[6-8]。目前用于研究WMLs的動物模型主要有兩種—兩血管阻斷法（2-vessel occlusion,2VO）動物模型及易卒中型自發(fā)性高血壓模型（stroke-prone spontaneously hypertensive rat, SHRSP)動物模型[9-10]。易卒中型腎血管性高血壓模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat, RHRSP)通過雙腎雙夾術(shù)能產(chǎn)生穩(wěn)定的高血壓[11]。各種WMLs動物模型都存在相應(yīng)的優(yōu)缺點，本研究試圖建立一個新型合適的WMLs動物模型—易卒中型腎血管性高血壓-改良的2VO（stroke-prone renovascular hypertensive rat-modi?fied 2 vessel occlusion,RHRSP-Modified 2VO），并且對其腦小血管進行病理學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 13只健康雄性Sprague-Dawley大鼠（廣東省實驗動物中心），體質(zhì)量約80 g～90 g。所有大鼠均飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心（SPF級環(huán)境），隨機分為假手術(shù)組（n=6）和RHRSP/ Modified 2VO組（n=7），實驗過程全部遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 RHRSP/Modified 2VO模型制作及血壓測量

RHRSP/Modified 2VO組按照雙腎雙夾術(shù)[11]制定RHRSP動物模型，假手術(shù)組除了未鉗夾腎動脈其

他操作與RHRSP/Modified 2VO組一致；12周后用ML866 Powerlab 4/30型大鼠血壓計（AD Instru?ments Pty Ltd，澳大利亞）經(jīng)尾動脈測定收縮壓，收縮壓超過180 mmHg定義為RHRSP造模成功。RHRSP模型成功的大鼠先進行右側(cè)頸總動脈夾閉（5-0縫合絲線結(jié)扎兩側(cè)然后中間剪斷頸總動脈），1周后同樣方式夾閉左側(cè)頸總動脈，假手術(shù)組除了不夾閉頸總動脈余操作一樣。

1.3 水迷宮實驗雙側(cè)頸總動脈均夾閉后8周進行Morris水迷宮實驗[12]，大鼠于實驗前1天在池中自行游泳180 s以適應(yīng)水溫和環(huán)境，第1～5天為定位航行試驗（III象限中間放置平臺，大鼠按4個入水點順序放入水池，每只大鼠入水順序相同，入水開始至登入平臺為逃避潛伏期，如果60 s未找到平臺則引導(dǎo)其登入平臺，此時記錄為60 s），以每天四個入水點的逃避潛伏期均數(shù)記錄為每天的逃避潛伏期；第6天為空間搜索試驗，撤掉平臺，記錄60 s穿越平臺次數(shù)及停留于III象限的時間比。

1.4 腦組織準備及組織病理學(xué)評價水迷宮實驗結(jié)束后，所有大鼠應(yīng)用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注取腦，4%多聚甲醛后固定24 h，隨后于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片（片厚3μm）。

1.4.1 HE染色 石蠟切片脫臘后染蘇木素3 min，鹽酸乙醇分化，伊紅40 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察40～100μm小動脈形態(tài)。

1.4.2 Luxol fast blue（LFB）染色 每只大鼠取同一層面進行LFB染色：石蠟切片脫臘后，再放入0.1%LFB染液于60度烘箱過夜，95%乙醇洗去過染的腦片，先后入0.05%碳酸鋰及70%乙醇分化，隨后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，參照Wakita H等[6]分級方法對WMLs進行分級：0級，正常；1級，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂；2級，明顯空泡形成；3級，有髓神經(jīng)纖維消失。

1.4.3 Masson三色染色 石蠟切片脫臘至水，按照Masson三色染色試劑盒（Baso）進行染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察是否存在靜脈膠原沉積及部位。

1.4.4 免疫組化 取石蠟切片進行免疫組化檢測，一抗為小鼠抗大鼠MBP（1:300，Abcam），4度孵育16 h，加入二抗（1：100抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑）孵育1 h，隨后DAB顯色及蘇木素染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.5 免疫熒光 石蠟切片脫臘后進行免疫熒光，一抗為山羊抗大鼠Albumin（1:200，SANTA），4度孵育16h，加入驢抗山羊熒光二抗（1:500，Jack?son），DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，光密度及面積使用Image-Pro Plus進行測量，計量數(shù)據(jù)均以（±s）表示。水迷宮實驗逃避潛伏期使用重復(fù)測量設(shè)計方差分析，WMLs分級使用Mann-Whitney U檢驗，其余數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性情況下組間比較使用t檢驗，檢驗水準α= 0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 血壓測量結(jié)果測量雙腎雙夾手術(shù)前基礎(chǔ)血壓及術(shù)后12周血壓，術(shù)前基礎(chǔ)血壓：RHRSP/Modi?fied 2VO組較假手術(shù)組血壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(114.46±5.68 vs.108.95±7.05，t=1.562，P=0.147）；術(shù)后12周血壓：RHRSP/Modified 2VO組血壓較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（218.76±23.61 vs.126.83±7.38，t=9.759，P=0.000），且RHRSP/Modi?fied 2VO組7只大鼠收縮壓均＞180 mmHg。

2.2 死亡率假手術(shù)組6只大鼠全部存活，RHRSP/ Modified 2VO組1只大鼠在左側(cè)頸總動脈夾閉后2天死亡，其余6只RHRSP/Modified 2VO組大鼠存活。

2.3 水迷宮實驗前5天定位航行試驗顯示，兩組逃避潛伏期均逐漸遞減（圖1D）。第1天逃避潛伏期，假手術(shù)組與RHRSP/Modified 2VO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第2～5天逃避潛伏期，RHRSP/Modi?fied 2VO組均大于假手術(shù)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。第6天空間探索試驗顯示，穿越平臺次數(shù)RHRSP/Modified 2VO組（2.5±1.05）明顯小于假手術(shù)組（5±1.67），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；原平臺象限停留時間比，RHRSP/Modified 2VO組（28.04±14.13%）明顯小于假手術(shù)組（49.69± 13.12%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1C）。

2.4 Luxol fast blue染色與假手術(shù)組相比，RHRSP/Modified 2VO組白質(zhì)出現(xiàn)神經(jīng)纖維出現(xiàn)疏松、彌散性空泡形成及有髓神經(jīng)纖維的消失（圖2），WMLs分級顯示，RHRSP/Modified 2VO組（2.17±0.75）分級顯著高于假手術(shù)組（0.33±0.52），具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 MBP免疫組化MBP免疫組化顯示：RHRSP/ Modified 2VO組MBP染色紊亂且出現(xiàn)不著色的空泡，假手術(shù)組MBP染色致密均勻（圖3）；RHRSP/ Modified 2VO組平均光密度（IOD/um2）（0.05±0.01）明顯低于假手術(shù)組（0.08±0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3 E）。

圖1 水迷宮實驗：A,B分別為RHRSP/Modified 2VO組與假手術(shù)組空間探索試驗軌跡，小圈為原平臺，III象限為原平臺所在象限，RHRSP/Modified 2VO組穿越平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間比均小于假手術(shù)組；C為空間探索試驗穿越平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間比；D為定位航行試驗逃避潛伏期；*與假手術(shù)組相比，P＜0.05

2.6 腦小血管的病理改變—小動脈HE染色、白蛋白（Albumin）免疫熒光及Masson三色染色 腦小血管（40～100μm）HE染色示：RHRSP/Modified 2VO組存在管壁增厚、管腔狹窄，而假手術(shù)組管壁無明顯增厚（圖4）；血腦屏障（Blood Brain Barrier BBB）破壞后繼發(fā)的白蛋白滲漏免疫熒光示：RHRSP/Modified 2VO組較假手術(shù)組明顯增多，且在腦白質(zhì)病變部位（圖4）；Masson三色染色示：RHRSP/Modified 2VO組白質(zhì)區(qū)域存在靜脈膠原沉積，而假手術(shù)組無靜脈膠原沉積（圖4）。

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)RHRSP/Modified 2VO動物模型存在腦白質(zhì)病變，并且伴隨腦小血管病最常見的危險因素（高血壓）、小血管的病理改變（小動脈管壁增厚，BBB破壞及靜脈膠原沉積）及空間記憶功能的受損。提示RHRSP/Modified 2VO是合適的腦白質(zhì)病變動物模型。

我們的研究采用Modified 2VO是為了克服傳統(tǒng)的2VO動物模型出現(xiàn)強烈的急性缺血引起死亡率過高的問題；2VO動物模型雙側(cè)頸總動脈夾閉后血流量下降55%～70%，維持2～3 d后進入慢性缺血期，大鼠死亡多見于急性缺血階段[13]；Fujishi?ma等[14]研究發(fā)現(xiàn)在高血壓基礎(chǔ)的2VO死亡率（72%，78/108）比正常血壓基礎(chǔ)的2VO死亡率（16%，7/43）顯著增高；我們在高血壓的基礎(chǔ)上選擇Modified 2VO并沒有明顯增加死亡率。傳統(tǒng)的2VO動物模型存在腦白質(zhì)病變，但與人產(chǎn)生腦白質(zhì)病變的過程相差甚遠，因為2VO動物模型缺乏腦小血管病的危險因素及相應(yīng)的小血管病理改變；RHRSP/Modified 2VO存在最常見的危險因素高血壓且有腦小血管的病理學(xué)改變（小動脈管壁增厚，BBB破壞及靜脈膠原沉積）。但RHRSP/ Modified 2VO小動脈管壁增厚程度并不是非常嚴重而且部位局限，這可能是由于功能受損先于形態(tài)學(xué)改變，有研究表明長期高血壓在腦小血管形態(tài)學(xué)出現(xiàn)改變之前已經(jīng)存在內(nèi)皮的功能受損，從而影響2VO后的側(cè)支循環(huán)開放繼而引起腦白質(zhì)病變[15,16]。后期的研究將探究該模型是否存在內(nèi)皮細胞功能的受損，為后期的干預(yù)靶點提供基礎(chǔ)。

圖2 LFB染色：A,B分別為RHRSP/Modified 2VO組LFB染色的大體圖及相對應(yīng)的高倍鏡圖（400×）；C,D分別為假手術(shù)組LFB染色的大體圖及相對應(yīng)的高倍鏡圖（400×）；箭頭所指為空泡

圖3 MBP免疫組化：A,B分別為RHRSP/Modified 2VO組胼胝體及尾狀核MBP免疫組化染色（200×），C,D分別為假手術(shù)組胼胝體及尾狀核MBP免疫組化染色（200×）；A,B示RHRSP/Modified 2VO組胼胝體及尾狀核出現(xiàn)纖維紊亂及空泡，而C,D示假手術(shù)組纖維致密均勻；箭頭所指為空泡；E為MBP平均光密度統(tǒng)計圖，*與假手術(shù)組相比，P＜0.05

圖4 HE染色、白蛋白免疫熒光及Masson三色染色：A,D分別為RHRSP/Modified 2VO組及假手術(shù)組HE染色（400×），RHRSP/Mod?ified 2V0組存在管壁增厚、管腔狹窄，bar=50um；B,E分別為RHRSP/Modified 2VO組及假手術(shù)組Albumin免疫熒光（200×），RHRSP/Modified 2VO組較假手術(shù)組白蛋白滲漏明顯增多；C,F分別為RHRSP/Modified 2VO組及假手術(shù)組Masson三色染色（200×），RHRSP/Modified 2VO組存在靜脈膠原沉積，bar=100um

這個新的WMLs動物模型（RHRSP/Modified 2VO）包含了腦血管病最常見的因素高血壓并且存在高血壓導(dǎo)致的腦小血管病理改變，既可以用于研究腦小血管原發(fā)的病理生理改變，也可以用于探索繼發(fā)的腦實質(zhì)病變，而傳統(tǒng)的2VO無法探究高血壓導(dǎo)致的腦小血管結(jié)構(gòu)與功能的變化。本研究也存在一定的局限性，RHRSP/Modified 2VO大鼠病變程度不同（包括WMLs的分級及病變范圍），且有1只大鼠WMLs分級只有1級，這可能與造模時間太短存在相關(guān)性，后期的研究可延長造模時間從而增加模型的穩(wěn)定性。

因此，我們這種新型的動物模型（RHRSP/ Modified 2VO）是適用的WMLs動物模型，可用于探究WMLs的發(fā)病機制及治療靶點。

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Establishment of a novel animal model for white matter lesions and its pathological study of cerebral smallvessels.

LIN Jing,WANG Dilong,QIU Baoshan,FAN Yuhua.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,National Key Clinical Department,National Key Discipline,Guangdong Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Major Neurological Diseases(2014B030301035),Guangzhou 510080,China.Tel：020-87332200.

Objective To establish a novel white matter lesions(WMLs)animal model with hypertension and to ex?amine its pathological changes of cerebral small vessels.Methods Thirteen male Sprague-Dawley rats were randomly di?vided into sham operation group(n=6)and stroke-prone renovascular hypertensive rat-modified 2 vessel occlusion group (RHRSP/Modified 2VO)(n=7).RHRSP/Modified 2VO group was induced by the two-kidney two clip method first and un?derwent the operation of modified bilateral common carotid artery occlusion(1 week interval)12 weeks later.Morris wa?ter maze test was used to detect spatial memory function and pathology test was used to investigate white matter lesions and the cerebral small vessels after 20 weeks of two-kidney two clip operation.Results Twelve weeks after two-kidney two clip operation,the blood pressure was more than 180mmHg in all RHRSP/Modified 2VO.Morris water maze test showed that escape latencies was significantly higher in RHRSP/Modified 2VO group than in the sham operation group(P＜0.05).The number of crossing hidden platform as well as time ratio in the target quadrant of were significantly shorter in the RHRSP/Modified 2VO group than in sham operation group[(2.5±1.05 vs.5±1.67);(28.04±14.13%vs.49.69± 13.12%)](P＜0.05).Compared to sham operation group,RHRSP/Modified 2VO group had a higher grade of WMLs(2.17± 0.75 vs.0.33±0.52)(P＜0.05)and exhibited the pathological changes of cerebral small vessels including small artery wall thickening,BBB disruption and venous collagen deposition.Conclusions RHRSP/Modified 2VO can be regarded as ap?propriate WMLs animal model and may therefore be adapted to explore pathogenesis and possible treatments for WMLs.

Novel animal model White matter lesions(WMLs)Cerebral small vessels Hypertension Rat

R743.3

A

2016-09-26）

（責任編輯:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.11.008

☆ 廣東省科技計劃項目（編號：2015A030302013）

* 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，國家臨床重點專科，廣東省重大神經(jīng)疾病診治研究重點實驗室（2014B030301035）（廣州 510080）

E-mail：fansusan@126.com）