哺乳期使用氟西汀對子代大鼠行為學(xué)及5-羥色胺轉(zhuǎn)運體和色氨酸羥化酶影響研究

成熟陳茉弦蔣玲雷蕾周婭陳倩敖麗娟

·論 著·

哺乳期使用氟西汀對子代大鼠行為學(xué)及5-羥色胺轉(zhuǎn)運體和色氨酸羥化酶影響研究

成熟*陳茉弦△蔣玲※雷蕾◎周婭◎陳倩◎敖麗娟△

目的觀察哺乳期使用氟西汀對子代大鼠行為學(xué)及5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）和色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）蛋白的影響。方法妊娠SD大鼠隨機分為2組，每組各3只。待分娩后5～21 d予以實驗組母鼠腹腔注射氟西汀（12 mg/kg），對照組母鼠腹腔注射等量生理鹽水，期間正常哺乳，第21 d斷奶。每只母鼠的子代中各挑選8只，嬰兒期不同時間點分別測量體重、毛發(fā)、睜眼以評價生長發(fā)育，聽覺、埋藏食物小球和自由懸掛實驗評價其神經(jīng)反射和運動行為；兒童期和青年期（出生后35 d和75 d）分別取實驗組和對照組子代大鼠各6只，取腦組織行免疫組織化學(xué)染色檢測前額皮質(zhì)SERT及TPH水平。結(jié)果嬰兒期氟西汀組子代大鼠體重較對照組低（P＜0.05），聽覺敏感性得分較對照組高（P＜0.01），自由懸掛實驗時間較對照組短（P＜0.01）。兒童期和青年期時氟西汀組子代前額皮質(zhì)SERT及TPH均較對照組降低（P＜0.05）。結(jié)論哺乳期母鼠暴露于氟西汀可能通過下調(diào)子代大鼠前額皮質(zhì)SERT和TPH導(dǎo)致其發(fā)育和行為異常。

哺乳期 氟西汀 行為學(xué) 5-羥色胺轉(zhuǎn)運體 色氨酸羥化酶

社會節(jié)奏的加快使產(chǎn)后抑郁現(xiàn)象迅速增多，國內(nèi)報道產(chǎn)后抑郁的發(fā)生率為23.08%[1]，而在年輕的未婚媽媽當(dāng)中可以達(dá)到26%[2]。新生兒在哺乳期暴露于抗抑郁藥可能會影響其發(fā)育[3-4]，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)及生理、代謝功能的永久性改變，使其在兒童或者成年期容易罹患孤獨癥。大量研究證實孤獨癥的發(fā)生與發(fā)育期高血5-羥色胺（5-hy?droxytryptamine，5-HT）相關(guān)[5]，而母體服用的5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake in?hibitor，SSRI）可通過乳汁排泄并透過嬰兒血腦屏障[6]，通過與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transport?er，SERT）結(jié)合而抑制5-HT再攝取，從而提高5-HT在突觸間隙的含量。本研究主要探究哺乳期使用抗抑郁藥對子代行為學(xué)及SERT和5-HT合成限速酶色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）蛋白的影響，模擬臨床發(fā)育期高血5-HT（de?velopmental hyperserotonemia，DHS）孤獨癥假說[7]，為孤獨癥的發(fā)病機制和哺乳期用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組實驗用Sprague-Dawley雌性母鼠（昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）6只，體重300～320 g，孕18 d。隨機分為氟西汀組和對照組，每組3只母鼠。子代大鼠出生后，每只母鼠的子代中各挑選8只，5.5～6.5 g。氟西汀組母鼠在產(chǎn)后5～21 d（postpartum，P5～21）每天腹腔注射氟西汀12 mg/kg，對照組母鼠在產(chǎn)后P5～21每天腹腔注射等量生理鹽水，期間正常哺乳。P21時仔鼠斷奶，雌雄分籠飼養(yǎng)。所有大鼠及其子代飼養(yǎng)在溫度22℃、濕度60%、12 h光:12 h暗（早6:00開燈，晚6:00關(guān)燈）的循環(huán)動物房中，自由飲水、進食。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 生長發(fā)育、神經(jīng)發(fā)射和運動行為評價

1.2.1 體重和毛發(fā) 在仔鼠嬰兒期不同時間點（P9、P11、P13）于上午9:00稱量體重，并用小鑷子拔少許尾部的毛發(fā)，選擇一根最長、硬度類似的毛發(fā)置于黑色硬紙板上，用游標(biāo)卡尺測量毛發(fā)長度。

1.2.2 睜眼 于仔鼠嬰兒期（P9、P11、P13）觀察睜眼情況。評分依據(jù)：2分為兩只眼睛均睜開；1分為1只眼睛睜開；0分為2只眼睛均未睜開。

1.2.3 聽覺 在仔鼠嬰兒期（P9、P11、P13）進行聽覺檢查。將每只仔鼠單獨移至距一金屬板垂直距離15 cm的平面上，在仔鼠平靜無意識準(zhǔn)備的情況下，在距金屬板15 cm高處墜下一金屬球，撞擊金屬板，發(fā)出強烈的聲音以給予刺激。實驗者觀察仔鼠肌肉收縮或夾尾抽搐為陽性反應(yīng)，連續(xù)2次刺激反應(yīng)陽性為達(dá)標(biāo)，達(dá)標(biāo)計為1分，未達(dá)標(biāo)計為0分。

1.2.4 自由懸掛實驗 在仔鼠P11、P13時進行，將仔鼠前肢放在一固定水平位置的T型金屬橫桿上，橫桿直徑0.5 cm，距地面高度30 cm，待其前肢握住橫桿后松手，實驗者用秒表計時仔鼠抓握橫桿懸掛的時間。

1.2.5 埋藏食物小球?qū)嶒?仔鼠P26時進行埋藏食物小球?qū)嶒炓栽u價嗅覺發(fā)育。仔鼠被置于一個45 cm×24 cm×20 cm的無色透明測試籠中，籠內(nèi)盛有3 cm深的干凈墊料。將與1 g大鼠飼料同等體積的蛋糕埋藏于墊料下方0.5 cm處，用秒表計時仔鼠找到蛋糕時間，即從仔鼠被放入測試籠中開始，到揭開食物并用前爪或牙齒抓住食物的時間，仔鼠若在5 min內(nèi)未找到食物，則計為5 min。仔鼠在測試之前禁食24 h，每只仔鼠測試結(jié)束，更換墊料防止留下氣味線索。

1.3 前額皮質(zhì)SERT和TPH檢測

1.3.1 標(biāo)本制備 于仔鼠兒童期和成年期，即P35和P75時分別從兩組各取6只。將仔鼠稱重并記錄，配置濃度為5%水合氯醛麻醉大鼠，待大鼠麻醉后（四肢無肌張力）開始大腦灌注固定。取腦時從延髓開始，慢慢分離顱底組織。將所取腦組織放入盛有4%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱保存24 h，然后將腦標(biāo)本放入15%和30%蔗糖溶液進行梯度脫水，直至標(biāo)本漂浮起來。脫水完成后，OTC包埋劑包埋置于-80℃，冷卻后取出切片（厚約10 μm），放置于-20℃保存待用。

1.3.2 免疫組化檢測 取出待用切片，PBS洗滌5 min 3次，室溫下3%H2O2封閉15 min除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，PBS洗滌，室溫下血清封閉1 h，4℃下一抗（兔抗SERT和TPH抗體，Abcam公司）孵育過夜，PBS洗滌，室溫下二抗孵育1 h，PBS洗滌，顯色劑避光顯色5 min，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，酒精和二甲苯梯度脫水后用中性樹膠封片。免疫組化染色后陽性結(jié)果呈黃色或棕黃色。在高倍鏡（10× 40）下，隨機選擇5個高倍視野，每個視野計數(shù)1000個細(xì)胞以上，計算陽性細(xì)胞比例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，體重、毛發(fā)長度、睜眼評分、自由懸掛時間屬于重復(fù)測量資料，使用重復(fù)測量方差分析進行統(tǒng)計分析，各時點上組間比較采用獨立樣本t檢驗。兩組間埋藏食物小球?qū)嶒灂r間及SERT和TPH的比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α為0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 仔鼠哺乳期生長發(fā)育情況

2.1.1 體重 仔鼠體重經(jīng)重復(fù)測量方差分析示，時間主效應(yīng)（F=5.89，P=0.02）、分組主效應(yīng)（F=7.22，P=0.01）、時間與分組的交互效應(yīng)（F=17.81，P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。在P9、P11、P13時，氟西汀組與對照組仔鼠體重差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.1.2 毛發(fā) 仔鼠毛發(fā)長度的時間主效應(yīng)（F= 26.12，P＜0.01）、時間與分組的交互效應(yīng)（F=13.13，P=0.02）有統(tǒng)計學(xué)意義，分組主效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.03，P=0.10）。P9和P11時兩組間毛發(fā)長度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），P13時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.1.3 睜眼 氟西汀組和對照組仔鼠在P9和P11時均未睜眼。P13時氟西汀組仔鼠睜眼程度與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 仔鼠哺乳期神經(jīng)反射及運動功能

2.2.1 聽覺 仔鼠聽覺評分的時間主效應(yīng)（F=8.00，P=0.01）、分組主效應(yīng)（F=8.03，P=0.01）、時間與分組的交互效應(yīng)（F=8.14，P=0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。氟西汀組仔鼠聽覺得分在P9和P11時高于對照組（P＜0.01），在P13時兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同時間點氟西汀組與對照組仔鼠生長發(fā)育和神經(jīng)反射及運動發(fā)育情況（±s）

表1 不同時間點氟西汀組與對照組仔鼠生長發(fā)育和神經(jīng)反射及運動發(fā)育情況（±s）

1）重復(fù)測量方差分析后，與對照組相比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，P＜0.05；2）重復(fù)測量方差分析后，與對照組相比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，P＜0.01

P11 n 體重（g）組別氟西汀組對照組毛發(fā)長度（mm）P9 19.73±1.821)21.49±1.39 P11 20.81±2.041)22.94±1.36 P13 23.48±2.611)27.86±1.20 P9 2.34±0.48 2.68±0.39 P11 2.63±0.30 2.69±0.36 P13 3.50±0.571)4.87±0.70睜眼P9 24 24 00 00組別 聽覺得分氟西汀組對照組睜眼P13 1.25±0.89 1.19±0.94 P9 0.67±0.492)0.13±0.35 P11 0.78±0.432)0.25±0.46 P13 0.88±0.33 0.98±0.23自由懸掛時間（s）P11 1.56±0.702)3.63±1.51 P13 2.9±1.062)5.00±2.45埋藏食物小球?qū)嶒灂r間（s）P26 24.17±23.93 27.30±33.32

2.2.2 自由懸掛實驗 仔鼠自由懸掛實驗時間的時間主效應(yīng)（F=22.41，P＜0.01）、分組主效應(yīng)（F= 18.15，P＜0.01），時間主與分組的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.17，P＜0.01）。P11和P13時氟西汀組仔鼠自由懸掛實驗時間均較對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2.3 埋藏食物小球?qū)嶒?P26氟西汀組仔鼠埋藏食物小球?qū)嶒灂r間與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 前額皮質(zhì)SERT和TPH表達(dá)水平兒童期（P35）時，氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)SERT（32.67%± 2.52%）表達(dá)低于對照組（49.33%±3.06%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-10.30，P＜0.01），見圖1；氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)TPH（51.33%±3.06%）表達(dá)亦低于對照組（72.33%±9.61%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.10，P＜0.01），見圖2。待仔鼠生長發(fā)育至青年期（P75），氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)SERT（14.32%±1.73%）表達(dá)低于對照組（36.12%± 2.18%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-19.17，P＜0.01），見圖3；氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)TPH（39.26%± 3.45%）表達(dá)亦低于對照組（56.67%±8.42%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.67，P＜0.01），見圖4。

圖1 氟西汀組和對照組仔鼠P35前額皮質(zhì)SERT表達(dá)變化（40×）A為氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)SERT的表達(dá)；B為對照組仔鼠前額皮質(zhì)SERT的表達(dá)

圖2 氟西汀組和對照組仔鼠P35前額皮質(zhì)TPH表達(dá)變化（40×）A為氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)TPH的表達(dá)；B為對照組仔鼠前額皮質(zhì)TPH的表達(dá)

圖3 氟西汀組和對照組仔鼠P75前額皮質(zhì)SERT表達(dá)變化（40×）A為氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)SERT的表達(dá)；B為對照組仔鼠前額皮質(zhì)SERT的表達(dá)

圖4 氟西汀組和對照組仔鼠P75前額皮質(zhì)TPH表達(dá)變化（40×）A為氟西汀組仔鼠前額皮質(zhì)TPH的表達(dá)；B為對照組仔鼠前額皮質(zhì)TPH的表達(dá)

3 討論

SSRI類抗抑郁藥是一種新型抗抑郁藥物，鎮(zhèn)靜作用小，不損傷精神運動功能，對心血管和自主神經(jīng)系統(tǒng)功能影響很小。因此，已成為臨床治療抑郁癥的一線用藥。其中氟西汀的半衰期為2～3 d，是所有SSRI中最長的[8]，可以在母體血中聚集并排泄到乳汁。故本研究選用氟西汀作為代表藥物，模擬臨床發(fā)育期高血5-HT孤獨癥假說探究哺乳期服用SSRIs類抗抑郁藥對子代行為學(xué)及SERT和TPH的影響。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，母親在圍產(chǎn)期服用抗抑郁藥，其子代在青少期可能會出現(xiàn)不同形式的行為異常，如孤獨癥樣行為、社會交往障礙及運動功能亢進等[9]。本研究表明，哺乳期母鼠使用氟西汀對子代一般生長發(fā)育和行為學(xué)發(fā)育有較明顯的影響，這些行為學(xué)的異常類似孤獨癥發(fā)育遲緩、社會交往障礙的表現(xiàn)[10]，本研究結(jié)果與之前的許多研究結(jié)果一致[10-11]。SIMPSON等[12]證實圍產(chǎn)期婦女使用SSRI類抗抑郁藥可導(dǎo)致子代出現(xiàn)新事物恐懼的概率增加，并且損害其青年期游戲行為；類似的，有學(xué)者證實圍產(chǎn)期SSRI暴露可以改變子代成年期的社交行為[13-14]。RODRIGUEZ-PORCEL等[15]在P8～21給予哺乳期母鼠SSRI類抗抑郁藥西酞普蘭，結(jié)果表明在P39時西酞普蘭組仔鼠新事物探索行為減少，P32時（青年期）雄性仔鼠游戲行為較對照組顯著減少，P153時雄性仔鼠性行為明顯減少。MACIAG等[16]采用上述同樣的動物模型，證實新生兒期母鼠使用SSRI類抗抑郁藥西酞普蘭可導(dǎo)致子代大鼠成年后運動行為增加，性行為減少，快動眼睡眠時間增加，在強迫游泳實驗中不動行為增加。

目前雖然孤獨癥的發(fā)病機制尚不清楚，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為孤獨癥患者腦內(nèi)均存在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的異常[17-18]，其中5-HT神經(jīng)遞質(zhì)異常最為常見。5-HT廣泛存在于哺乳動物組織中，特別在大腦皮層及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高，是一種能產(chǎn)生愉悅情緒的信使，在腦的形態(tài)發(fā)育，包括神經(jīng)細(xì)胞的增值、分化和遷移中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[19-20]。5-HT受體則廣泛存在人類大腦皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)和海馬等區(qū)域，是參與多種認(rèn)知、語言表達(dá)等功能的重要部位。5-HT系統(tǒng)被認(rèn)為與注意缺陷、行為問題等發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。因此，5-HT系統(tǒng)的功能障礙與孤獨癥存在因果關(guān)系[21]。本研究也發(fā)現(xiàn)母鼠哺乳期服用抗抑郁藥，子代大鼠兒童期（P35）和青年期（P75）前額皮質(zhì)TPH及SERT較對照組明顯減少。SIMPSON等[12]在嚙齒類動物實驗中也證實圍產(chǎn)期抗抑郁藥暴露可改變子代皮層5-HT環(huán)路功能，下調(diào)TPH及SERT表達(dá)。MACIAG等[16]也得到類似結(jié)論。TPH是5-HT合成的限速酶，5-HT由色氨酸羥化酶合成后少部分轉(zhuǎn)運到細(xì)胞突觸間隙發(fā)揮作用，大部分由突觸前膜SERT轉(zhuǎn)運至囊泡中儲存。母鼠哺乳期服用氟西汀后，氟西汀及其活性代謝產(chǎn)物去甲氟西汀可分泌到乳汁，通過未發(fā)育成熟的血腦屏障到達(dá)發(fā)育期仔鼠腦中，特異性與SERT結(jié)合以抑制突觸前膜SERT攝取5-HT至囊泡，從而提高突出間隙5-HT含量，使5-HT的合成（TPH）減少[12]。導(dǎo)致5-HT系統(tǒng)紊亂[22]。還有研究顯示，約1/3孤獨癥兒童腦組織5-HT濃度增高[23]。

綜上，哺乳期使用SSRI類抗抑郁藥氟西汀對子代大鼠生長發(fā)育和行為學(xué)有較明顯影響，這種影響可能與子代大鼠前額皮質(zhì)SERT和TPH下調(diào)有關(guān)，但其具體機制目前尚不明確，有待進一步探索。然而，本研究未能檢測外周血及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT水平，行為學(xué)檢測手段亦有限。因此，在進一步機制研究中將比較中樞與外周血中5-HT水平，使用更豐富的行為學(xué)實驗?zāi)M發(fā)育期高血5-HT孤獨癥行為。

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The effects of offspring's behavior and SERT and TPH during the lactation exposure to fluoxetine.

CHEN Shu,CHEN Moxuan,JIANG Ling,LEI Lei,ZHOU Ya,CHEN Qian,AO Lijuan.The second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China.Tel:0871-5922957.

Objective To explore the influence of the lactation exposure to fluoxetine on offspring’s behavior and serotonin transporter(SERT)and tryptophan hydroxylase(TPH).Methods Six SD pregnant rats were randomly divided into 2 groups(n=3 each group).Experimental maternal rats were intraperitoneally injected with fluoxetine at a dose of 12 mg/kg from postnatal day 5 to 21.The control group were injected with the same amount of normal saline.In infancy,the offspring’s weight,hair length,eye opening and auditory development were measured.The free suspension test and bur?ied food pellets test were applied to evaluate the offspring’s behaviors.After postnatal day 21,all the offspring were wean.At early childhood(P35d)and adulthood(P75d),6 offspring rats from each group were executed to examine SERT and TPH in the prefrontal cortex by immunohistochemistry.Results The offspring’s weight of experimental group was significantly lower than control group(P＜0.05).The sensitivity of auditory in experimental group was significantly higher than control group(P＜0.01).The time of free suspension in experimental group significantly was decreased comparing to control group(P＜0.01).The SERT and TPH in prefrontal cortex was significantly lower in experimental group than those incontrol group either at childhood(P35d)or at adulthood(P75d)(P＜0.05).Conclusion Lactation exposure to fluoxetine re?sults in offspring’s abnormal development and behaviors through down-regulation of SERT and TPH in the prefrontal cor?tex.

Lactation fluoxetine behavioristics SERT TPH

R749.4；R749.94

A

2016-05-05）

（責(zé)任編輯:肖雅妮）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.11.001

☆ 國家自然科學(xué)基金（編號：81260296）；昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2015年研究生創(chuàng)新基金（編號：2015S90）

* 昆明醫(yī)科大學(xué)研究生，現(xiàn)在華潤武鋼總醫(yī)院康復(fù)科工作（武漢 430080）

△昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)科

※ 曲靖市中心醫(yī)院康復(fù)科

◎ 昆明醫(yī)科大學(xué)

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