脂肪酶對(duì)油脂體外降解及消化的研究

張珍珍，鄭達(dá)文，寧 冬，劉文秀，黃小桃，陳冰菲

(東莞泛亞太生物科技有限公司，廣東 東莞 523808)

油脂是人和動(dòng)物生存和生活所必需的重要成分。油脂不僅是一種食物資源，也是醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)的一種基本原料[1]。油脂的降解大部分會(huì)依托于生物體自身的脂肪代謝過程，對(duì)人和單胃動(dòng)物而言，油脂的消化主要集中在十二指腸下部和空腸上部，經(jīng)過腸道膽汁的乳化作用使得其表面積增加，然后在胰脂肪酶的作用下將游離脂肪酸從三酰甘油分子中水解[2-5]。

除了人體和動(dòng)物體能自身分泌的內(nèi)源脂肪酶外，外源脂肪酶也在食品烘焙、奶酪制備、動(dòng)物飼料方面[6-8]作為添加劑被廣泛使用，以提高產(chǎn)品品質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在人造奶和廢油脂降解等方面也同樣具有很好的開發(fā)前景。Qin等[9]利用脂肪酶催化酸解豬板油與油茶籽油脂肪酸的反應(yīng)從而制備富含OPO的嬰幼兒人乳替代品；趙璞[10]通過對(duì)9種植物油添加脂肪酶進(jìn)行酯交換反應(yīng)模擬母乳化脂肪脂質(zhì)的制備；彭元懷等[11]嘗試通過添加脂肪酶優(yōu)化水解地溝油工藝，提高其利用附加值等。

目前脂肪酶降解油脂的研究大多集中在對(duì)原始動(dòng)物油脂和少部分植物油脂上，而脂肪酶的主要作用階段是在小腸階段，此時(shí)油脂經(jīng)過口腔、胃和小腸前端的蠕動(dòng)早已進(jìn)入到乳化狀態(tài)[12-13]，其更有利于脂肪酶的后續(xù)作用。本文對(duì)豬油、鴨油、菜籽油、大豆油等油脂進(jìn)行初步乳化，再測(cè)定添加脂肪酶后生成的脂肪酸含量。由于動(dòng)物的飲食相對(duì)固定并更有規(guī)律，且豬的消化道結(jié)構(gòu)及消化生理與人體的非常接近[14]，本文采用與人消化道結(jié)構(gòu)接近的豬模型，模擬豬的胃腸道消化過程，研究經(jīng)過胃液處理階段的脂肪酶是否仍有降解油脂的功效。這對(duì)于進(jìn)一步了解脂肪酶在不同動(dòng)植物油脂中的作用效果及在食品和飼料中的合適添加劑量都具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菜籽油、大豆油，購于農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)；豬油、鴨油、棕櫚油，由東莞興業(yè)飼料有限公司提供；脂肪酶，來源于東莞泛亞太生物科技有限公司，初始酶活為80 000 U/g。

聚乙烯醇(PVA)，酚酞，胃蛋白酶(Sigma-7000)，α-淀粉酶(Sigma A3306)，胰蛋白酶(Amresco 0785)，糜蛋白酶(Amresco 0164)，氯霉素，磺基水楊酸。

分光光度計(jì)，高速勻漿機(jī)，電磁攪拌器，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，抽濾裝置，Whatman無氮濾紙，IKA200量熱儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳化油脂的制備

乳化方法參考GB/T 23535—2009。稱取聚乙烯醇(PVA)40 g，加水800 mL，在沸水浴中加熱、攪拌直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL，用干凈的雙層紗布過濾，取濾液150 mL，加入50 mL待測(cè)油脂樣品，用高速勻漿機(jī)處理6 min，得到乳白色PVA乳化油脂，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 乳化油脂酶解時(shí)間的確定

分別取4 mL大豆油、菜籽油、棕櫚油、鴨油和豬油的乳化油脂，加入5 mL pH 7.5磷酸緩沖液，40℃、180 r/min恒溫振蕩箱預(yù)熱5 min，加入10 U脂肪酶，充分搖勻，分別反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4、5、6 h，加入95%乙醇15 mL，終止反應(yīng)。反應(yīng)液中加入10 g/L酚酞指示劑2滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30 s不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，計(jì)算脂肪酸含量，根據(jù)脂肪酸含量確定酶解時(shí)間。

1.2.3 乳化油脂酶解酶活劑量的確定

分別取4 mL大豆油、菜籽油、棕櫚油、鴨油和豬油的乳化油脂，加入5 mL pH 7.5磷酸緩沖液，40℃、180 r/min恒溫振蕩箱預(yù)熱5 min，分別加入0、5、10、20、40、80、170、200、230、260 U脂肪酶，充分搖勻，按照1.2.2確定的酶解時(shí)間及方法進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定最佳酶活劑量。

1.2.4 體外模擬胃腸道消化

1.2.4.1 試驗(yàn)日糧及組成

試驗(yàn)日糧以乳仔豬玉米、豆粕日糧為主要原料，參照NRC[15]推薦的營(yíng)養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)。日糧配方見表1。

表1 試驗(yàn)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平 %

1.2.4.2 消化樣品的制備

將飼料樣品粉碎，過60目篩，置于干燥器內(nèi)保存待測(cè)。

1.2.4.3 干物質(zhì)含量測(cè)定

飼料樣品水分測(cè)定參見GB/T 6435—2014《飼料中水分的測(cè)定》。干物質(zhì)含量=1-水分含量。

1.2.4.4 胃腸道消化

小腸緩沖液、模擬豬胃液和模擬豬小腸液均按照趙峰等[16]的方法配制，因是高油脂原料，故體外消化過程參考何科林等[17]方法，并略作改動(dòng)。

模擬豬胃液：稱取184.375 kU胃蛋白酶于250 mL pH 2.0的鹽酸溶液中(39℃下標(biāo)定pH)，緩慢攪拌直至溶解，臨用前配制。

小腸緩沖液：稱取8.32 g無水磷酸氫二鈉，40.96 g無水磷酸二氫鈉，11.55 g氯化鈉和2.45 g氯化鉀，氯霉素5 g，放入2 000 mL燒杯中，加入1 800 mL去離子水溶解，并用無水氫氧化鈉在39℃下調(diào)節(jié)溶液的pH至6.44，再用去離子水定容至2 000 mL。

模擬豬小腸液：分別稱取60.89 kUα-淀粉酶，19.00 kU胰蛋白酶，2.39 kU糜蛋白酶，溶解于25 mL去離子水中，并緩慢攪拌至溶解，臨用前配制。

準(zhǔn)確稱取1 g過60目篩的飼料樣品，根據(jù)1.2.3酶活劑量的結(jié)果加入稀釋后指定酶活的脂肪酶，加入15 mL的模擬豬胃液和0.5 mL 0.5%氯霉素溶液，小心混合均勻后，具塞封口，于39℃、120 r/min消化1 h。

胃消化階段結(jié)束后，向食糜中加入14 mL小腸緩沖液，并用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)整食糜pH至6.44，加入2 mL模擬小腸液，39℃、120 r/min消化4 h。

待消化完畢，向消化殘?jiān)屑尤? mL 20%磺基水楊酸，室溫放置30 min，將消化液真空抽濾，并用1%磺基水楊酸對(duì)消化瓶進(jìn)行完全沖洗，隨后將殘?jiān)B同已知質(zhì)量的Whatman無氮濾紙取出，參考1.2.4.3方法測(cè)定殘?jiān)晌镔|(zhì)含量，按下式計(jì)算樣品的干物質(zhì)消化率，隨后用量熱儀測(cè)定干燥殘?jiān)苤?，按下式?jì)算能量消化率。

干物質(zhì)消化率=(M1-M2)/M1×100%

能量消化率=(E1-E2)/E1×100%

式中：M1為飼料樣品干物質(zhì)質(zhì)量，g；M2為殘?jiān)晌镔|(zhì)質(zhì)量，g；E1為飼料樣品總?cè)紵裏嶂担琂；E2為殘?jiān)側(cè)紵裏嶂担琂。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Microsoft Excel進(jìn)行初步整理后，再用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對(duì)乳化油脂酶解的影響

不同乳化油脂添加10 U脂肪酶后在不同酶解時(shí)間下生成的脂肪酸含量變化如表2所示。

表2 添加10 U脂肪酶時(shí)不同酶解時(shí)間乳化油脂生成的脂肪酸含量變化

由表2可知，酶解4 h時(shí)，不同乳化油脂生成的脂肪酸含量已經(jīng)趨于穩(wěn)定，故將脂肪酶酶解時(shí)間定為4 h。從表2中也可看出：棕櫚油、豬油的乳化油脂中的初始脂肪酸含量較高，加酶后產(chǎn)生的脂肪酸的增長(zhǎng)幅度也顯著大于大豆油、鴨油和菜籽油的乳化油脂(P<0.05)，這可能與大豆油、菜籽油和鴨油脂肪酸組成中中短鏈脂肪酸含量要遠(yuǎn)低于長(zhǎng)鏈脂肪酸有關(guān)[18-19]，且此類油脂中含量較高的不飽和脂肪酸大都分布于Sn-2位[20]，不利于脂肪酶的消化分解，所以產(chǎn)生的脂肪酸量相對(duì)較低；而棕櫚油和豬油中16碳原子的飽和棕櫚酸含量較高，分別達(dá)到了43%和23%，且多分布于Sn-1,3位[21]，說明當(dāng)該脂肪酶不足時(shí)，可能更傾向于優(yōu)先結(jié)合Sn-1,3位酯鍵發(fā)生水解反應(yīng)。

2.2 酶活劑量對(duì)乳化油脂酶解的影響

添加不同酶活劑量的脂肪酶到乳化油脂中反應(yīng)4 h后生成的脂肪酸含量變化如表3所示。

由表3可知，隨著脂肪酶酶活劑量的增加，各乳化油脂的脂肪酸生成量也越大，脂肪酶酶活劑量達(dá)到200 U時(shí)，各乳化油脂生成的脂肪酸含量均已趨于飽和，故將200 U定為隨后模擬動(dòng)物試驗(yàn)的最終酶活劑量。由表3也可看出：在添加0～260 U脂肪酶時(shí)，棕櫚油、豬油乳化油脂產(chǎn)生的脂肪酸量始終大于大豆油、鴨油和菜籽油乳化油脂(P<0.05)，也更早達(dá)到其峰值(170 U)；縱向分析加酶后產(chǎn)生的脂肪酸總增加量，大豆油、菜籽油、棕櫚油、豬油、鴨油乳化油脂的脂肪酸總增加量分別為1.64、1.54、1.66、1.67、1.67 mmol/L，脂肪酸總增加率分別為546.7%、810.5%、325.5%、347.9%、596.4%，各組間脂肪酸總增加量差異并不大，以菜籽油的為略低，菜籽油脂肪酸組成中大于18碳原子的脂肪酸達(dá)到80%以上[22]，這其實(shí)也與Pouton等[23]研究的中鏈脂肪酸比長(zhǎng)鏈脂肪酸水溶解性更好的結(jié)論一致；另外，由于菜籽油乳化油脂膏的初始脂肪酸量基準(zhǔn)較低(0.19 mmol/L)，其脂肪酸總增加率反而達(dá)到了810.5%，遠(yuǎn)高于其他乳化油脂的。

表3 添加不同酶活劑量脂肪酶時(shí)乳化油脂生成的脂肪酸含量變化

2.3 脂肪酶對(duì)單胃動(dòng)物消化吸收的影響(見表4)

表4 脂肪酶對(duì)乳仔豬干物質(zhì)消化率、能量消化率的影響

由表4可知：當(dāng)脂肪酶添加量為125 g/t(以飼料質(zhì)量計(jì)，下同)時(shí)，脂肪酶對(duì)大豆油的添加量等同于1 mL大豆油添加200 U脂肪酶，此時(shí)干物質(zhì)消化率和能量消化率相比不加酶組分別增長(zhǎng)0.86個(gè)百分點(diǎn)和0.83個(gè)百分點(diǎn)，這在僅添加單酶的基礎(chǔ)上，對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)消化吸收效果可謂非常明顯，也從側(cè)面說明該脂肪酶具有一定的抗胃液特性；當(dāng)脂肪酶添加量為250 g/t時(shí)，消化率相比125 g/t組的略有提升，但并不明顯，添加量繼續(xù)增加則消化率基本不再變化。由于飼料配方原料結(jié)構(gòu)的多樣性，飼料中其他成分也會(huì)含有少量脂肪，故脂肪酶添加量略高于125 g/t或與其他酶，如淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶和半纖維素酶結(jié)合使用，則對(duì)飼料降解的協(xié)同效應(yīng)可能會(huì)更好[24]。

3 結(jié) 論

由于油脂必須先乳化成乳糜顆粒，然后才能在腸道中進(jìn)一步降解吸收，而脂肪酶又主要是在小腸階段與內(nèi)源胰脂肪酶一起發(fā)揮作用的。故本文放棄采用原始油脂，而對(duì)油脂進(jìn)行初步乳化后來測(cè)定脂肪酶對(duì)其降解效果。研究發(fā)現(xiàn)：①添加200 U脂肪酶到4 mL乳化油脂(即1 mL原始油脂)中反應(yīng)4 h后，產(chǎn)生的脂肪酸量即可基本達(dá)到峰值；②添加不同劑量脂肪酶時(shí)，棕櫚油和豬油乳化油脂生成的脂肪酸量始終大于大豆油和鴨油乳化油脂的，而菜籽油乳化油脂的最低，組間差異顯著(P<0.05)，相比不加酶組，加入260 U脂肪酶后，大豆油、菜籽油、棕櫚油、豬油和鴨油乳化油脂的脂肪酸總增加量均大于1.50 mmol/L，但各油脂組間差異不大，脂肪酸總增加率均提高300%以上(脂肪酶加入260 U時(shí))，其中菜籽油提升率可達(dá)到810.5%，加酶后效果顯著;③乳豬料中添加脂肪酶(脂肪酶酶活80 000 U/g)可提高干物質(zhì)消化率和能量消化率，添加量以略高于125 g/t為佳。

本文僅采用1種微生物來源的脂肪酶進(jìn)行試驗(yàn)，而不同脂肪酶的酶活、溫度特性、酸度特性、底物特異性及抗胃蛋白酶特性等各有差別，故本文油脂中脂肪酶添加量?jī)H可作為參考，不同來源脂肪酶劑量可能會(huì)有所浮動(dòng)。另外，不同脂肪酶水解位點(diǎn)也會(huì)有不同，如母乳中胰脂酶和大部分商業(yè)脂肪酶會(huì)優(yōu)先水解作用于甘油三酯的Sn-1位或Sn-3位酯鍵，而豬胰脂肪酶水解甘油三酯時(shí)卻沒有選擇性，故脂肪酶的作用機(jī)理也是下一步探索的方向。