用藥指導(dǎo)魚(yú)類抗菌肽的研究進(jìn)展

文/王玉堂

作者單位：全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站

用藥指導(dǎo)魚(yú)類抗菌肽的研究進(jìn)展

文/王玉堂

在治療動(dòng)物的細(xì)菌性、病毒性等疾病過(guò)程中，某些病原體會(huì)逐漸對(duì)藥物產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性（抗藥性）而無(wú)法有效治療或控制。研發(fā)新型抗生素的周期長(zhǎng)（一般為30年）、難度大、費(fèi)用高，而且因水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度遠(yuǎn)超過(guò)抗生素的研發(fā)速度，且現(xiàn)有的抗生素開(kāi)發(fā)策略多局限于既有的抗生素類別，難以有實(shí)質(zhì)性的突破?？垢腥拘蝿?shì)的嚴(yán)峻性迫切需要尋找出與現(xiàn)有的抗生素機(jī)理完全不同的新型抗菌物質(zhì)。

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)，尤其是抗菌肽對(duì)耐藥致病菌有良好的殺滅或抑制作用，為治療相關(guān)疾病提供了一個(gè)新的途徑?？咕氖菑V泛存在于細(xì)菌、植物、軟體動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物、魚(yú)類、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類小分子多肽，由20個(gè)～60個(gè)氨基酸殘基組成?？咕木哂谢钚詮?qiáng)、功能廣泛、廣譜殺菌作用，在應(yīng)用研究中有重要價(jià)值，這一新領(lǐng)域已引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注。抗菌肽合成的速度非?？?，與以恒定速度合成的肽鍵相比，抗菌肽的生產(chǎn)比IgM快100多倍，因此稱抗菌肽是機(jī)體理想的第一道防線，目前已有多個(gè)魚(yú)類抗菌肽基因不僅被分離出來(lái)，在活體內(nèi)還對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)。

一、魚(yú)類抗菌肽的生化特點(diǎn)和組成

魚(yú)類抗菌肽是魚(yú)體內(nèi)一類小分子蛋白質(zhì)，其組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，分子量大小和氨基酸組成各不相同，但它們具有一定共同的特點(diǎn)，如含有較多的半胱氨酸，形成較保守的α-螺旋結(jié)構(gòu)；含有較多的陽(yáng)離子氨基酸如精氨酸或賴氨酸等而使分子帶正電荷。根據(jù)其生化和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將它們分成若干類型：

第一類：富含某種氨基酸的線性抗菌肽。此種類型的抗菌肽因富含一些堿性氨基酸而帶正電荷，與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用時(shí)可以折疊成有利于穿膜的疏水或雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，能選擇地作用于細(xì)菌外層細(xì)胞膜的某些部分，如帶陽(yáng)離子的磷脂，增大其滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。這類分子還包括來(lái)源于虹鱒血清的salmocidin；八目鰻小腸的HFIAPs（hagfishintestinalantimicrobialpeptides）；分離自泥鰍的misgurin；來(lái)源于雜交斑紋鱸皮膚、鰓和血液肥大細(xì)胞的piscidins以及分離自美洲擬鰈和豹鰨體有粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中BrocalI，F(xiàn)alco A等人從刺泥鰈的皮膚粘液中分離出一種25氨基酸的線性抗菌肽pleurocidin（Ple），具有與其它許多抗菌肽類似的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)鱸魚(yú)的皮膚和鰓可表達(dá)分泌的moronecidin抗菌肽。鱸魚(yú)moronecidin前體有79個(gè)氨基酸殘基，由信號(hào)肽、成熟肽和C片段3部分組成，氨基酸殘基數(shù)分別為22、22和35。經(jīng)圓二色譜分析其結(jié)構(gòu)呈α-螺旋。

第二類：含多個(gè)半胱氨酸分子內(nèi)形成環(huán)狀的抗菌肽類，這類抗菌肽由于含多全半胱氨酸而形成多個(gè)二硫鍵，從而使其二級(jí)結(jié)構(gòu)呈β折疊。這類分子包括來(lái)源于羅非魚(yú)的hepcidin和從克海七鰓鰻的皮膚上分離到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP（lampreycorticostatin-relatedpeptidi）等，其中hepcidin基因大概含有20個(gè)～25個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)部有8個(gè)高度保守的半胱氨酸，形成4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，它有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中有1個(gè)長(zhǎng)為273bp的ORF順序，編碼1個(gè)含有90多個(gè)氨基酸殘基的前多肽原；前多肽原包含3個(gè)區(qū)域，信號(hào)肽、成熟肽和由40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前hepcidin原。羅非魚(yú)hepcidin原類型目前報(bào)道有3種，分別命名為TH1-5、TH2-2和TH2-3，前體肽分別有88、86和91個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量分別為9.5、9.4和9.8ku；三信號(hào)肽裂解位點(diǎn)分別位于第24～25、第22～23和第24～25密碼子上，在共同的保守區(qū)域，都含有8個(gè)半胱氨酸。羅非魚(yú)中的TH2-3和日本鰈魚(yú)的JF2相似，TH2-2和日本的JF1相似，TH1-5和鯛的hepcidin類似；通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)模型表明，在半胱氨基酸部位都形成二硫鍵。從斑馬魚(yú)分離到的β-defensins有3種，分別命名為zfDB1、zfDB2和zfDB3。與哺乳動(dòng)物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6個(gè)半胱氨酸，形成3個(gè)二硫鍵，并形成的模式一致，即第1～5、第2～4和第3～6個(gè)半胱氨酸。結(jié)構(gòu)都呈β折疊，但zfDB1的N端有1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。

第三類：組蛋白樣抗菌肽（histone-likeproteins，HLPs）。這類肽在水生動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)于魚(yú)類中，蝦類、貝類中尚未見(jiàn)報(bào)道。如從鯰、斑紋鱸魚(yú)、銀大馬哈和鮭等的皮膚粘液、鰓、血液和肝臟中分離的parasinI、HLPs和SAM等，氨基酸序列和質(zhì)譜分析表明，它們與組蛋白H2A、H2B和H1非常相似。從大西洋鮭皮膚粘液中分離的SAMP H1（samonantimicrobialpeptideH1）含有30個(gè)氨基酸殘基，中間富含Pro，N端乙酰基化，但對(duì)其抗菌活性沒(méi)有影響；理論上的相對(duì)分子量為2836u。經(jīng)色譜分析，其活性形式比非活性形式分子結(jié)構(gòu)上顯得緊湊和更具剛性。從鮒魚(yú)紅細(xì)胞上分離得到的一種特異蛋白H1與SAMPH1的氨基酸順序有78%的同源性，有3個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，是鮒魚(yú)紅細(xì)胞上一種新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。從鯰魚(yú)受傷皮膚粘液分離得到的parasinI是由H2A組蛋白酶cathepsinD在其N端Ser19-Arg20位置裂解作用后產(chǎn)生的一種抗菌肽。parasinI含有19個(gè)氨基酸殘基，具有廣譜抗菌活性。Jorge等從彩虹鮭魚(yú)皮膚分泌物中分離提取了1種新的抗菌肽OncorhyncinⅡ，指出這種抗菌肽的前17氨基酸殘基與來(lái)自彩虹鮭魚(yú)組蛋白H1的前138～154個(gè)殘基相同，并測(cè)得其分子量為719513Da。從而指出這個(gè)OncorhyncinⅡ抗菌肽是組蛋白H1的C末端69殘基的片段。從鱈體表粘液中分離得到的幾種抗菌肽活性因子，通過(guò)弱陽(yáng)離子的交換色譜法和反相色譜層析技術(shù)，分離出來(lái)3種小肽，通過(guò)N端和C端氨基酸順序分析和質(zhì)譜分析，它們分別為核糖肽類L40（6397Da）、L36A（12340Da）、L35（14215Da）。

第四類：經(jīng)酰胺化、糖基化修飾的抗菌肽。這類肽由核糖體合成后，在高爾基體濃縮、加工時(shí)，在相關(guān)酶的作用下脫掉C端1個(gè)或多個(gè)氨基酸，或再與一些糖基結(jié)合而成有活性的成熟肽。這類肽在蝦類和一些海水魚(yú)類中比常見(jiàn)。如從健康的南美白對(duì)蝦血細(xì)胞和血漿中分離出了幾種抗菌活性因子，通過(guò)酶剪切、Edman降解、質(zhì)譜儀分析等方法以及從血細(xì)胞的cDNA庫(kù)中進(jìn)行cDNA克隆，測(cè)定序列，發(fā)現(xiàn)南美白對(duì)蝦抗菌肽penaeidins具有其中一種肽的N端因形成焦谷氨酸而封閉；C端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它們的N一端富含脯氨酸。而C一端含有6個(gè)半胱氨酸組成的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，使它們的結(jié)構(gòu)有別于其它類群的抗菌肽。還有從鯉體表粘液中分離出的27KD疏水蛋白和從真鯛、鰻鱺皮膚粘液中分離出的分子量分別為65KD、49KD和45KD3種抗菌肽也是經(jīng)糖基化修飾的多肽。Jorge等從彩虹鮭魚(yú)的皮膚中分離出的一種新的具有抗菌功能的核糖肽類，測(cè)得其分子量大小為667616Da，并指出，這種肽與40S的核糖體蛋白S30非常相似。Jorge等還從彩虹鮭魚(yú)的血細(xì)胞中分離出的具有抗菌特性的活性片段，研究得出這種活性片段對(duì)熱敏感，且能被蛋白酶所消化，從而推斷這一活性片段為一種類似蛋白質(zhì)的具有抗菌活性的天然成分。

二、魚(yú)類抗菌肽的基因結(jié)構(gòu)和功能

隨著研究的深入，一些抗菌肽基因被陸續(xù)克隆。2006年，劉碧蓮等根據(jù)GenBank中收錄的魚(yú)類抗菌肽hepcidin的DNA序列設(shè)計(jì)特定的引物，用RTPCR法從鱖魚(yú)肝臟中克隆到hepcidin的cDNA，并構(gòu)建Pmd18-Thepcidin載體進(jìn)行序列測(cè)定和分析，結(jié)果表明，該cDNA長(zhǎng)為381bp，其中第20～277位核基因的開(kāi)放閱讀框（ORP），編碼86個(gè)氨基酸，形成由信號(hào)肽（24個(gè)殘基）、前肽（42個(gè)殘基）和成熟肽（20個(gè)殘基）3部分序列組成的前體肽，與已報(bào)道的其它鱸形目魚(yú)類hepcidin相比，核工業(yè)苷酸序列的同源性為72.2%～92.0%，所推導(dǎo)的成熟肽與包括人類在內(nèi)的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50%～86.4%，Park等經(jīng)質(zhì)譜和化學(xué)分析方法研究證實(shí)，8個(gè)保守的cys殘基形成4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵可使β-折疊結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。由CampagnaS，SaintN等人2007年從條紋紋鱸的肥大細(xì)胞里分離出Piscidin抗菌肽，他們通過(guò)采用脂分子雙層的結(jié)構(gòu)分析和電生理實(shí)驗(yàn)研究了這個(gè)包括22個(gè)氨基酸殘基的陽(yáng)離子肽的抗菌機(jī)制，圓二色性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)譜Piscidin在水中是無(wú)組織的，但卻有1個(gè)高度緊密的alpha-helix，8個(gè)～17個(gè)氨基酸殘基在微胞環(huán)境中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和親水區(qū)域，這個(gè)分子有兩親性的特性。這種結(jié)構(gòu)和那些能使細(xì)菌細(xì)胞通透性增強(qiáng)的陽(yáng)離子肽的結(jié)構(gòu)非常類似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二維的雙分子層多通道實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同的濃度下會(huì)出現(xiàn)1個(gè)Ⅰ-Ⅴ曲線，而且非常明確的表明肽分子能使細(xì)菌細(xì)胞膜通透。這個(gè)孔形成的活力通過(guò)單通道實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了。離子通道的特性更加明確的表明了Piscidin通過(guò)螺旋的孔道結(jié)構(gòu)更能使細(xì)菌透化，而不是通過(guò)“桶-桶板（barrel-stave）模型”。A.Falco等人從鮭科魚(yú)類的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取了虹鱒β-防御素類抗菌肽的順序稱為c.mykissβdefensin-1（omBD-1），signalP3.0program分析發(fā)現(xiàn)，在omBD-1的19位后有1個(gè)假定的切割位點(diǎn)，切割位點(diǎn)后有1個(gè)含有41個(gè)氨基酸的前體肽和β-防御素共有的順序一樣，也有6個(gè)保守的cys殘基，它和從其它魚(yú)類中分離到的β-防御素類抗菌肽有85.7%的同源性，同人類有34.9%的同源性；omBD-1有1個(gè)+2價(jià)的陽(yáng)離子，等電點(diǎn)為8，這有助于omBD-1與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合。

近年來(lái)的研究重點(diǎn)在于向建立水生動(dòng)物免疫特異性cDNA文庫(kù)和表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）方面轉(zhuǎn)移，這將有助于發(fā)現(xiàn)更多的抗菌肽基因。Nam等地日本鰈魚(yú)類的cDNA和ESTs文庫(kù)，從中鑒定了許多免疫相關(guān)基因，如Mx蛋白基因、補(bǔ)體基因、干擾素調(diào)節(jié)基因等；從2種白對(duì)蝦的ESTs中發(fā)現(xiàn)了44個(gè)免疫功能相關(guān)基因，全部免疫ESTs中，屬于抗菌肽的ESTs數(shù)量占總數(shù)量的60%以上。可見(jiàn)抗菌肽的種類數(shù)目非常大，在水生動(dòng)物中的分布也十分廣泛。

三、魚(yú)類抗菌肽的生物學(xué)活性與功能

魚(yú)類抗菌肽，是魚(yú)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)魚(yú)體受到損傷或受到病原侵襲時(shí)，能迅速產(chǎn)生抗菌肽以防御或殺傷病原微生物的入侵；其合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速而靈活的特點(diǎn)，是其它大分子蛋白質(zhì)（如抗體）等和免疫細(xì)胞所不具備的。細(xì)菌和病毒對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的影響越來(lái)越嚴(yán)重，而且沒(méi)有一種有效的治療藥物來(lái)抑制病原體的感染，抗菌肽的鑒定和特點(diǎn)日益受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)界的重視。編碼Ple前肽原的基因組序列已經(jīng)從刺泥鰈中分離出來(lái)，在無(wú)毒啟動(dòng)子的控制下成功克隆到載體上，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)，生物活性的Ple轉(zhuǎn)化到魚(yú)體細(xì)胞株上，并持續(xù)增長(zhǎng)了2年多。對(duì)于Ple處理、加工、成熟、分泌（通過(guò)使用綠熒光蛋白融合技術(shù)）的研究，分泌的重組Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性（在未經(jīng)過(guò)濃縮的細(xì)胞懸液中發(fā)現(xiàn)），在此之前沒(méi)有別的重組Ple抗菌肽或魚(yú)體抗菌肽表達(dá)到這種程度。這樣一個(gè)重組Ple抗菌肽或其它相關(guān)抗菌肽的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)提高發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物的機(jī)會(huì)。張寧應(yīng)用分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段，通過(guò)化學(xué)合成從海馬體內(nèi)得到了足量的抗菌肽HKPLP。HKPLP對(duì)10種人和魚(yú)類致病或條件致病菌株的活性實(shí)驗(yàn)表明，HKPLP對(duì)大多數(shù)的Gram〈+〉菌和Gram〈-〉菌都敏感，其最小抑制濃度（MIC）大多不超過(guò)16ug/ml，對(duì)白色念珠菌的MIC為32ug/ml，對(duì)銅綠色假單胞菌、副溶血弧菌和鰻弧菌等3株魚(yú)類致病菌的作用較弱。盡管HKPLP對(duì)人紅細(xì)胞有一定的溶血活性，但對(duì)大多數(shù)測(cè)試菌株有效抑制濃度下，溶血活性不超過(guò)20%。此外還發(fā)現(xiàn)HKPLP對(duì)Hela、U251和C6等幾種致癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，IC〈50〉為18ug/ml～40ug/ml，且該作用發(fā)生迅速，可能與海馬的抗腫瘤活性有關(guān)。

PanCY.ChanJY等人從鱸魚(yú)鰓中分離得到的Epinecidin-1抗菌肽。鱸魚(yú)Epinecidin-1的多克隆免疫組織化學(xué)分析表明，這種抗菌肽和它的抗體局限分布于鰓和小腸內(nèi)。鱸魚(yú)的2個(gè)合成肽g-Ple22-51和g-Ple22-42對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌活性。此外，在鱸魚(yú)和羅非魚(yú)體內(nèi)注射弧菌屬vulnificus后，抗菌肽通過(guò)處理能夠顯著增加魚(yú)的存活量，這些結(jié)果對(duì)于研制魚(yú)類病原感染的預(yù)防劑和治療劑提供了一定的依據(jù)，特別是對(duì)魚(yú)類的細(xì)菌感染中的免疫缺陷起到了改善作用。生長(zhǎng)于極地海洋環(huán)境的魚(yú)類，其血清具有高水平的抗凍蛋白（AFP）或抗凍糖蛋白（AFGP），能夠通過(guò)阻止冰晶的形成而降低結(jié)冰溫度，它成為第二個(gè)常用的外源基因，通過(guò)轉(zhuǎn)AFP基因以提高受體魚(yú)的抗凍能力。在鰈形目魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)了分子量較大的抗菌肽，它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征，均富含丙氨酸和α-螺旋結(jié)構(gòu)。此分子的發(fā)現(xiàn)和對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，將可促進(jìn)轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因魚(yú)的培育進(jìn)程。

四、抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用前景

（一）研究開(kāi)發(fā)魚(yú)類抗菌肽的迫切性

近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和城市污水的大量排放，全球性水環(huán)境污染日益嚴(yán)重，水環(huán)境中的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物富營(yíng)養(yǎng)化、重金屬離子和某些難發(fā)降解的農(nóng)藥等含量已超出水體的自凈能力；同時(shí)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷升高，養(yǎng)殖動(dòng)物的排泄物和殘餌等積聚量也日益增加，進(jìn)一步增加了水環(huán)境的污染程度，致使水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害頻發(fā)，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的發(fā)生，在防治水生動(dòng)物細(xì)菌性和病毒性疾病過(guò)程中大量使用抗生素類藥物，不僅破壞了水環(huán)境的微平衡，還增強(qiáng)了某些病原微生物的耐藥性，已近無(wú)法有效控制疾病的程度，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，養(yǎng)殖水產(chǎn)品的藥物殘留超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生，不僅影響到消費(fèi)者健康，也制約了產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力的提升。

因此，加快對(duì)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種免疫防御的基礎(chǔ)性研究，調(diào)動(dòng)和開(kāi)發(fā)養(yǎng)殖水生動(dòng)物自身的免疫能力，是開(kāi)展健康養(yǎng)殖，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略之一。水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽的研究加深了人們對(duì)水生動(dòng)物免疫防御機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為科學(xué)有效防治魚(yú)病開(kāi)辟了一條有效途徑。同時(shí)隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，有可能通過(guò)轉(zhuǎn)抗凍基因等獲得抗病新品種。

（二）魚(yú)類抗菌肽的應(yīng)用前景

與抗菌素的單一作用位點(diǎn)不同中，抗菌肽是作用于細(xì)菌的整個(gè)細(xì)胞膜，使膜去極化或形成“孔洞”，造成細(xì)胞內(nèi)含物外流或肽分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與DNA、RNA等靶標(biāo)作用，進(jìn)而殺死細(xì)菌。除高效殺菌作用外，抗菌肽還具有明顯地殺傷真菌、病毒和原蟲(chóng)的作用，并能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而不破壞正常細(xì)胞，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。由于抗菌肽本身是來(lái)源于養(yǎng)殖動(dòng)物自身的一種小分子蛋白，動(dòng)物對(duì)其的排斥反應(yīng)很低，而且殺菌作用發(fā)揮到一定程度后，動(dòng)物體內(nèi)的很多蛋白酶就把抗菌肽降解了，檢測(cè)不到殘留物質(zhì)，對(duì)環(huán)境沒(méi)有任何污染，是一種無(wú)毒、無(wú)害、綠色、環(huán)保的產(chǎn)品。另外，抗菌肽還具有不易出現(xiàn)耐藥性突變、分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、作用迅速等特點(diǎn)，它在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，對(duì)提高魚(yú)體免疫力，減少甚至杜絕抗生素類藥物的使用，維持魚(yú)體健康，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

（三）抗菌肽的制備方法

一般而言，抗菌肽可以通過(guò)以下3種途徑獲得：一是從生物體內(nèi)直接提取純化；二是化學(xué)人工合成；三是采用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗菌肽基因工程株。但由于抗菌肽為體內(nèi)誘導(dǎo)合成，生物體內(nèi)的含量較低，從生物體中直接大量地提取難度較大，對(duì)技術(shù)和成本要求較高，難以規(guī)?；a(chǎn)。而化學(xué)合成的方法同樣存在成本較高的問(wèn)題。一般小于10個(gè)氨基酸殘基的多肽的合成較為經(jīng)濟(jì)，10個(gè)氨基酸殘基以上的多肽合成會(huì)則很昂貴，限制了應(yīng)用。因此，利用基因工程方法來(lái)生產(chǎn)抗菌肽是一條有效途徑。

有關(guān)抗菌肽基因的表達(dá)研究，最初是在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行，但由于抗菌肽對(duì)原核細(xì)胞有一定的毒性，因此，抗菌肽基因只能以融合蛋白形式在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。近年來(lái)，以啤酒酵母、畢赤酵母、昆蟲(chóng)等為基因工程宿主進(jìn)行表達(dá)、分離、純化及應(yīng)用的研究引起了專家學(xué)者的重視，為抗菌肽的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

（四）抗菌肽的應(yīng)用效果

目前已有越來(lái)越多的抗菌肽被克隆出來(lái)，品種涉及到鯰魚(yú)、鮭魚(yú)、羅非魚(yú)、比目魚(yú)、斑馬魚(yú)等多種魚(yú)類。從已有的報(bào)道的序列來(lái)分析，它們的組成與結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，且沒(méi)有很高的同源性，但也存在著一些共同特征，如含有較多的精氨酸或賴氨酸而使分子帶正電荷；含有較多的疏水氨基酸?？墒狗肿诱郫B成疏水或雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)等。

體外研究表明，許多抗菌肽對(duì)魚(yú)類特異性的甚至其他動(dòng)物的病原微生物都具有殺傷活性，其最小抑菌濃度（MIC）多在毫摩爾水平，如鯰魚(yú)和泥鰍抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的MIC為0.5mmol/L～2mmol/L之間；鱸魚(yú)的抗菌肽對(duì)殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等魚(yú)類致病菌的MIC甚至低至1.2mmol/ L；此外，虹鱒和鱸魚(yú)的抗菌肽對(duì)某些寄生蟲(chóng)也具有致死效力，但其殺傷作用需要較高的濃度，且其活性主要針對(duì)滋養(yǎng)體時(shí)期。

目前，國(guó)內(nèi)作為飼料添加劑使用的抗菌肽主要是蠶抗菌肽AD——酵母制劑，大多數(shù)試驗(yàn)也是圍繞這種抗菌肽進(jìn)行的。黃永彤等發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)雞有促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力的作用，與中草藥、抗生素相比，在出欄率、平均個(gè)體重量及飼料利用率等方面均無(wú)顯著差異，在出欄前3天停止投喂，抽檢無(wú)殘留。王廣軍等（2005）研究了抗菌蛋白在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果，結(jié)果表明，在飼料中添加抗菌蛋白，無(wú)論是日生長(zhǎng)率、相對(duì)增重、飼料系數(shù)及成活率、抗病能力方面均有顯著提高。此外，因抗菌肽能有效殺滅霉腐微生物，在機(jī)體內(nèi)還可以被蛋白酶降解，雙重安全的保證使得抗菌肽還可以在飼料工業(yè)中作為防腐劑使用。

五、今后的研究重點(diǎn)

由于抗菌肽替代抗生素的研究是近幾年才發(fā)展起來(lái)的，雖然取得了一定進(jìn)展，但還處于探索階段，距離技術(shù)成熟、大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用到動(dòng)物養(yǎng)殖中還有很多需要解決的問(wèn)題。一是抗菌肽的種類很多，哪些種類可作為飼料添加劑使用時(shí)效果好，并且比較經(jīng)濟(jì)；二是不同種類的抗菌肽之間的相互作用情況；三是抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)的含量較少，天然資源匱乏，化學(xué)合成的成本太高，目前還無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)；需要從基因工程技術(shù)方法方面研究如何大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽問(wèn)題，或通過(guò)日糧因素調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)；四是抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)容易被蛋白酶水解，需用脂質(zhì)包被或?qū)ζ溥M(jìn)行化學(xué)修飾保護(hù)，這需要對(duì)其釋放機(jī)制、受體結(jié)合、降解活性及其類似物的結(jié)構(gòu)與活性等進(jìn)行研究；五是目前人們對(duì)抗菌肽作為飼料添加劑真正在實(shí)際生產(chǎn)方面的試驗(yàn)還較少，其效果及是否有副作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

作者單位：全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站