不同濃度、作用時間白花蛇舌草注射液對MG-63細(xì)胞凋亡效果*

謝克恭唐毓金黃煜朗黃可陸路林佳杰盧賢哲

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不同濃度、作用時間白花蛇舌草注射液對MG-63細(xì)胞凋亡效果*

謝克恭①唐毓金①黃煜朗①黃可①陸路①林佳杰①盧賢哲①

【摘要】目的：探討白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法：采用一定濃度的乙醇提取白花蛇舌草有效成分，將其配制成50、100、200、400 μL/mL 4種不同濃度的白花蛇舌草注射液，并注入到體外培養(yǎng)的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的培養(yǎng)液中。采用MTT法檢測不同濃度白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞作用12、24、48 h后的細(xì)胞增殖抑制率，并采用RT-PCR半定量檢測凋亡相關(guān)基因Bax的mRNA表達(dá)情況。同時擬用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：MTT法檢測結(jié)果顯示，隨著白花蛇舌草注射液濃度和作用時間的不斷增加，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率均明顯增大；當(dāng)白花蛇舌草注射液濃度達(dá)100 μL/mL時，隨著作用時間延長，Bax基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測顯示，經(jīng)白花蛇舌草注射液處理后，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡率隨白花蛇舌草注射液濃度的增加而不斷升高。結(jié)論：白花蛇舌草注射液通過上調(diào)Bax基因表達(dá)能誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡，且隨著白花蛇舌草注射液濃度增加，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡率亦不斷增加。

【關(guān)鍵詞】白花蛇舌草注射液； MG-63細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

①右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣西 右江 533000

First-author’s address：Youjiang Medical College for Nationalities Affiliated Hospital，Youjiang 533000，China

在青少年中，骨肉瘤屬于較為常見的惡性骨腫瘤，在惡性腫瘤中約占20％，傳統(tǒng)治療方法主要包括新輔助化療、腫瘤切除或輔以化療[1]?；加泄侨饬龌颊?，其5年生存率可達(dá)70％～80％，但骨肉瘤仍屬于致殘率、病死率較高的一種惡性腫瘤，對人們的生命健康造成嚴(yán)重的威脅[2]。采用中藥輔助治療法，具有前景好、價格低廉、不良反應(yīng)少，藥理作用廣泛等優(yōu)點。而中藥白花蛇舌草是一種茜草科耳草屬植物，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，白花蛇舌草具有清熱解毒、活血散結(jié)、利水消腫的功效[3-5]。同時現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白花蛇舌草主要含有機(jī)酸類、黃酮類、多糖類等成分，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及增強免疫力等作用。目前，國外對白花蛇舌草方面的研究很少，而國內(nèi)相對較多。據(jù)文獻(xiàn)[6]表明，白花蛇舌草能對腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡、體外抑制等作用。本研究通過體外培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，將不同濃度（50、100、200、400μL/mL）白花蛇舌草注射液在不同時間（12、24、48 h）作用于該細(xì)胞，采用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測其對MG-63細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率，現(xiàn)將報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 白花蛇舌草注射液購自安徽鳳陽科苑藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字號Z34020595，批號120601）；MTT、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；人骨肉瘤MG-63細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實驗中心惠贈，來自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑 胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；PBS（1×）、胰蛋白酶（1∶250）購自索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、15 mL離心管、96孔板（Corning公司）；TRIzol試劑（Invitrogen公司）；引物合成由大連寶生物工程有限公司完成；逆轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa公司）2×Taq PCR MasterMix（KT201-01）MarkerI、SYBR試劑（TianGen公司）；8聯(lián)管（Axygen公司）。

1.3 實驗儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱MDF-U72V、MCO-18AIC（日本SANYO公司）；生物安全柜BHC-1300ⅡA/83（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；電熱恒溫水槽DK-8D型（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；倒置顯微鏡（Leica型號DMIL），酶標(biāo)儀（Nultiskan MK3 Thermo），PCR儀（BIO-RAD）；水浴箱；搖床。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人骨肉瘤MG-63細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入10％（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5 mL，置于5％ CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.4.2 MTT法檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，并用0.25％胰酶消化，消化后加入培養(yǎng)基（DMEM）5 mL并吹打成混懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，取150 μL（5×103個）接種于96孔板。采用一定濃度的乙醇提取白花蛇舌草有效成分，將其配制成濃度為50、100、200、400 μL/mL 4種不同的白花蛇舌草注射液，現(xiàn)配現(xiàn)用。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度含藥液，并設(shè)立空白對照組（僅加入相同的培養(yǎng)基），每組5個復(fù)孔[7-9]。培養(yǎng)24 h后，加入20 μL的5 mg/mL MTT，再培養(yǎng)4 h后棄去含藥液，加入150 μL DMSO，37 ℃恒溫?fù)u床震蕩10 min后，在酶標(biāo)儀上492 nm波長測定吸光度（A）值，取平均值，并計算細(xì)胞抑制率。計算公式：細(xì)胞增殖抑制率＝（對照組A值-藥物組A值）/對照組A值×100％。

1.4.3 Bax基因表達(dá)

1.4.3.1 提取總RNA 取對數(shù)生長期細(xì)胞，并調(diào)整為1×105個/mL，接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁后，加入100 μL/mL含藥培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)時間分別為12、24、48 h，根據(jù)Trizol提取試劑說明書提取總RNA。采用紫外分光光度計測量總RNA濃度，取A260/A280在1.80～2.20用于RT-PCR。

1.4.3.2 cDNA合成 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。

1.4.3.3 PCR檢測 25.0 μL反映體系包括SYBR Permix Ex TaqⅡ 12.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。將25.0 μL設(shè)5復(fù)孔，并加入8聯(lián)管中，采用PCR儀行擴(kuò)增，95 ℃變性30 s，95 ℃ PCR反應(yīng)50 s、63 ℃退火30 s，共計40個循環(huán)的PCR反應(yīng)，重復(fù)實驗3次，反應(yīng)結(jié)束后，計算2-△△Ct值[10-12]。具體見表1。

表1　Bax基因PCR反應(yīng)2-△△Ct值

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)為5×106/mL的MG-63細(xì)胞，分別接種于4個50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后換液?？瞻讓φ战M加入4 mL新鮮培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的白花蛇舌草注射液（50、100、200、400 μL/mL）。48 h后，均加入0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，并采用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次（離心5 min，2000 r/min），收集細(xì)胞2×105個細(xì)胞后，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μL的Annexin-V-FITC，均勻混合后，加入5 μL碘化丙啶（PI），均勻混合后，室溫避光反應(yīng)10 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 本次統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（％）表示，比較采用 χ2檢驗或確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT法檢測結(jié)果顯示：白花蛇舌草注射液對MG-63細(xì)胞的抑制作用呈依賴關(guān)系，當(dāng)其濃度200 μL/mL時，作用24 h后，大部分細(xì)胞脫落、變圓、死亡。當(dāng)濃度為50 μL/mL時，抑制作用不明顯（P＞0.05），而濃度為100 μL/mL時，具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。在倒置顯微鏡下觀察濃度為100 μL/mL白花蛇舌草注射液對MG-63細(xì)胞不同作用時間的細(xì)胞形態(tài)，空白對照組細(xì)胞狹長、形態(tài)多樣，緊密地貼壁生長，實驗組（12、24、48 h）細(xì)胞隨著作用時間延長，細(xì)胞逐漸皺縮且細(xì)胞間間隔變大，增殖被抑制，見表2。

表2　不同濃度的白花蛇蛇注射液對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率（±s）　％

表2　不同濃度的白花蛇蛇注射液對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率（±s）?。?/p>

組別　　孔數(shù)　　作用時間12 h　24 h　48 h對照組　5　-　-　-50 μL/mL　 5　 2.83±2.24 13.41±2.18 30.82±3.65 100 μL/mL　 5　 22.27±1.56 43.36±2.88 66.42±2.60 200 μL/mL　 5　 45.32±2.14　 -　-400 μL/mL　 5　-　-　-

2.2 Bax基因表達(dá) PCR檢測結(jié)果顯示，取100 μL/mL白花蛇舌草注射液分別作用于MG-63細(xì)胞12、24、48 h后，Bax基因表達(dá)水平分別為（5.370±0.386）、（7.750±0.293）、（16.950±0.331），均明顯高于空白對照組的（1.00±0.00），組間數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈時間依賴性，提示白花蛇舌草注射液抑制細(xì)胞增殖可能通過上調(diào)Bax基因表達(dá)而實現(xiàn)的。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 將分別與50、100、200、400 μL/mL白花蛇舌草注射液作用48 h 的MG-63細(xì)胞用Annexin-V-FITC和碘化丙啶雙染后，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行分析。結(jié)果實驗組細(xì)胞凋亡率分別為17.71％、19.16％、23.42％、31.25％，與空白對照組的0.61％、0.45％、0.33％、0.17％比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

細(xì)胞凋亡是在凋亡信號作用下，由基因調(diào)控細(xì)胞主動死亡的過程，其形態(tài)主要表現(xiàn)為染色質(zhì)凝聚邊集、形成凋亡小體及細(xì)胞固縮[13-15]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，采用藥物治療腫瘤，主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)治療的目的。Bax基因?qū)儆贐cl-2基因家族中的一種促進(jìn)基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，且能表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，其抗腫瘤機(jī)制是通過改變線粒體膜通透性，使細(xì)胞中的小分子物質(zhì)及色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，從而激活Caspase-3，導(dǎo)致與DNA修復(fù)及細(xì)胞周期等相關(guān)蛋白失活而實現(xiàn)細(xì)胞凋亡[16-18]。若Bax基因過度表達(dá)，則會形成Bax-Bax二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2基因表達(dá)增高，則會形成Bax-Bcl-2二聚體，將會使細(xì)胞凋亡被抑制。因此，從一定程度上來看，Bax基因與Bcl-2基因的比例將決定細(xì)胞是否凋亡[19-21]。

白花蛇舌草是一種茜草科耳草屬植物，具有清熱解毒、利水消腫的功效。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草的主要成分包括有機(jī)酸類、黃酮類、多糖類等成分，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及增強免疫力的作用[22-23]。白花蛇舌草注射液為中藥白花蛇舌草提取支撐的單味藥滅菌水溶液。本研究發(fā)現(xiàn)濃度為100 μL/mL的白花蛇舌草注射液作用12 h后，MG-63細(xì)胞逐漸縮小、核深染，隨著作用時間延長，細(xì)胞邊緣、懸浮死亡，與蔣章等[24]學(xué)者研究結(jié)果一致。PCE檢測結(jié)果顯示，促凋亡的Bax基因高表達(dá)，表明白花蛇舌草注射液抑制細(xì)胞增殖抑制可能通過上調(diào)Bax基因表達(dá)而實現(xiàn)的。

抗癌藥物本身的細(xì)胞毒副作用是一個較為棘手的問題。因此，能尋找到抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且毒副作用小的天然藥物具有非常重要的意義[25]。本研究結(jié)果肯定了白花蛇舌草對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的體外抑制和誘導(dǎo)作用，但其發(fā)揮作用的組成成分及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究證實。

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Effect of Different Concentration and Action Time Spreading Hedyotis Herb Injection Induced Mg-63 Cells Apoptosis

/XIE Ke-gong，TANG Yu-jin，HUANG Yu-lang，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（03）：001-004

【Abstract】Objective：To explore the effect of spreading hedyotis herb injection of bone sarcoma MG-63 cells apoptosis induction.Method：With a certain concentration of ethanol extraction of spreading hedyotis herb active ingredients，the mixture concentration of 50，100，200，400 μL/mL four different spreading hedyotis herb injection. And its injection into different concentrations of bone sarcoma MG-63 cells in vitro culture. Determined by MTT method was used to detect the different concentration of spreading hedyotis herb injection effect on bone sarcoma MG-63 cells，12，24 and 48 h after cell proliferation inhibition rate，and USES the quantitative RT-PCR detection of apoptosis related gene Bax mRNA expression. Cells and decodes the （FCM） spreading hedyotis herb injection of bone sarcoma with MG-63 cell apoptosis rate.Result：Determined by MTT method to detect the result shows that，with the spreading hedyotis herb injection concentration and action time，increasing bone sarcoma with MG-63 cell proliferation inhibition rate were significantly increased，when the concentration of spreading hedyotis herb injection up to 100 μL/mL，with the duration extension，Bax gene expression was significantly higher （P＜0.05）. Flow cytometry instrument detection showed that after spreading hedyotis herb injection treatment，bone sarcoma with MG-63 cells apoptosis rate with the increase of the concentration of spreading hedyotis herb injection and rising.Conclusion：Spreading hedyotis herb injection via increased Bax gene expression can induce bone sarcoma with MG-63 cell apoptosis，and with the increase of concentration of spreading hedyotis herb injection，bone sarcoma with MG-63 cells apoptosis rate also increased.

【Key words】Spreading hedyotis herb injection； MG-63 cells； Cell apoptosis

收稿日期：（2015-06-23） （本文編輯：蔡元元）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.03.001

通信作者：唐毓金

*基金項目：廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心開放基金課題（KFJJ2011-01）