用于人患布魯菌病PCR診斷方法的研究進(jìn)展*

姜海蓉 綜述，崔玉花，彭方毅審校

(1.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科　400036；2.重慶市墊江縣中醫(yī)院　408300)

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·綜述·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.040

用于人患布魯菌病PCR診斷方法的研究進(jìn)展*

姜海蓉1綜述，崔玉花1，彭方毅2△審校

(1.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科400036；2.重慶市墊江縣中醫(yī)院408300)

布魯菌??；PCR；診斷；分型

布魯菌病是由胞內(nèi)寄生菌布魯桿菌侵染人體后產(chǎn)生的一種傳染-變態(tài)反應(yīng)性疾病。家畜是首要宿主，并可通過生殖黏膜，呼吸、消化道黏膜，蚊蟲叮咬等傳播。家畜患布魯菌病后會有不孕不育、流產(chǎn)、胎盤滯留、產(chǎn)奶量下降等臨床癥狀。而當(dāng)人攝入布魯菌污染的鮮奶，處理患畜生鮮肉，為患畜接生，處理流產(chǎn)胎仔時，被感染的風(fēng)險(xiǎn)會很大。人感染布魯菌后的臨床癥狀主要是發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉痙攣、睪丸發(fā)炎等，甚至還會導(dǎo)致不孕不育[1]。人患布魯菌病有急性期和慢性期之分。當(dāng)急性患者轉(zhuǎn)為慢性時會反復(fù)發(fā)作長期不愈，少數(shù)患者會導(dǎo)致死亡。

布魯菌是一種革蘭陰性菌，屬于α-變形菌群，從1886年Bruce發(fā)現(xiàn)布魯菌至今已有約100多年的歷史。目前，布魯菌有6個經(jīng)典種：牛種、羊種、豬種、犬種、綿羊附睪種、沙林鼠種，兩種新發(fā)現(xiàn)的種：田鼠種和B.inopinata，還有兩種從海洋哺乳動物中分離的布魯菌[2]。而羊種、牛種、豬種布魯菌是公認(rèn)的使人體致病的3種布魯菌，也有犬種布魯菌感染人的案例，但這種情況較少發(fā)生。

雖然細(xì)菌分離培養(yǎng)是診斷布魯菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但這一方法要接觸活菌進(jìn)行研究分析，對研究人員也具有潛在的感染隱患，而且還有實(shí)驗(yàn)周期長，對實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)及實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高等缺點(diǎn)，使其不能被推廣使用。因此安全有效、簡單快速的PCR檢測方法用于布魯菌病的檢測更受人們期待?？茖W(xué)家們也已經(jīng)報(bào)道了至少400多篇關(guān)于將PCR方法用于檢測布魯菌的文章[3]。而利用血液、組織標(biāo)本、體液等各種臨床樣品進(jìn)行PCR檢測的技術(shù)方法也已經(jīng)在世界上各實(shí)驗(yàn)室中開展研究，并取得了一定的成果。應(yīng)用PCR方法檢測各組織標(biāo)本中的布魯菌前，第一步是DNA的提取，提得的DNA質(zhì)量是影響PCR檢測成功與否的關(guān)鍵步驟。在本綜述中，討論了布魯菌DNA的提取方法和用于檢測的各種PCR技術(shù)。

1　布魯菌DNA的提取

目前細(xì)菌DNA的提取方法已經(jīng)有標(biāo)準(zhǔn)化提取步驟，如氯仿抽提法(蛋白酶K法)、碘化鈉(NaI)提取法。也有應(yīng)用于純菌、組織、血樣等臨床標(biāo)品DNA提取的商業(yè)化試劑盒，如QIAGEN的QIAamp DNA blood mini kit、天根的血液/組織DNA提取試劑盒、Progama的Blood gDNA Miniprep System等。

Lusk等[4]曾經(jīng)用6種細(xì)菌DNA提取試劑盒提取不同奶制品樣品中的布魯菌DNA，并用實(shí)時熒光PCR來對比不同試劑盒提取的DNA質(zhì)量。結(jié)果顯示，QIAGEN的液體中DNA提取步驟對布魯菌的提取效果最好，而PrepSEQ和MagMAX kit的布魯菌DNA提取效果最差。Piranfar等[5]也曾經(jīng)用4種不同的DNA提取試劑盒提取純菌和血樣中的布魯菌DNA，并證明MagNA Pure LC對純菌及血樣中的DNA提取更靈敏。這些研究結(jié)果表明，不同的DNA提取試劑盒提取的DNA產(chǎn)物的質(zhì)量是有差異的。

血液通常是人患布魯菌病的PCR診斷所利用的臨床標(biāo)本，而血樣DNA提取產(chǎn)物中可能存在的乙二胺四乙酸(EDTA)、血紅素、核糖核酸酶、肝素等成分都會抑制PCR反應(yīng)[6]。而在提取DNA之前，將血液用水或裂解緩沖液反復(fù)清洗幾遍直到去除所有血紅蛋白，會大大增加PCR檢測的靈敏度[3]。所以在提取血樣DNA之前，待檢血樣的預(yù)處理及合適的提取方法決定了后續(xù)PCR檢測樣品的靈敏性。

2　單引物PCR技術(shù)

至今，已有多篇報(bào)道將單引物PCR技術(shù)應(yīng)用于人類布魯菌病的診斷。有研究稱，PCR檢測方法比細(xì)菌分離培養(yǎng)方法更靈敏，而且可以用于初次感染的診斷，也可用于復(fù)發(fā)的早期診斷。用于檢測布魯菌的單引物PCR技術(shù)針對的目的基因有表達(dá)外膜蛋白的布魯菌外膜蛋白31基因(BCSP31)，且該引物(B4/B5)已被多次證明具有高特異性[7]，并沿用至今。還有一些其他的屬特異引物如omp2(JPF/JPR)、per(bruc1/bruc5)、插入序列IS711等[8]。

不同引物之間的靈敏度和特異度都有很大差異，Piranfar等[5]用B4/B5、插入序列IS711的引物ISP1/ISP2、引物F4-R2和JPF/JPR檢測人血樣中的布魯菌，并對比這4對針對不同目的基因的引物靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3對引物B4/B5、ISP1/ISP2、F4/R2的檢測最低限分別為100、200、800 CFU/mL，引物JPF/JPR不能從血液中檢測出布魯菌。目的基因BCSP31的引物B4/B5靈敏性最好。也很多研究報(bào)道對比過B4/B5、F4/R5和JPF/JPR這3對引物的PCR方法。多次實(shí)驗(yàn)證明，這些常用的PCR引物在檢測人體中的布魯菌基因組DNA時的擴(kuò)增靈敏度是存在差異的。質(zhì)量好的引物除了特異性好，不形成引物二聚體以外，擴(kuò)增靈敏度高也是必要條件，所以在建立PCR檢測方法時，對其特異性引物的要求就比較高。

3　多重PCR技術(shù)

多重PCR方法是一種在同一管中可以在檢測布魯菌的同時區(qū)分不同的種型的技術(shù)，也可用于同時檢測不同的病原體。它的優(yōu)點(diǎn)是省時、高效，大大降低了試劑的用量和成本。多重PCR方法是由傳統(tǒng)PCR方法演變而來的，可根據(jù)布魯菌基因中不同種之間基因多態(tài)性而選擇出種型特異性基因靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一系列引物，從而以擴(kuò)增片段的大小區(qū)分不同的種型。也可根據(jù)布魯菌不同目的基因，通過目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的組合來判斷布魯菌不同的種型。

布魯菌中插入序列IS711是一種多拷貝基因，在基因中的位置也十分穩(wěn)定。不同種布魯菌中IS711的拷貝數(shù)不同,一般是6、7個拷貝，如羊種、牛種、犬種，綿羊種拷貝數(shù)較多，為38個[9]。有研究人員根據(jù)插入序列IS711在布魯菌不同種之間的特異性,設(shè)計(jì)出特異性引物，即以1S711基因特異上游序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)公共上游引物，以其基因下游種特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性下游引物,然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小來區(qū)分不同種和生物型。這一多重PCR檢測方法為AMOS-PCR，能夠區(qū)分牛種1、2、4型，羊種1、2、3型，豬種1型及綿羊附睪種。也有研究者將多重PCR應(yīng)用于幾種病原菌的同時檢測，Batra等[10]建立了一種在同一反應(yīng)體系中能夠檢測出炭疽桿菌、鼠疫菌、類鼻疽伯克菌和布魯菌4種病原菌的多重PCR方法，大大減少了人力、物力的消耗。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，研究者們不斷地追求更簡單高效的PCR檢測方法，Bruce ladder就是AMOS PCR的一種延伸，它可以混合引物單管區(qū)分出布魯菌6個經(jīng)典的亞種，海洋種布魯菌及疫苗株S19、RB51和Rev1，能夠高效低耗地進(jìn)行分型鑒定。

2013年，Sanjuan-Jimenez等[11]報(bào)道過一種應(yīng)用多種不同引物組合同時檢測出結(jié)合分枝桿菌和布魯菌的方法，應(yīng)用的目的基因是布魯菌BCSP31和IS711及結(jié)核分枝桿菌的senX3-regx3和IS6110，組成3對不同的引物。也有一些其他的報(bào)道應(yīng)用該方法同時檢測布魯菌及結(jié)核分枝桿菌，利用的靶基因分別是布魯菌BCSP31、IS711、omp2a和結(jié)核分枝桿菌的regx3、cfp31及IS6110[12-13]。諸多的此類報(bào)道證明，多重PCR技術(shù)因其省時、省力、低成本等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于布魯菌及結(jié)核分枝桿菌的鑒別與診斷具有一定的實(shí)用性及良好的應(yīng)用前景。

多重PCR技術(shù)應(yīng)用于布魯菌的種型分析的方法研究已日漸完善，除了新發(fā)現(xiàn)的兩個布魯菌種，其他都可以鑒別出，Bruce ladder用于鑒別布魯菌亞種的方法也已經(jīng)被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)手冊收錄。近幾年研究者們更熱衷于將多重PCR技術(shù)應(yīng)用于同時檢測不同病原的研究。

4　熒光PCR技術(shù)

實(shí)時熒光PCR技術(shù)最初是由美國ABI公司研制出的，并在最近幾年得到發(fā)展。2001年，Redkar等[14]將熒光PCR應(yīng)用于布魯菌檢測并在物種水平上分出牛種、羊種和豬1型布魯菌，他們借鑒AMOS PCR的原理，利用插入序列IS711在布魯菌不同種之間的多態(tài)性構(gòu)建共用上游引物及種特異性下游引物。之后Piranfar等[5]將Redkar文章中報(bào)道的羊種引物及探針用于熒光PCR并與傳統(tǒng)PCR進(jìn)行對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熒光PCR檢測樣品DNA的靈敏度明顯高于傳統(tǒng)PCR。這些研究中應(yīng)用于熒光PCR的染料多是探針類染料，其他還有熒光類染料作為熒光PCR的熒光信號。但曾有研究報(bào)道，將熒光PCR水解型探針和熒光染料進(jìn)行對比，結(jié)果顯示應(yīng)用水解型探針的熒光PCR實(shí)驗(yàn)特異性更好。

實(shí)時熒光PCR技術(shù)因其操作更簡單、快速、靈敏度及特異度更高等特點(diǎn)，更適于布魯菌病的檢測。而且，這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)易于標(biāo)準(zhǔn)化，且對實(shí)驗(yàn)室工作人員的感染風(fēng)險(xiǎn)極低。據(jù)報(bào)道，將熒光PCR技術(shù)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(IELISA)、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(CELISA)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)分別用于血液、組織等臨床標(biāo)本的檢測，結(jié)果證實(shí)熒光PCR檢測技術(shù)最靈敏。Probert等[15]還將熒光定量PCR應(yīng)用于人患布魯菌病的診斷治療和愈后跟蹤調(diào)查，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法對人體內(nèi)布魯菌菌量的變化是一種有效可信的檢測方法。在進(jìn)行布魯菌病的防控過程中，區(qū)分出疫苗株與野毒株感染也是預(yù)防疾病傳染的有效手段。Kaynak-Onurdag等[16]建立了一種用于區(qū)分布魯菌疫苗株與野毒株的熒光定量PCR方法，用于有效地區(qū)分疫苗株與野毒株感染。

也有研究建立了一種鑒別豬種布魯菌的熒光定量PCR方法，并報(bào)道是檢測布魯菌樣品的熒光定量PCR方法中靈敏度最高的[17]。Sidor等[18]也將William等設(shè)計(jì)的布魯菌屬特異性引物及探針應(yīng)用于組織、血液等臨床標(biāo)本的布魯菌檢測，并加入了用于質(zhì)量控制的兩種內(nèi)參基因，組成了多重?zé)晒舛縋CR檢測布魯菌屬的試驗(yàn)方法。該試驗(yàn)方法可以監(jiān)控組織樣品中DNA是否提取成功及提取的DNA產(chǎn)物的質(zhì)量，從而保證了后續(xù)熒光PCR方法檢測結(jié)果的有效性。也有研究報(bào)道表明，將熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于布魯菌病、鉤端螺旋體和胎兒彎曲桿菌的檢測，該實(shí)驗(yàn)建立了一種多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，在1個反應(yīng)體系中可同時檢測出3種疾病[19]，充分顯示了熒光定量PCR方法的高特異度及高靈敏度。而特異性好，靈敏度高的實(shí)時熒光PCR技術(shù)在應(yīng)用于人布魯菌病診斷方面具有很大的前景，它的實(shí)時定量功能可以在治療過程中追蹤患者的病情變化，也可以用于復(fù)發(fā)診斷。

近兩年來，依據(jù)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)建立的高分辨率熔點(diǎn)曲線分析法，用于檢測布魯菌和基因分型是科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。如Gopaul等[20]建立的高分辨率熔點(diǎn)曲線分析法，可將布魯菌各經(jīng)典種與其他種屬細(xì)菌分辨開。之后 Mohamed Zahidi等[21]也根據(jù)SNP位點(diǎn)建立的高分辨熔點(diǎn)曲線分析法用于布魯菌亞種之間的分析，并在41株樣品的檢測中得到40株為羊種布魯菌，1株為豬種布魯菌。高分辨率溶解曲線是一種新型的基因分析技術(shù)，具有極高的敏感度和準(zhǔn)確度，并且這種技術(shù)速度快、成本低、通量高，且不受檢測位點(diǎn)的局限，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。在基因的分型、SNP分析、突變掃描、序列匹配等方面，高分辨熔解曲線分析技術(shù)發(fā)揮著重要作用。

與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR技術(shù)因其更高的特異度、靈敏度，耗時短，不需要進(jìn)行電泳分析，避免了DNA污染等優(yōu)點(diǎn)，更適用于人類布魯菌病的檢測工作。而且PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)本身比其他血清學(xué)或細(xì)菌分離培養(yǎng)等檢驗(yàn)方法更簡單安全，靈敏且高效。所以熒光定量PCR檢測技術(shù)用于人布魯菌病的檢測更受人們期待。

5　其他PCR方法

應(yīng)用于布魯菌檢測研究的PCR方法,除了標(biāo)準(zhǔn)PCR方法及其衍生物多重PCR方法和熒光定量PCR方法外，還有其他各種基于PCR的檢測方法。如用BCSP31和IS711兩種特異性基因建立半巢氏PCR,并通過對人全血的布魯菌檢測評價該方法的檢測性能。也曾有報(bào)道利用IS711屬特異性基因設(shè)計(jì)兩對套嵌式引物，構(gòu)建了巢氏PCR方法并應(yīng)用于人患布魯菌病的檢測，增加了檢測的靈敏性和特異性。巢氏、半巢氏PCR方法的建立，在一定程度上提高了PCR檢測的靈敏度和特異度。

用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)方法建立種系關(guān)系進(jìn)化樹，此方法可以用于流行病學(xué)的追蹤調(diào)查及確定分離株的親緣關(guān)系。2015年有報(bào)道過，用16位點(diǎn)的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)方法將布魯菌進(jìn)行基因分型，并建立了一定的進(jìn)化樹分析[22]。之后又有報(bào)道，從人或動物體內(nèi)分離出了布魯菌，通過進(jìn)化樹關(guān)系分析，人感染的多為人獸共患的菌株，我國多個地區(qū)也通過MLVA方法分析出本地區(qū)布魯菌來源及地區(qū)之間的進(jìn)化關(guān)系[23-24]。在我國，Jiang等[25]用MLVA檢測方法從人體中分離鑒定出了羊種1、2、3型，之后他們又從人和動物中分離出羊種、牛種布菌及豬種S2疫苗株，并指出應(yīng)用豬種S2疫苗對動物和人類都存在較大的感染風(fēng)險(xiǎn)。另外，隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA的PCR技術(shù)(RAPD)是利用不同的隨機(jī)排列堿基順序的短寡聚核苷酸單鏈為引物,對靶DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行多態(tài)性分析。RAPD技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究上。

中國布魯菌病的日益嚴(yán)重，使得對其防控與診斷技術(shù)的要求越來越高。而防控技術(shù)屬國家層面的政策支持，布魯菌病診斷技術(shù)的重要性也就尤為突出。大量的報(bào)道結(jié)果已經(jīng)證明，PCR技術(shù)用于布魯菌的檢測具有很好的利用價值，而且PCR方法已應(yīng)用于人類布魯菌病的檢測研究，它表現(xiàn)出的高效、安全、靈敏度高、特異度好等優(yōu)點(diǎn)將是用于臨床檢測的有利因素，也可以作為細(xì)菌分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測方法的補(bǔ)充診斷。但是，作為一種正處在開發(fā)試用階段的新型檢測方法,PCR并沒有一個標(biāo)準(zhǔn)的檢測方案,而且DNA的質(zhì)量、PCR反應(yīng)管、反應(yīng)試劑的質(zhì)量等都會影響檢測結(jié)果的有效性。因此，標(biāo)準(zhǔn)陰陽性樣品的建立或內(nèi)(外)源性內(nèi)參基因的設(shè)計(jì)等都要應(yīng)用于PCR檢測方法中，來提高檢測方法的可靠性。

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重慶市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(2012-2-383)。作者簡介：姜海蓉(1970-)，講師，碩士，主要從事疫苗與診斷技術(shù)研究?！?/p>

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