久瀉寧顆粒治療大鼠慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎的實驗研究*

馬少丹，趙紅霞，程遠棚，苑述剛，邱美榕，阮時寶

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122;2.中國中醫(yī)科學(xué)研究院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

久瀉寧顆粒治療大鼠慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎的實驗研究*

馬少丹1，趙紅霞2△，程遠棚1，苑述剛1，邱美榕1，阮時寶1

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122;2.中國中醫(yī)科學(xué)研究院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

目的:研究久瀉寧顆粒對慢性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的治療作用并探討其可能的作用機制。方法:以2，4-二硝基氯苯和異種異體抗原乳化液聯(lián)合應(yīng)用建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型后，連續(xù)給藥14 d，腹主動脈采血測定血清 IL-2、TNF-α、免疫球蛋白IgG、IgM以及SOD、MDA，同時截取結(jié)腸潰瘍明顯處做病理分析。結(jié)果:UC模型組與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，血清TNF-α、IgG、IgM水平明顯升高，IL-2水平明顯降低。與模型組比較，久瀉寧顆粒組TNF-α、IgG、IgM、MDA水平降低，IL-2、SOD水平升高。結(jié)論:久瀉寧顆粒能明顯調(diào)節(jié)UC大鼠機體免疫功能異常，對UC模型大鼠結(jié)腸潰瘍面有較好的修復(fù)作用。

久瀉寧顆粒;潰瘍性結(jié)腸炎;異種異體免疫;藥效

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因尚不明確的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病。其病程持續(xù)緩慢發(fā)展，發(fā)病期和緩解期交替發(fā)作，癥狀時好時壞，部分患者甚至持續(xù)加重［1］，可發(fā)生于任何年齡［2］。UC目前尚無徹底根治的方法且復(fù)發(fā)率高，臨床治療以緩解癥狀為主。多數(shù)專家認為，免疫因素在潰瘍性結(jié)腸炎的病因中發(fā)揮著重要作用，因此可通過調(diào)節(jié)腸黏膜免疫功能達到治療目的。

久瀉寧顆粒的配方是原福建中醫(yī)學(xué)院院長、全國著名中醫(yī)藥專家俞長榮教授治療慢性泄瀉的經(jīng)驗方，由參苓白術(shù)散與痛瀉要方以健脾滲濕、調(diào)氣止瀉為治法化裁而來，臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎屬于脾虛氣滯濕阻證見久瀉不愈者療效頗佳。本實驗通過異體免疫致大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型試驗，研究久瀉寧顆粒治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

多功能酶標儀 INFINITE M200Pro(TECAN公司);RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); TDL-4型低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠); DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);85-2磁力攪拌器(常州國華電器有限公司);小型臺式離心機(Eppendorf centrifuge5418);DZF數(shù)顯真空干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 藥品與試劑

久瀉寧顆粒(自行制備);補脾益腸丸(廣州陳李濟藥廠有限公司提供，批號 FJ243);柳氮磺胺吡啶片(上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司，批號H31020557);2，4-二硝基氯苯(天津市光復(fù)精細化工研究所，批號20081028);β-環(huán)糊精(簡稱 β-CD，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號69009360);弗氏完全佐劑(美國Sigma公司，批號 CAS 9007-81-2);總蛋白試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號lot 20T00150);SOD(批號20130724)、MDA (批號20130726)、IgG(批號20130702B)、IgM(批號20130702B)、TNF-α(批號20130702B)、IL-2(批號20130702B)均為南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

清潔級SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供(許可證號SCXK(滬)2012-0002)。實驗動物在福建中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)和管理(環(huán)境設(shè)施合格證書SYXK(閩)2009-0001)。

1.4 藥物與制備

1.4.1 受試藥物 久瀉寧顆粒嚴格按照制備工藝制作，實驗用藥為顆粒劑成型前的濃縮液。方中黨參、白術(shù)等藥材購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂中藥房，經(jīng)藥學(xué)院車蘇容副教授鑒定，符合 2010版《中國藥典》各藥材項下標準。

1.4.2 藥物制備 取黨參、野麻草、荷葉等6味藥材加入8倍量水浸泡60 min，煎煮3次，每次煎煮1 h，合并 3次提取液過濾，濾液濃縮后水提醇沉［3］。取砂仁、白術(shù)等 3味藥材加 5倍水煎煮 7 h［4］，水提醇沉后濃縮，揮發(fā)油包合［5］，并按照工藝要求制成顆粒劑成型前的濃縮液。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗動物分組 清潔級SD大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，分層按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、UC模型對照組、UC模型+補脾益腸丸或柳氮磺胺吡啶片陽性對照組、UC模型+久瀉寧顆粒高劑量組、中劑量組和低劑量組7組各10只。

1.5.2 模型制備 ①造模所需異種異體抗原及灌腸液的制備:異種異體抗原按照本課題組方法［6］稍作改進，取家兔新鮮結(jié)腸黏膜組織，以 PBS為介質(zhì)充分勻漿后，－20℃條件下冷凍24 h后取出溶凍，并以4000 r/min速度離心30 min，取上清液用總蛋白試劑盒雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量?？乖榛?異種異體抗原與弗氏完全佐劑等體積配比。灌腸液:2，4-二硝基氯苯與無水乙醇等體積配比，濃度為2.5%(w/v);②異體免疫誘發(fā)法模型制備［7］:在大鼠左側(cè)前后足趾皮下注射抗原乳化液，使大鼠獲得8 mg異種蛋白。14 d后，在大鼠腹股溝部位皮下注射抗原乳化液，同樣使大鼠獲得8 mg異種蛋白。大鼠免疫刺激40 d后，用硅膠管插入大鼠肛門深約8 cm，局部灌腸1 mL灌腸液。拔出硅膠管后迅速捏緊大鼠肛門8 min，其間不斷搖擺大鼠使灌腸液在腸道中分布均勻。待灌腸液不再從肛門流出，把大鼠放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5.3 給藥方法 正常組和 UC模型對照組給予等量生理鹽水，各給藥組分別給予久瀉寧顆粒高劑量26.8 g/kg、中劑量13.4 g/kg(相當于60 kg人的等效劑量147 g/d)、低劑量6.7g/kg(以上濃度均為生藥含量)。補脾益腸丸1.65 g/kg(相當于60 kg人的等效劑量)、柳氮磺胺吡啶片組 0.25 g/kg (相當于60 kg人的等效劑量)，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。

1.5.4 標本采集及處理 大鼠灌胃給藥第14天后，禁食不禁水24 h，第21天用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血以3000 r/min離心10 min，分離血清，冰凍保存待測。取大鼠結(jié)腸平鋪于冰塊上進行大體形態(tài)學(xué)損傷評分，取結(jié)腸潰瘍明顯處做病理分析。

1.5.5 檢測指標與方法 白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、免疫球蛋白 IgG、IgM測定采用ELISA法，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定采用羥胺法，丙二醛(MDA)測定采用TBA法，總蛋白測定采用雙縮脲法。

1.5.6 UC大鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)損傷評定標準［8］大鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)損傷按照程度輕重進行評分:若無潰瘍、無炎癥為0分;若無潰瘍但局部充血為1分;若潰瘍形成且不伴充血為2分;有1處潰瘍伴炎癥為3分;多處潰瘍伴炎癥為4分;若潰瘍超過2 cm為5分;若潰瘍超過2 cm且病變每超過1 cm加1分則為6～10分。

1.5.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 久瀉寧顆粒對 UC模型大鼠檢測指標的影響

表1顯示，UC模型組與正常對照組比較，IL-2、SOD降低與TNF-α、IgG、IgM、MDA、損傷指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與 UC模型組比較，中藥對照組可明顯升高IL-2，降低MDA水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);可降低 TNF-α、損傷指數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);西藥對照組可明顯升高IL-2、SOD，降低TNF-α、IgG、MDA、損傷指數(shù)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);可降低IgM水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);久瀉寧顆粒中劑量組可明顯升高IL-2、SOD，降低MDA、損傷指數(shù)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);可降低 IgG、IgM水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);久瀉寧顆粒高劑量組可明顯降低MDA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，可升高IL-2，降低TNF-α，損傷指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與陽性對照組比較，久瀉寧高劑量組可明顯降低MDA水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 久瀉寧顆粒對UC模型大鼠檢測指標的影響(±s)

表1 久瀉寧顆粒對UC模型大鼠檢測指標的影響(±s)

注:a與空白對照組比較:#P＜0.01，##P＜0.05;b與 UC模型組比較:*P＜0.01，＊＊P＜0.05;c與中藥對照組比較:ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.05;d與西藥對照組比較:☆P＜0.01，☆☆P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) IL-2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IgG(mg/mL) IgM(mg/mL) SOD(U/mg) MDA(nmol/mL)損傷指數(shù)正常對照組 10 10.58±0.62 7.79±0.98 16.83±1.08 10.23±0.70 98.58± 3.32 5.55±0.13 0 UC模型組 9 8.89±0.73# 9.05±1.13# 18.60±1.05# 12.13±1.38# 78.24± 2.74# 6.60±0.21# 3.56±1.13#中藥對照組 8 1.65 9.73±0.43#* 8.15±0.55＊＊ 17.39±0.83＊＊ 10.95±0.52 79.12±15.08## 5.02±0.42#* 2.63±0.74#＊＊西藥對照組 9 0.25 10.23±0.65* 7.97±0.31* 16.91±0.80* 10.78±0.59＊＊ 92.94± 4.78#* 4.47±0.14#* 2.33±0.87#*低 劑 量 組 8 6.70 9.25±0.83# 8.61±0.68## 18.17±0.86# 11.10±0.90## 79.97± 3.73# 6.43±0.16# 3.11±0.78#中 劑 量 組 9 13.40 9.62±0.84* 8.38±0.83 17.45±1.31＊＊ 10.59±0.62＊＊ 91.38± 3.54##* 4.72±0.38#* 2.11±0.93#*高 劑 量 組 9 26.80 9.34±0.74＊＊ 8.21±0.68＊＊ 17.69±0.69 10.99±0.50 81.60± 3.52# 5.35±0.28##*ΔΔ☆☆2.50±0.93#＊＊

2.2 久瀉寧顆粒對UC模型大鼠結(jié)腸組織的影響

光鏡下病理切片觀察，正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚;UC模型組大鼠結(jié)腸黏膜脫落，潰瘍面積大，潰瘍點較多;陽性對照組均可見一層上皮組織蓋住潰瘍;久瀉寧低劑量組可見兩邊上皮組織向中間愈合趨勢;久瀉寧中劑量組上皮組織基本完整，腺體排列欠規(guī)則，潰瘍大部分基本愈合;久瀉寧高劑量組上皮組織基本完整，腺體排列較規(guī)則，潰瘍大部分基本愈合。

3 討論

中醫(yī)學(xué)尚無結(jié)腸炎病名，根據(jù)其臨床證候特點屬于“泄瀉”“痢疾”等范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有關(guān)于洞泄、飧泄等記載。中華中醫(yī)藥學(xué)會在《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南·西醫(yī)疾病部分》中，將本病分為大腸濕熱、脾氣虛弱、脾腎陽虛、肝郁脾虛、寒熱錯雜、熱毒熾盛6個證型［9］。脾虛濕盛是形成本病的重要病機，故益氣健脾、除濕止瀉為本病的常見治法之一。

本實驗采用異體免疫誘發(fā)法制備動物模型，因多數(shù)專家認為免疫因素在潰瘍性結(jié)腸炎的致病因素中發(fā)揮著重要作用，潰瘍性結(jié)腸炎的臨床和病理表現(xiàn)均可觀察到腸黏膜的免疫功能異常。近年來，以免疫方法制備潰瘍性結(jié)腸炎動物模型亦被多數(shù)專家認可。由于大鼠對局部免疫損傷有較強的修復(fù)能力，單純的體液或細胞免疫反應(yīng)異常不足以反映人類UC的病變過程。本實驗免疫誘導(dǎo)法所致的潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，采用異種異體結(jié)腸黏膜組織致敏法，并加局部刺激造模。實驗中模型組大鼠的血清IL-2、TNF-α、免疫球蛋白 IgG、IgM以及 SOD、MDA等免疫和炎癥指標較正常組都發(fā)生明顯變化，說明造模成功。

IL-2主要由CD4+T1細胞產(chǎn)生，可引起T細胞的增殖分化，而T細胞的活化又可抑制整個特異性免疫應(yīng)答［10］。經(jīng)免疫法導(dǎo)致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究發(fā)現(xiàn)［11］，UC大鼠模型組血清中 IL-2活性明顯低于空白對照組，治療后血清中IL-2活性升高。本實驗研究數(shù)據(jù)亦證明了這一點。

腫瘤壞死因子(TNF)能殺傷和抑制腫瘤細胞，參與某些自身免疫病的病理損傷，同時又是腸道上皮細胞增殖和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子［12-13］。久瀉寧顆粒可抑制TNF-α的產(chǎn)生，從而減少特異性或非特異性炎癥分子的釋放，緩解腸道免疫破壞作用。

在胃腸道疾病中，當免疫復(fù)合物IgG大量增多或沉淀在有病損器官中時，會給機體帶來不良影響，造成局部腸黏膜損傷，同時潰瘍性結(jié)腸炎患者在腸黏膜受到炎癥侵犯時產(chǎn)生IgM。實驗大鼠經(jīng)久瀉寧顆粒治療后，其血清IgG和IgM明顯下降，提示久瀉寧顆粒可改善機體體液免疫功能，減輕腸道組織損傷，緩解UC癥狀。

氧自由基是促進炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，在UC模型中，腸組織中的MDA、損傷指數(shù)及在TNBS/乙醇灌腸后與對照組比較均有明顯升高，腸組織中的SOD明顯下降［14］。本實驗數(shù)據(jù)顯示，久瀉寧顆?？擅黠@降低MDA水平，升高SOD水平。

從藥效學(xué)實驗數(shù)據(jù)可以看出，久瀉寧顆粒中劑量組的總體療效較高、低劑量組要好，說明藥物劑量與療效的關(guān)系一般不是簡單的正比關(guān)系，而是類似拋物線的關(guān)系，劑量過小沒有療效，劑量過大反而起抑制作用，這為臨床用藥劑量的確定提供了客觀實驗依據(jù)。

本實驗從調(diào)節(jié)機體免疫功能著手，研究久瀉寧顆粒治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機理，發(fā)現(xiàn)久瀉寧顆粒對UC模型大鼠免疫功能的異?？蓮亩喹h(huán)節(jié)進行調(diào)節(jié)。但本文僅從整體的免疫學(xué)水平進行觀察，有待于今后從血清藥理及分子水平作進一步的研究。

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2015-07-10

福建省科技廳社會發(fā)展重點項目(2012Y0040)

馬少丹(1974-)，女，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事方劑配伍與臨床運用研究。

△通訊作者:趙紅霞(1970-)，女，副研究員，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論、方劑學(xué)及疑難病臨床與研究，Tel:64089033，E-mail:zhaohongxia7000@163.com。